Les principales maladies neurodégénératives humaines, qui reposent toutes sur des mécanismes de type prion (auto-propagation d’agrégats protéiques pathogéniques), représentent un risque sociétal majeur avec une augmentation de leur prévalence directement corrélée avec l’augmentation de la longévité de la population mondiale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif ni aucun modèle expérimental suffisamment pertinent pour ces maladies.L'objectif de ce travail a été d'utiliser le potentiel des mini-cerveaux humains comme modèle in vitro auto-assemblé en trois dimensions (3D) capable de restituer la complexité du cortex cérébral et d’étudier les mécanismes de type prion en développant une méthodologie de validation basée sur la microscopie 3D. Ces nouvelles structures 3D qui peuvent être obtenues à partir de cellules adultes reprogrammées de patients en cellules souches pluripotentes induites (iPSC), offrent des possibilités uniques pour accéder, observer et perturber les processus biologiques dans le cerveau humain sans les biais ni les complications des modèles animaux ou des échantillons de cerveau humain ex vivo. Ce modèle permet notamment d’observer l’apparition d’agrégats d’Aß et de Tau phosphorylée, deux protéines qui s’accumulent et se propagent de cellule en cellule dans la maladie d’Alzheimer.Nous avons été en mesure de rendre le modèle des mini-cerveaux compatible avec une future approche de criblage de molécules thérapeutiques en modifiant la méthodologie de différenciation pour augmenter leur rendement de production. D’autre part, nous avons pu tester différentes modalités de modélisation pour la Maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la Démence Fronto-Temporale et la maladie de Creutzfeldt-Jakob : à l’aide de molécules d’induction chimique, à l’aide de cellules issues de patients, par modification génétique et par mise en contact de matériel infectieux. Ces différentes approches nous ont permis d’établir que le modèle d’organoïde cérébral permet de reproduire des aspects-clés retrouvés dans l’apparition de la pathologie chez les patients. Pour compenser l’hétérogénéité de notre modèle, nous avons réalisé une analyse in toto par imagerie, c’est-à-dire dans sa totalité sans coupes préalables. La modalité retenue pour cette acquisition est la microscopie à feuillet de lumière utilisée après marquage et clarification des mini-cerveaux. Pour ce faire, nous avons évalué et développé différentes stratégies en vue d’obtenir une plateforme d’analyse à haut contenu pour nos organoïdes cérébraux.Cette plateforme centrée autour de l’organoïde cérébral, sous-tendue par l’analyse en microscopie 3D, a été développée dans le cadre du projet « Investissements d’Avenir » 3DNeuroSecure. Ce projet a pour ambition d’apporter des solutions de calcul haute performance au domaine de la biologie, notamment avec la possibilité de traiter des informations de très grand volume, dit « exascale », telles que celles que nous obtenons avec la microscopie 3D. Le développement de cet aspect nous permettrait à terme de pouvoir établir les bases d’un outil de criblage thérapeutique par les organoïdes cérébraux pour les maladies neurodégénératives. Nous avons démontré que les mécanismes de type prion pouvaient être étudiés dans ce modèle de mini-cerveaux humains et de multiples voies de recherche fondamentale et appliquée sont désormais possibles. A plus long terme, une telle plateforme pourrait accueillir tout type d’organoïdes pour modéliser l’ensemble du corps humain et s’inscrire comme un compagnon biologique dans le cadre des futurs développements de la médecine personnalisée. / Human neurodegenerative diseases, which are all based on prion-like mechanisms (self-propagation of pathogenic protein aggregates), represent a major societal risk with the increase of their prevalence directly correlated to the increasing longevity of the world population. There is to date neither any cure nor any pertinent experimental model for their study.The objective of this work was to use the potential of human mini-brains, a self-assembled three-dimensional in vitro model able to restitute the complexity of the cerebral cortex. This model will allow us to study prion-like mechanism by developing a validation methodology based on 3D microscopy. These novel 3D structures can be obtained from reprogrammed adult cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and offer unique possibilities to access, observe and disrupt biological processes in the human brain without bias nor complications as in animal models and ex vivo human brain samples. This model makes it possible to observe the development of aggregates of Aβ and hyper-phosphorylated Tau, two proteins that accumulate and propagate from cell to cell during Alzheimer’s disease.We have been to able to adapt the cerebral organoid model for a future screening approach by modifying the differentiation methodology to enhance its production ratio. We also have been able to test different modalities for disease modeling for Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Fronto-Temporal Dementia and Creutzfeldt-Jakob disease: with chemical induction, with patient specific cells, through genetic modification and through contact with infectious material. These different approaches allowed us to validate that the cerebral organoid can indeed reproduce key aspects found during pathological development within patients. To compensate for the heterogeneity of the cerebral organoid, we performed an in toto analysis through microscopy, meaning in its totality without prior slicing. The chosen method of acquisition is fluorescence light-sheet microscopy used after staining and optical clearing of cerebral organoids. To do so, we have evaluated and established different strategies in order to obtain a high content screening platform for our cerebral organoid model.This platform centered around the cerebral organoid model, underpinned by 3D microscopy analysis, was developed during the “Investissements d’Avenir” project 3DNeuroSecure. This project has for ambition to bring high performance computing to the biological sciences, notably with the possibility to deal with large scale data, also called “exascale”, like the ones obtained with 3D microscopy. The development of this aspect would allow us to establish the basis for a therapeutic screening tool based on cerebral organoids for neurodegenerative diseases. We have demonstrated that prion-like mechanisms can be studied in a human mini-brain model and multiple research avenues are now opened for both fundamental and applied research. This platform could in turn become the basis for any kind of organoids derived from patients to model the whole human body and become a biological companion for personalized medicine.

Les mutations somatiques sur le variant d’histone H3.3 et les régulateurs épigénétiques associés à H3.3 ont été identifiés dans 30 % des glioblastomes pédiatriques. Ces mutations sont caractérisées par des substitutions d'acides aminés à des positions spécifiques dans la région N-terminale de l'histone H3.3 telles que la glycine 34 en valine/arginine (G34V/R), l'alanine 29 en proline (A29P), ou une haplo-insuffisance de la protéine Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 est un co-répresseur de la transcription qui se lie spécifiquement à H3.3K36me3 pour moduler l'activité de l'ARN polymérase II. De plus, il est intéressant de mentionner que l’interaction entre ZMYND11 et H3.3K36me3 est altérée lorsque le résidu G34 est muté en G34V. Récemment, les mutations germinales H3.3G34V, H3.3A29P et ZMYND11 ont été identifiées chez des patients présentant une déficience neurologique. Nous émettons l'hypothèse que les mutants H3.3G34V et H3.3A29P empêchent ZMYND11 de se lier à H3.3K36me3 et pourrait converger mécaniquement avec la perte de fonction de ZMYND11, ce qui perturberait la neurogenèse. À l'aide de la technologie CRISPR Cas9, nous avons généré des modèles mutants isogéniques à partir de cellules souches pluripotentes (iPSC) pour H3F3B-A29P, H3F3B-G34V et ZMYND11-knock-out (KO). Par la suite, nous avons stimulé la différenciation de ces modèles vers des lignées neuronales afin d’identifier si ces mutations affectent la neurogenèse. Enfin, en utilisant des méthodes de séquençage à haut-débit nous avons analysé le profil épigénomique et transcriptomique pour déterminer comment l’interaction entre ZMYND11 et H3K36me3 est perturbée et à quels degrés ces mutations impactent sur les modifications post-traductionnelles des histones. Ce projet permettra de mieux comprendre les fonctions de ZMYND11 sur le remodelage de la chromatine et sa fonction biologique au cours du développement cérébral. / Somatic mutations on the histone 3 variant H3.3 and H3.3-associated chromatin modifiers have been identified in 30% of pediatric high-grade gliomas (pHGG). The mutations are characterized by amino acid substitutions at specific positions within the histone H3.3 tail such as glycine 34 to valine/arginine (G34V/R), alanine 29 to proline (A29P), or haploinsufficiency of the chromatin reader Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 is a transcriptional co-repressor that specifically reads H3.3K36me3 to modulate RNA polymerase II activity. Notably, binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 is altered when G34 residue is mutated to G34V. Recently, germline mutations of H3.3G34V, H3.3A29P, and ZMYND11 have been identified in patients with Intellectual disability. We hypothesize that H3.3 G34V and H3.3A29P mutants impede the binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 and may mechanistically converge with ZMYND11 loss-of-function mutation to perturb neurogenesis. Using CRISPR Cas9-mediated gene editing, we will generate isogenic human induced pluripotent stem cell (iPSC) models for H3F3B-A29P, H3F3B-G34V and ZMYND11-KO, and perform in vitro neural differentiation to identify whether specific neural lineages are affected. Next, using epigenomic and transcriptomic profiling we will study whether binding between ZMYND11 and H3K36me3 is disrupted, and the downstream impact on Post-Translational Modifications of histones (PTMs) and transcription. This project will lead to a better understanding of the crucial role of the chromatin reader ZMYND11 on chromatin remodeling and the biological function during neural development.

Les mécanismes de type prion sont désormais reconnus comme sous-tendant la plupart des maladies neurodégénératives humaines, avec en premier lieu la maladie d’Alzheimer (MA) au niveau de ses 2 marqueurs spécifiques, l’amyloïde β (Aβ à l’origine de l’hypothèse étiopathogénique de la cascade amyloïde) et la protéine Tau phosphorylée. Par ailleurs la protéine du prion (PrPC) est décrite comme interagissant à de multiples niveaux avec le métabolisme de l’Aβ sans que les mécanismes physiopathologiques sous-jacents n’aient pu être expliqués. Pour sortir de l’impasse actuelle concernant le développement d’approches thérapeutiques efficaces pour la MA, l’industrie pharmaceutique a besoin de modèles expérimentaux innovants. En effet, à ce jour aucun modèle in vivo, en dépit des progrès réalisés avec les souris transgéniques, n’arrive à refléter la complexité cérébrale humaine ni à mimer une MA clinique. Les cultures in vitro en 2D sont quant à elles très éloignées des situations conduisant à l’accumulation d’agrégats protéiques pathologiques. Le but de notre thèse a été d’utiliser dans le domaine des neurosciences les nouvelles perspectives de recherche ouvertes par les technologies des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) en développant un modèle de différentiation en 3D pour obtenir des organoïdes cérébraux humains (OC) (mini cerveaux). Leur capacité d’auto-organisation en 3D de tissu neuroectodermique nous a permis de recréer un système complexe mimant différentes structures cérébrales humaines dans lesquelles nous avons pu caractériser les marqueurs attendus. L’étude de l’expression des protéines d’intérêt APP et PrPC pendant la différentiation neurale a permis de caractériser la modulation des niveaux des deux protéines en fonction du temps de culture. Afin d’orienter le modèle vers des mécanismes d’accumulation protéique de type MA, nous avons testé différents inducteurs chimiques dont l’Aftin-5 qui est capable de moduler les voies post-traductionnelles de l’APP. Plusieurs stratégies de traitement ont été adoptées pour induire le clivage de l’APP et la génération d’Aβ. La production des fragments solubles Aβ38, Aβ40, Aβ42 a été mise en évidence par ELISA. Les niveaux générés sont reproductibles et l’augmentation du ratio Aβ42/Aβ40 est cohérente avec les données extrapolées des modèles murins et humains, ce qui a permis de valider notre modèle. Les niveaux d’expression génique et protéique de PrPC et de APP suite au traitement ont été analysés afin de mieux déterminer le rôle de l’interaction entre ces deux facteurs. L’objectif à long terme consiste à améliorer ce modèle, dont les limites actuelles sont notamment l’absence de vascularisation et le niveau de maturation du tissu neural. Le défi majeur dans le cadre de la culture des OC consiste donc à favoriser l’intégration du système vasculaire, et par ailleurs à accélérer le vieillissement in vitro pour l’étude de maladies neurodégénératives. La perspective de pouvoir automatiser le système de culture des OC permet d’envisager l’utilisation de ce modèle à plus grande échelle dans le cadre de test de cytotoxicité et/ou de criblage pharmacologique à haut débit pour identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour la MA. / Prion-like mechanisms are known to underlie most of human neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD), which is characterized by two important pathological markers, β amyloid (or Aβ at the origin of the etiopathogenic amyloid cascade hypothesis) and phosphorylated tau protein. Furthermore, the prion protein (PrPC) interacts at multiple levels with the metabolism of Aβ, by mechanisms which are not well understood. To overcome the current limits in the development of efficient strategies to treat AD, the pharmaceutical industry requires innovative experimental models. However, even if a lot of progress has been achieved by using transgenic mouse models, to date no in vivo model can reflect the complexity of human brain or reproduce a clinical context. 2D in vitro cell culture models are unable to allow the aggregation and accumulation of pathological proteins as observed in vivo. The aim of this study consists in taking advantage of the research prospects offered by induced pluripotent stem cell (iPSCs) in the field of neurosciences. iPSCs can be used to generate 3D models of differentiation also called human cerebral organoids or mini-brains (MBs). Their ability to self-organise in 3D neuroectodermic tissue leds to a complex system that mimics different human cerebral structures in which we were able to characterize the expected markers. The study of the two proteins of interest (APP and PrPC) during neural differentiation has allowed us to follow the modulation of protein expression level occurring during the in vitro development of the human MBs. In order to use this model to reproduce the protein accumulation mechanisms seen in AD, we have tested chemical inductors such as Aftin-5 in order to modulate the APP post-transcriptional pathway towards a pathological outcome. Many strategies of treatment are adopted to lead APP cleavage and Aβ generation. The production of soluble fragments Aβ38, Aβ40, Aβ42 in the supernatant of organoids has been showed using ELISA technique. The levels generated are reproducible and the increase of Aβ42/Aβ40 ratio is consistent with extrapolated data from mouse and human models thus validating our model. Analysis at the gene and protein level has been assessed in order to understand the interaction between PrPC and APP after treatment. The long-term goal consists in improving this model which is notably hampered by the absence of vascularization and the low level of maturation of the neural tissue. The main challenge in MB culture thus consists in the integration of the vascular system, and also in increasing the speed of ageing process in vitro for the study of neurodegenerative diseases. In the long term, the prospect of automating the culture of MBs would allow the use of the system for cytotoxicity testing and/or high throughput screening for the discovery of new drugs for AD.