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Salmonella enteritidis de origem aviária: determinação de padrões de resistência antimicrobiana, detecção de mutação no gene gyrA de cepas resistentes ao ácido nalidíxico, fagotipagem e ribotipagem

Ribeiro, Aldemir Reginato January 2007 (has links)
Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.
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Salmonella enteritidis de origem aviária: determinação de padrões de resistência antimicrobiana, detecção de mutação no gene gyrA de cepas resistentes ao ácido nalidíxico, fagotipagem e ribotipagem

Ribeiro, Aldemir Reginato January 2007 (has links)
Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.
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Salmonella enteritidis de origem aviária: determinação de padrões de resistência antimicrobiana, detecção de mutação no gene gyrA de cepas resistentes ao ácido nalidíxico, fagotipagem e ribotipagem

Ribeiro, Aldemir Reginato January 2007 (has links)
Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.
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Composição química e avaliação do potencial antimicrobiano dos óleos essencias de Ruellia asperulla (Mart. ex ness) Lindau e Ruellia paniculata L. (Acanthaceae) / Chemical composition and evaluation of antimicrobial potential of oils of Ruellia asperulla (Mart. ex ness) Lindau e Ruellia paniculata L. (Acanthaceae)

Vasconcelos, Ariana Azevedo January 2014 (has links)
VASCONCELOS, A. A. Composição química e avaliação do potencial antimicrobiano dos óleos essencias de Ruellia asperulla (Mart. ex ness) Lindau e Ruellia paniculata L. (Acanthaceae). 2014. 88 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, 2014. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-08T13:42:11Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_aavasconcelos 2014.pdf: 1899253 bytes, checksum: 4e04eb0cbe03e2e57e7e16fc8d3fb930 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-08T13:46:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_aavasconcelos 2014.pdf: 1899253 bytes, checksum: 4e04eb0cbe03e2e57e7e16fc8d3fb930 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-08T13:46:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_aavasconcelos 2014.pdf: 1899253 bytes, checksum: 4e04eb0cbe03e2e57e7e16fc8d3fb930 (MD5) Previous issue date: 2014 / The genus Ruellia L. comprises about 300 species, which are broadly distributed in tropical and subtropical regions of the planet. Among the species that comprise the genus, are Ruellia asperula and Ruellia paniculata, known popularly as "Melosa" and "Melosa-purple". Phytochemical research and antimicrobial activity against species belonging to the genus Ruellia are scarce, however the literature reveals that some of these species are widely used in folk medicine. Thus, this study sought to describe the chemical composition and evaluate the antibacterial effect of essential oils from aerial parts of Ruellia asperula and Ruellia paniculata, on the growth of Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus oralis ATCC 10557, Streptococcus parasanguinis ATCC 903, Streptococcus salivarius ATCC 7073, Streptococcus sobrinus ATCC 6715, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e Klebsiella oxytoca ATCC 13182, both in planktonic form as in biofilms. The essential oils were obtained and their constituents analyzed by gas chromatography and mass spectrometry (GC / MS). Different methodologies were used to check the antimicrobial potential. Among these are the minimum inhibitory concentration (MIC) determination of the death curve and evaluation of minimum bactericidal concentration (MBC). Furthermore, quantification of biomass and the number of viable cells in the biofilm were conducted, respectively, by staining with crystal violet and counting of colony forming units (CFU). The negative and positive controls used in all tests were, respectively, 4% DMSO and chlorhexidine gluconate adjusted according to the concentration data from the MIC of each micro-organism. The main constituents of the oil R. asperula were cariophylla-4 (12)-8-(13)-dien-5β-ol (14.1%), (E)-caryophyllene (22.7%) and caryophyllene oxide (29.4%) as (E)-caryophyllene (11.0%), spathulenol (13.1%) and δ-amorphene (14.9%) were the major constituents of oil R. paniculata. The data showed that the tested oils have had best results on the strains of Gram-positive bacteria, the essential oil of R. paniculata showed the best effect being able to inhibit planktonic growth, and the development of biofilms of S. oralis strain. Thus, the essential oils and R. asperula and R. paniculata emerge as important alternatives to control bacterial. / O gênero Ruellia L., compreende aproximadamente 300 espécies, as quais estão amplamente distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do planeta. Dentre as espécies que compõem o gênero, estão Ruellia asperula e Ruellia paniculata, conhecidas popularmente como “Melosa” e “Melosa-roxa”. Pesquisas fitoquímicas e de atividade antimicrobiana sobre as espécies pertencentes ao gênero Ruellia são escassas, entretanto a literatura revela que algumas dessas espécies são largamente empregadas na medicina popular. Assim, o presente trabalho buscou descrever a composição química e avaliar o efeito antibacteriano dos óleos essenciais das partes aéreas de Ruellia asperula e Ruellia paniculata, sobre o crescimento de Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus oralis ATCC 10557, Streptococcus parasanguinis ATCC 903, Streptococcus salivarius ATCC 7073, Streptococcus sobrinus ATCC 6715, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e Klebsiella oxytoca ATCC 13182, tanto na forma planctônica como na de biofilmes. Os óleos essenciais foram obtidos e seus constituintes analisados por cromatografia de gás e espectrometria de massa (CG/MS). Diferentes metodologias foram empregadas para a verificação do potencial antimicrobiano. Dentre estas estão a determinação da concentração inibitória mínima (CIM), determinação da curva de morte e avaliação da concentração bactericida mínima (CBM). Além disso, a quantificação da biomassa e do número de células viáveis do biofilme foram realizadas, respectivamente, através da coloração pelo cristal violeta e contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Os controles negativo e positivo utilizados em todos os ensaios foram, respectivamente, DMSO 4% e Gluconato de Clorexidina com concentração ajustada de acordo com os dados da CIM de cada micro-organismo. Os principais constituintes do óleo de R. asperula foram cariofila-4(12),8(13)-dien-5β-ol (14,1%), (E)-cariofileno (22,7%) e óxido de cariofileno (29,4%), enquanto (E)-cariofileno (11,0%), espatulenol (13,1%) e δ-amorfeno (14,9%), foram os constituintes majoritários do óleo de R. paniculata. Os dados mostraram que os óleos testados exerceram melhores resultados sobre as linhagens de bactérias Gram-positivas, e que o óleo essencial de R. paniculata apresentou o melhor efeito sendo capaz de inibir o crescimento planctônico, bem como o desenvolvimento de biofilmes da cepa de S. oralis. Assim, os óleos essenciais de R. asperula e R. paniculata surgem como importantes alternativas para o controle bacteriano.
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Prospecção em folhas de pimentão `Sunshine ́ de peptídeos antimicrobianos com ação contra fitopatógenos e estruturação do banco de dados sobre defensinas DefDB / Prospection in leaves of bell pepper (‘Sunshine’) of antimicrobial peptides with action against fitopathogens and structuring of the defensins data bank DefDB

Magalhães, Rubens Daniel Miserani 27 January 2010 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-17T15:55:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3652908 bytes, checksum: 5659a8779947e080c2cd957f4f69a051 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T15:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3652908 bytes, checksum: 5659a8779947e080c2cd957f4f69a051 (MD5) Previous issue date: 2010-01-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são expressos por muitos organismos e apresentam uma função multifacetada. Estudos os têm revelado como potenciais agentes antibacterianos, defensivos agrícolas, medicamentos cicatrizantes, imuno-moduladores, agentes quimiotáticos, entre outros. Defensinas, a maior família dos peptídeos antimicrobianos, são moléculas com prevalência catiônica, ricas em cisteínas, apresentando em geral três ou quatro pontes dissulfídicas. São constituídas de 45 a 54 resíduos de aminoácidos, encontradas em organismos vertebrados e invertebrados, apresentam atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos e vírus encapsulados. Essas moléculas apresentam baixa toxicidade a animais e plantas, justificando assim seu uso como drogas ou defensivos agrícolas. As defensinas atuam por meio de atrações eletrostáticas com a face externa das membranas celulares alvo, gerando poros e ocasionando morte celular. Elas também atuam, segundo estudos recentes, como sinalizadores primários e secundários em vias apoptóticas e como agentes potencializadores das defesas imunológicas, sendo o mecanismo de atuação molecular ainda desconhecido. A busca por AMPs de plantas tem sido realizada no Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB/UFV) visando à caracterização estrutural desses peptídeos. O isolamento de peptídeos antimicrobianos de extratos solúvel (ES) e de parede celular (EP) de folhas de pimentão da variedade Sunshine foi realizado por etapas pré-cromatográficas (centrifugações, fracionamento salino e por ultrafiltrações) e por cromatografia líquida multidimensional offline. As frações de interesse obtidas de ES e de EP foram testadas em relação à sua atividade antimicrobiana contra o fungo Alternaria solani e contra as bactérias Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positiva, e Ralstonia solanacearum, Gram negativa, pela técnica de microplacas, evidenciando a inibição do crescimento desses microrganismos. Os resultados sugerem a ocorrência de aglomerações dos AMPs nos extratos, dadas as características de hidrofobicidade e cargas desses peptídeos, e que as etapas de separação por massas moleculares devem ser realizadas visando reduzir esses efeitos. O procedimento experimental proposto ao final do trabalho, que envolve o fracionamento por sal e por ultrafiltração, seguindo-se cromatografia de fase reversa em C4, permitiu a separação das amostras em frações com atividades antimicrobianas diferentes e potencialmente de interesse para a exploração comercial na defesa de plantas. A construção de um banco de dados que agrupe informações sobre defensinas, possibilitando evidenciar relações entre as moléculas já conhecidas e sequências não identificadas, apresenta-se de grande importância para a complementação dos estudos crescentes sobre esses peptídeos. As bases de dados do DefDB já estão disponíveis e podem ser utilizadas para identificação de sequências obtidas por métodos de sequenciamento, seja pelo alinhamento com a sequência obtida, ou pela identificação comparativa utilizando ferramentas computacionais específicas, como programas e pipelines utilizados para análises de dados de espectrometria de massa. Assim, as informações obtidas desse banco de dados, com a ajuda de ferramentas de análises já disponíveis na rede mundial de computadores, podem colaborar para a identificação de novas sequências, para a elucidação do mecanismo de atuação molecular, além de contribuir para direcionar estudos iniciais sobre esses peptídeos. Portanto, a obtenção de frações com alta atividade antimicrobiana, juntamente com o desenvolvimento de bases de dados específicas, que facilitem a identificação dos possíveis peptídeos antimicrobianos presentes nessas frações, pode ser o caminho para o estudo e o isolamento de novos compostos naturais, capazes de substituir defensivos agrícolas danosos ao ambiente, e/ou serem utilizados como base de medicamentos para combater infecções e doenças imunológicas. / Antimicrobial peptides (AMPs) are expressed by many organisms and have a multifaceted role. Studies have revealed the AMPs as potential antibacterial agents, pesticides, drugs, healing, immune modulators, chemotactic agents, among others. Defensins, the largest family of antimicrobial peptides, are cationic molecules, rich in cysteines, with four disulfide bridges. They consist of 45 to 54 amino acid residues, found in vertebrate and invertebrate organisms, presenting activity against Gram-positive and Gram- negative bacteria, fungi and encapsulated virus. These molecules have low animals and plants toxicity, thereby justifying their use as drugs or pesticides. The defensins act by means of electrostatic attractions with the external surface of the target cell membranes, creating pores and causing the cell death. They also operate, according to recent studies, such as primary and secondary signs in the apoptosis via and as enhancers of immune defenses, being the molecular mechanism of action still unknown. The search for AMPs in plants has been performed at the Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB / UFV) aiming to characterize the structure of these peptides. The process of separation of peptides was performed by pre-chromatographic step (centrifuging, saline precipitation and ultrafiltration) and offline multidimensional liquid chromatography. The fractions of interest obtained from ES and EP were tested about their antimicrobial activity against the fungus Alternaria solani and against the bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positive, and Ralstonia solanacearum, Gram negative, the microplate technique, showing the inhibition of growth of these microorganisms. The results indicated the occurrence of possible agglomeration of AMPs in the extracts, given the characteristics of hydrophobicity and charges of these peptides, and that the separation steps by molecular weight should be carried out to reduce these effects. The experimental procedure proposed by the latter, which involves the fractionation by salt and by ultrafiltration followed by reverse- phase chromatography on C4, allowed the separation of samples into fractions with different antimicrobial activities and potentially of interest to the commercial exploration to the plants defense. The construction of a data bank to collate information about defensins, allowing the construction of relations between the molecules that have been discovered and unidentified sequences, presented as a very important achievement for the complementation of studies about these peptides. The DefDB databases are available and can be used to identify the sequences obtained by sequencing methods, either by aligning the sequence obtained, or by the comparative identification using specific computational tools, such as programs and pipelines used for data analysis of MS. Thus, the information of this data bank, helped by analysis tools already available on the World Wide Web, may contribute to the identification of new sequences, to elucidate the molecular mechanism of action, and contributes to guide initial studies about these peptides. Therefore, the obtation of fractions with high antimicrobial activity, together with the development of specific databases, to facilitate the identification of potential antimicrobial peptides in these fractions, may be the way to the study and isolation of new natural compounds that can replace harmful pesticides to the environment, and/or be used as the basis for drugs to fight against infections and immune disorders. / Dissertação antiga, falta ficha catalog.
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Resistência a antimicrobianos e biocidas em bactérias isoladas de pacientes e ambiente hospitalares / Antimicrobial and biocide resistance in bacteria isolated from hospital patients and environment

Chequer, Simone Silva Iamin 25 August 2003 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-27T14:31:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 178752 bytes, checksum: a3cf4a241824c5fd7f8d40c532deca3a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T14:31:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 178752 bytes, checksum: a3cf4a241824c5fd7f8d40c532deca3a (MD5) Previous issue date: 2003-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bactérias Gram positivas e Gram negativas foram isoladas de pele de pacientes, de espécimes clínicos e do ambiente de um Centro de Terapia Intensiva hospitalar com o objetivo de estudar sua resistência a agentes biocidas e outros antimicrobianos. Dos trinta e oito isolados do ambiente, treze foram identificados como Staphylococcus sp.; sete como S. aureus; dez como Acinetobacter sp.; um como Acinetobacter baumannii; e sete como Pseudomonas aeruginosa. Na pele de pacientes, dos dezessete isolados, encontraram-se sete de P. aeruginosa; cinco de Staphylococcus sp.; quatro de Escherichia coli; e um de S. aureus. Entre os dez isolados dos espécimes clínicos, três foram identificados como P. aeruginosa; três como Staphylococcus sp.; dois como A. baumannii; um como Acinetobacter sp.; e um como Stenotrophomonas altophila. A resistência a cinco ou a mais antimicrobianos foi freqüente na maioria dos isolados de P. aeruginosa e S. aureus. Os isolados de P. aeruginosa, provenientes da pele de pacientes, apresentaram-se mais multirresistentes quando comparados à linhagem-tipo, e houve prevalência de sulfametoxazol/trimetoprim resistência e a à tetraciclina, perfloxacina. Houve cloranfenicol, prevalência de sensibilidade a imipenem, ciprofloxacina, norfloxacina, ceftazidima e a amicacina. Os três isolados de A. baumannii apresentaram sensibilidade a imipenem e resistência a norfloxacina, cloranfenicol, sulfametoxazol/trimetoprim, amicacina, gentamicina, perfloxacina, tetraciclina, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona e ciprofloxacina. Destes, dois isolados foram sensíveis à fosfomicina. Todos os oito isolados identificados como S. aureus apresentaram sensibilidade a fosfomicina; seis a amicacina; e cinco a tetraciclina, ciprofloxacina e vancomicina. Todos foram resistentes à penicilina; sete a norfloxacina, eritromicina, gentamicina, oxacilina e cefoxitina; seis a clindamicina e ticarcilina/ácido clavulânico; e cinco, a cefalotina. As concentrações inibitórias mínimas (MIC) do digluconato de clorhexidina indicam maior suscetibilidade da espécie S. aureus, quando comparada com P. aeruginosa e A. baumannii. Houve diferença de resistência entre os isolados de diferentes origens, principalmente entre os identificados como P. aeruginosa. Isolados de A. baumannii apresentaram MICs, para polivinilpirrolidona-iodo (PVP-I), pelo menos duas vezes maiores que a linhagem de referência. MICs de PVP-I em P. aeruginosa e S. aureus não foram muito superiores aos encontrados nas respectivas linhagens-tipo. Não houve correlação entre a resistência aos antimicrobianos e aos biocidas. / Gram-positive and Gram-negative bacteria were isolated from patients skin surfaces, clinical samples, and the environment in an intensive care unit at a hospital in order to determine their resistance to and other biocides antimicrobial agents. Among the thirty eight environmental isolates, thirteen were identified as Staphylococcus sp; seven were S. aureus; ten were Acinetobacter sp.; one Acinetobacter baumannii, and seven Pseudomonas aeruginosa. From patients skin surfaces were isolated seven strains of P. aeruginosa, five Staphylococcus sp, two A. baumannii, one Acinetobacter sp and one Stenotrophomonas altophila. Resistance to five or more antibiotics was found in most isolates identified as P. aeruginosa and S. aureus. When compared to the type-strain, isolates of P. aeruginosa were more multiresistant, prevailing resistance sulfametoxazol/trimetropin, to and tetracycline, perfloxacin. Sensitivity chloranphenicol, to imipenem, ciprofloxacin, norfloxacin, and ceftazidime prevailed in most isolates of this species. All A. baumannii isolates were sensitive to imipenem and resistant to the other antibiotics tested. All the S. aureus isolates were resistant to penicillin, seven were resistant to norfloxacin, erythromycin, gentamycin, oxacillin, cefoxitin; six were resistant to clindamycin, ticarcillin/clavulanic acid, and five to cefalotin. Minimal Inhibitory Concentrations (MIC) for chlorhexidine digluconate showed that S.aureus is more sensitive to this biocide as compared to P. aeruginosa and A. baumannii. Differences in resistance could be noticed among isolates of distinct origins, mainly among P. aeruginosa isolates. MICs for PVP-I for A. baumannii were at least twice as large as that for the type-strain. MICs for PVP-I for P. aeruginosa and S. aureus were not very different from those for the respective type-strains. There was no correlation between resistance to biocides and resistance to antibiotics. / Dissertação antiga
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Purificação e atividade antibacteriana de peptídios sintetizados durante a germinação de sementes de soja (Glycine Max [L.] Merrill) / Purification and Antibacterial Activity of Synthesized Peptides During the Germination of Soybean Seeds (Glycine Max [L.] Merrill)

Barbosa, Meire de Oliveira 30 July 2004 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-06T18:00:08Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2095342 bytes, checksum: 836e140d6c09e19f6272573eb8e50aef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-06T18:00:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2095342 bytes, checksum: 836e140d6c09e19f6272573eb8e50aef (MD5) Previous issue date: 2004-07-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Peptídios antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível, com consumo mínimo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs como parte da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Este trabalho visou identificar e purificar peptídios de sementes de soja sintetizados durante a germinação e avaliar a atividade antibacteriana, com o objetivo de desenvolver defensivos agrícolas naturais e agentes antimicrobianos para as indústrias farmacêutica e veterinária. Sementes de soja da variedade UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) foram germinadas por 24, 48, 72 e 96 h, trituradas e maceradas em 2,5 volumes do tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 contendo EDTA, PMSF e benzamidina. As sementes não germinadas foram moídas e adicionadas de tampão fosfato de sódio 25 mM na proporção de 1:5, contendo KCL, EDTA, tiouréia, PMSF e benzamidina. Os homogenatos de ambas foram mantidos sob agitação branda em geladeira por 2 h, centrifugados, e os sobrenadantes foram precipitados com sulfato de amônio. Cada sobrenadante foi aquecido a 80oC/15 min para precipitação diferencial de proteínas, e centrifugado. Seguiu-se cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-Sepharose com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, em equipamento tipo FPLC. O pool catiônico obtido foi submetido à cromatografia de troca catiônica em coluna CM-Sepharose com tampão MES 25 mM, pH 6,0, em equipamento tipo FPLC, e o pico eluído em 0,35 M de NaCl foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18-HPLC. Os perfis obtidos após cromatografia de fase reversa das sementes germinadas e não germinadas foram comparados para análise dos AMPs sintetizados durante a germinação. A semente germinada por 48 h mostrou duas regiões de síntese de diferentes proteínas. Foram realizados testes de atividade antimicrobiana utilizando o pool catiônico após troca aniônica e o pico eluído com 0,35 M de NaCl após troca catiônica, para as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum (gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (gram- positiva), mostrando inibição parcial e total para os extratos após troca aniônica e catiônica, respectivamente. Paralelamente, análises de espectrometria de massa com os extratos obtidos após RP-HPLC indicaram a presença de peptídio de 1 a 9 kDa e de proteína de massa maior que 20 kDa, em regiões do perfil cromatográfico correspondentes à eluição em concentrações inferiores e superiores a 40% de acetonitrila, respectivamente. Outros picos peptídicos sintetizados durante a germinação por 48, estão sendo submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídios efetivos contra fitopatógenos de interesse. / Purification and Antibacterial Activity of Synthesized Peptides During the Germination of Soybean Seeds (Glycine Max [L.] Merrill). Adiver: Maria Cristina Baracat Pereira. Committee Members: Elizabeth Pacheco Batista Fontes and Reginaldo da Silva Romeiro. Antimicrobial peptídes (AMPs) they are produced by animals, plants, insects and other organisms as strategy of efficient, flexible defense, with minimum consumption of energy and biomass, in function of its small size. In plants, they were identified ten families of AMPs as part of the constituent barrier of defense of the plant, with molecular masses that vary of 2 to 9 kDa. This work aiming t to identify and to purify peptides of soybean seeds synthesized during the germination and to evaluate the antibacterial activity, objectifying the development of defensive agricultural natural and agents antimicrobial for the pharmaceutical and veterinary industries. Soybean of seeds of the variety UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) they were germinated by 24, 48, 72 and 96 h, triturated in the proportion of 1:2,5 using Tris-HCl buffer 0,1 M, pH 7,0 contends EDTA, PMSF and benzamidine. The no germinated seeds were triturated and added of phosphate of sodium buffer 25 mM in the proportion of 1:5, containing KCL, EDTA, thiourea, PMSF and benzamidine. . Both obtained extracts were maintained under agitation and ice-bath in refrigerator for 2 h, and centrifuged . As the first step of purification procedure, protein extracts were recovered after ammonium sulfate precipitation and centrifugation, heating up to 80oC/15 min for precipitation of proteins and a new centrifugation. Anion-exchange chromatography was followed in column DEAE-Sepharose using Tris-HCl buffer, 25 mM, pH 7.0 in equipment type FPLC. The obtained cationic pool was submitted to the cationic exchange cromatography in column CM Sepharose using MES buffer 25 mM, pH 6,0, in equipment type FPLC, and a fraction were recovered in NaCl 0,35 M, that was submitted to a C18- RP-HPLC. The obtained RP-HPLC profiles of the germinated and no-germinated seeds were compared each other and two different groups of proteins were observed when seeds were germinated by 48 h, if compared with no-germinated seeds, indicating expression of different proteins. Tests of antimicrobial activity were realized using the anionic-exchange pool and the cationic exchange-pool, against the plant pathogens Ralstonia solanacearum (Gram-negative) and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Gram-positive), showing partial- or full-inhibition, respectively . Simultaneously, analysis of mass spectrometry with the C18-RP-HPLC extracts shows peptides (1 to 9 kDa) and proteins (20 kDa in areas of the profile cromatography corresponding to the eluted in inferior and superior concentrations at 40% of acetonitrile). Other peptide fractions were submitted to the mass spectrometry analysis, amino acids-sequence determination, and antimicrobial test, aiming to select effective peptides to control important plant patogens of commercial interest. / Dissertação importada do Alexandria
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DESENVOLVIMENTO E PADRONIZAÇÃO DE UM MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO Mycobacterium tuberculosis A FÁRMACOS CONTRA TUBERCULOSE.

CASTELLANI, L. G. S. 22 August 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6776_Dissertação final (corrigida).pdf: 1783247 bytes, checksum: 5b17d1a4a0dcae9cf20689c293eb3d5f (MD5) Previous issue date: 2013-08-22 / A resistência a fármacos antituberculose tem constituído uma grande ameaça ao controle da tuberculose em âmbito mundial. A sua detecção precoce permite ao médico instituir um esquema de tratamento mais adequado ao paciente e consequentemente quebrar a cadeia de transmissão dos bacilos. Os testes de sensibilidade a antimicrobianos atuais, embora eficientes, são caros e/ou demorados e/ou trabalhosos. Com base nesta premissa, nos propusemos a desenvolver e padronizar um método fenotípico direto para determinação da sensibilidade do Mycobacterium tuberculosis a antimicrobianos de primeira linha do tratamento da tuberculose. Para o desenvolvimento deste novo teste, utilizaram-se os princípios do método das proporções e do exame de cultura pelo método de OgawaKudoh. O estudo foi dividido em duas fases. A primeira, caracterizada pelo desenvolvimento e padronização do método proposto e a segunda, pela análise da concordância entre o método desenvolvido e o método do MGIT (padrão-ouro). Na primeira fase, foram realizados diversos ensaios para definir: os volumes de absorção e de liberação de líquidos de diferentes tipos de swab, o meio de cultura, as concentrações dos antimicrobianos e o tempo de leitura/interpretação das culturas. Além disso, foi verificado se a amostra deveria ou não ser diluída. Com base nos resultados destes ensaios, padronizou-se o método com: swab comercial, em meio de cultura Ogawa-Kudoh contendo separadamente 0,2 µg/mL de isoniazida, 40,0 µg/mL de rifampicina, 10,0 µg/mL de estreptomicina e 500,0 µg/mL de ácido para-nitrobenzóico. Padronizou-se ainda a inoculação da amostra de escarro de forma direta, ou seja, sem diluir e a leitura/interpretação do resultado do teste no período entre 21 e 28 dias. A análise comparativa entre este método e o teste de ensibilidade a antimicrobianos no sistema MGIT realizada na segunda fase do projeto indicou um índice kappa igual a 1,000, ou seja, uma concordância muito boa em relação ao padrão-ouro. Diante desses resultados promissores, acreditamos que o método desenvolvido apresente um grande potencial para ser utilizado em laboratórios com pouca infra-estrutura, por ser de baixo custo, fácil execução e relativamente rápido. Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, escarros, antimicrobianos, testes de sensibilidade bacteriana, resistência a drogas.
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Atividade in vitro e in vivo dos peptídeos Pa-MAP 1.5 E Pa-MAP 1.9 derivados de Pleuronectes americanus contra Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 / Activity in vitro and in vivo of peptides Pa-MAP 1.5 and Pa-MAP 1.9 from Pleuronectes americanus against Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

Cherobim, Mariana Dornelles 27 February 2014 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-29T19:41:10Z No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-30T17:37:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-30T17:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Peptídeos antimicrobianos (PAM) são componentes do sistema imune inato da maioria dos seres vivos. Estas moléculas vêm despertando um crescente interesse como alternativas aos antibióticos clássicos, uma vez que podem apresentar atividade antimicrobiana potente contra um amplo espectro de microrganismos, inclusive contra microrganismos resistentes aos antimicrobianos disponíveis. Por mais dinâmica que sejam as indústrias farmacêuticas na busca por novos fármacos, é praticamente impossivel o mercado farmacêutico acompanhar o espantoso fenômeno da multirresistência apresentada por muitos microrganismos. Neste contexto, os PAMs surgem como uma alternativa farmacológica, pois podem ser usados isoladamente ou combinados entre si ou com outros antibióticos clássicos. Neste estudo foi avaliada a atividade antimicrobiana de dois peptídeos sintéticos e análogos denominados Pa-MAP 1.5 e Pa-MAP 1.9, derivados de um peptídeo do peixe Pleuronectes americanus. Os dois análogos tiveram sua homogeneidade e grau de pureza analisados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e posteriormente foram submetidos a ensaios antimicrobianos, isoladamente e em combinação, contra a bactéria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae e avaliados também, com relação à sua atividade citotóxica Os resultados in vitro evidenciaram uma forte atividade sinérgica com CIM de 4/4g.ml-1, dos peptídeos, sendo que esta concentração não se mostrou citotóxica. Resultados dos testes In vivo, mostraram que a combinação de peptídeos foi eficiente, sendo observado um decréscimo notável de UFCs de K. pneumoniae no sangue bem como nos pulmões, de camundongos Black C57/bl6. Os animais foram tratados com os peptídeos combinados, inoculados por via intravenosa, utilizando concentrações de 36 mg.Kg-1, 18mg.Kg-1 e 9mg.Kg-1 para o peptídeo Pa-MAP 1.5; e para o peptídeo Pa-MAP 1.9 as doses utilizadas foram de 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1. Com o objetivo de entender como ocorre o acoplamento e a interação destes peptídeos, foram propostos modelos tridimensionais in silico através de modelagem molecular. Resultados das modelagens in silico sugerem uma estrutura em α-hélice anfipática, para ambos os peptídeos. Quando se realizou o acoplamento molecular dos peptídeos com uma membrana aniônica, os peptídeos conjugados 11 apresentaram uma alta taxa de afinidade, corroborando assim com os resultados experimentais in vitro e in vivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial peptides (AMPs) are innate immune system components, which are present in several living organisms. This molecules interesting is growing as an alternative for traditional antibiotics due to their potent antimicrobial activities against a broad range of microorganisms including those resistant to classical antibiotics. In spite of pharmaceutical companies dynamism for new drugs discovery, have been virtually impossible to pharmaceutical market to keep up the amazing multidrug resistance phenomen shown by many microorganisms. By this way, antimicrobial peptides stand out as promising pharmacological alternatives, since they can be used alone or in combination to classic antibiotic. In this view, the present study characterized the activity of two synthetic analogues, named Pa-MAP 1.5 and Pa-MAP 1.9 from Pleuronectes americanus fish. Both analogs had the homogeinity and purity degree checked by MALDI-ToF mass spectrometry. Moreover, peptides were assayed according their antibacterial activity, alone and in combination against Gram-negative Klebsiella pneumonia as well as their hemolytic activity. Data in vitro assay demonstrate a strong synergistic activity between peptides, with MIC of 4/4g.ml-1. Nevertheless at this concentration they did not showed cytolytic effects. The in vivo results showed that peptides combination were capable to pronounced decrease K. pneumoniae’s UFCs in blood count, as well in black C57/bl6 mouse’s lung. The animals were treated with the combined peptides via intravenously using concentrations of 36 mg.Kg-1, 18 mg.Kg-1 and 9 mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.5; and 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.9. In order to understand these peptides interact in silico three-dimensional models were constructed by molecular modeling. Results of in silico modeling suggest amphipathic α-helical structures for both peptides. When molecular peptide docking was performed with anionic membranes, conjugated peptides showed high affinity rates, thus corroborating with in vitro and in vivo data presented.
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Toxicidade e atividade antiparasitária da Filosseptina-1, um peptídeo de Phyllomedusa hypochondrialis (AMPHIBIA)

Kuckelhaus, Selma Aparecida Souza 27 September 2007 (has links)
Tese (doutorado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-03-16T17:53:45Z No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-18T23:22:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-18T23:22:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / As doenças infecciosas estão entre as principais causas de mortalidade em todo o mundo e seu controle depende da existência de agentes antimicrobianos eficazes. O maior entrave para a manutenção da eficácia é o desenvolvimento de resistência dos agentes infecciosos às drogas antimicrobianas. A geração de resistência aos antimicrobianos tornou-se nas últimas décadas uma das grandes preocupações da Organização Mundial de Saúde que, desde então, tem estimulado as pesquisas, básica e aplicada, na busca por novas drogas que possam ajudar na luta constante contra os mecanismos de resistência. Todos os seres vivos estão continuadamente expostos a uma grande quantidade de potenciais agentes patogênicos e a capacidade para evitar as doenças depende, em grande parte, dos seus mecanismos de defesa. Tanto animais quanto plantas desenvolveram, ao longo da evolução, mecanismos inatos de defesa, tais como a produção de diferentes substâncias bioativas, que são identificadas, sobretudo, nos anfíbios. Dentre essas substâncias destacam-se os peptídeos com ação antimicrobiana, que exercem, in vitro, potente atividade lítica contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, protozoários e fungos filamentosos e, comumente, exibem baixa toxicidade para células de mamíferos. Esses peptídeos são caracterizados por apresentarem seqüências de 12 a 50 resíduos de aminoácidos e intensa carga positiva e, apesar da grande diversidade molecular, têm em comum suas configurações anfipáticas e propriedade de interação com membranas celulares. Os estudos realizados com a secreção cutânea de duas pererecas do gênero Phyllomedusa permitiram a descoberta de uma nova família de peptídeos antimicrobianos denominada filosseptinas (PSs) e, estudos preliminares realizados com a filosseptina-1 (PS-1) mostraram seu potencial antimicrobiano. Logo, considerando a diversidade funcional desses peptídeos e sua eficácia ao longo do processo evolutivo o objetivo desse estudo foi avaliar a toxicidade da PS-1 sobre células de mamíferos, in vitro e in vivo e sua atividade antiparasitária sobre L. (L.) amazonensis e P. falciparum, visando aplicações biomédicas e biotecnológicas. Observaram-se, com as maiores concentrações de PS- 1, efeitos tóxicos sobre células de mamíferos e com as menores concentrações capacidade imunomodulatória, por aumentar a adesão de macrófagos, influenciar a fagocitose, a produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio por macrófagos de camundongo e, de fator de necrose tumoral por monócitos humanos. A PS-1 apresentou também grande atividade lítica sobre L. (L.) amazonensis e P. falciparum, sendo definidas como 1 ou 48μg/mL, respectivamente, as concentrações capazes de inibir o crescimento de, no mínimo 50% dos parasitos. Nossos resultados demonstraram que a PS-1 apresenta grande potencial para aplicações biomédicas, como modulador do sistema imunitário ou como agente antimicrobiano contra plasmódio e leishmânia. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Infectious diseases cause millions of deaths throughout the world and their control depends on the use of efficient antimicrobial agents. However, a major concern is the frequent development of resistance of the infectious agents to these products. The growing emergence of this phenomenon lead the World Health Organization to consider it as a major public health problem, and it has stimulated the development of novel products, mainly from nature, to fight the pathogens. It is well established that animals and plants produce many bioactive substances as defense mechanisms. This ability is particularly important among the amphibians. Some of these substances are represented by antimicrobial peptides, which are endowed with activity against bacteria and protozoa, and commonly exhibit low toxicity to mammalian cells. These antimicrobial peptides are characterized by the presence of 12 to 50 amino acids residues, high cationicity and, despite the great diversity of molecular structures, they are amphipathic and present the property to interact with cell membranes. Recently, our group identified a new family of antimicrobial peptides named phylloseptins, and the preliminary studies with phylloseptin-1 (PS-1) showed its potential as an antimicrobial agent. Considering the functional diversity of antimicrobial peptides and their efficacy throughout the evolutionary process, the objective of the present investigation was to evaluate the toxicity of PS-1 against mammalian cells, in vitro and in vivo, and its activity against two protozoa, L. (L.) amazonensis and P. falciparum, for future biomedical applications. Toxic effects of PS-1 were observed on mammalian cells exclusively with larger concentrations of the peptide, whereas with the smaller ones, immunomodulation was observed, affecting macrophage adherence, phagocytosis, production of hydrogen peroxide and nitric oxide by mouse peritoneal macrophages, and tumor necrosis factor by human monocytes. PS-1 showed strong activity against L. (L.) amazonensis and P. falciparum, and at concentrations of 1 or 48μg/mL, respectively, the peptide was able to inhibit 50% of these parasites, respectively. Our results showed that PS-1 presents an important potential for biomedical applications, both as an immunomodulatory product, and as an antimicrobial agent against plasmodium and leishmania species.

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