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Toxicidade e atividade antiparasitária da Filosseptina-1, um peptídeo de Phyllomedusa hypochondrialis (AMPHIBIA)

Kuckelhaus, Selma Aparecida Souza 27 September 2007 (has links)
Tese (doutorado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-03-16T17:53:45Z No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-18T23:22:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-18T23:22:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / As doenças infecciosas estão entre as principais causas de mortalidade em todo o mundo e seu controle depende da existência de agentes antimicrobianos eficazes. O maior entrave para a manutenção da eficácia é o desenvolvimento de resistência dos agentes infecciosos às drogas antimicrobianas. A geração de resistência aos antimicrobianos tornou-se nas últimas décadas uma das grandes preocupações da Organização Mundial de Saúde que, desde então, tem estimulado as pesquisas, básica e aplicada, na busca por novas drogas que possam ajudar na luta constante contra os mecanismos de resistência. Todos os seres vivos estão continuadamente expostos a uma grande quantidade de potenciais agentes patogênicos e a capacidade para evitar as doenças depende, em grande parte, dos seus mecanismos de defesa. Tanto animais quanto plantas desenvolveram, ao longo da evolução, mecanismos inatos de defesa, tais como a produção de diferentes substâncias bioativas, que são identificadas, sobretudo, nos anfíbios. Dentre essas substâncias destacam-se os peptídeos com ação antimicrobiana, que exercem, in vitro, potente atividade lítica contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, protozoários e fungos filamentosos e, comumente, exibem baixa toxicidade para células de mamíferos. Esses peptídeos são caracterizados por apresentarem seqüências de 12 a 50 resíduos de aminoácidos e intensa carga positiva e, apesar da grande diversidade molecular, têm em comum suas configurações anfipáticas e propriedade de interação com membranas celulares. Os estudos realizados com a secreção cutânea de duas pererecas do gênero Phyllomedusa permitiram a descoberta de uma nova família de peptídeos antimicrobianos denominada filosseptinas (PSs) e, estudos preliminares realizados com a filosseptina-1 (PS-1) mostraram seu potencial antimicrobiano. Logo, considerando a diversidade funcional desses peptídeos e sua eficácia ao longo do processo evolutivo o objetivo desse estudo foi avaliar a toxicidade da PS-1 sobre células de mamíferos, in vitro e in vivo e sua atividade antiparasitária sobre L. (L.) amazonensis e P. falciparum, visando aplicações biomédicas e biotecnológicas. Observaram-se, com as maiores concentrações de PS- 1, efeitos tóxicos sobre células de mamíferos e com as menores concentrações capacidade imunomodulatória, por aumentar a adesão de macrófagos, influenciar a fagocitose, a produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio por macrófagos de camundongo e, de fator de necrose tumoral por monócitos humanos. A PS-1 apresentou também grande atividade lítica sobre L. (L.) amazonensis e P. falciparum, sendo definidas como 1 ou 48μg/mL, respectivamente, as concentrações capazes de inibir o crescimento de, no mínimo 50% dos parasitos. Nossos resultados demonstraram que a PS-1 apresenta grande potencial para aplicações biomédicas, como modulador do sistema imunitário ou como agente antimicrobiano contra plasmódio e leishmânia. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Infectious diseases cause millions of deaths throughout the world and their control depends on the use of efficient antimicrobial agents. However, a major concern is the frequent development of resistance of the infectious agents to these products. The growing emergence of this phenomenon lead the World Health Organization to consider it as a major public health problem, and it has stimulated the development of novel products, mainly from nature, to fight the pathogens. It is well established that animals and plants produce many bioactive substances as defense mechanisms. This ability is particularly important among the amphibians. Some of these substances are represented by antimicrobial peptides, which are endowed with activity against bacteria and protozoa, and commonly exhibit low toxicity to mammalian cells. These antimicrobial peptides are characterized by the presence of 12 to 50 amino acids residues, high cationicity and, despite the great diversity of molecular structures, they are amphipathic and present the property to interact with cell membranes. Recently, our group identified a new family of antimicrobial peptides named phylloseptins, and the preliminary studies with phylloseptin-1 (PS-1) showed its potential as an antimicrobial agent. Considering the functional diversity of antimicrobial peptides and their efficacy throughout the evolutionary process, the objective of the present investigation was to evaluate the toxicity of PS-1 against mammalian cells, in vitro and in vivo, and its activity against two protozoa, L. (L.) amazonensis and P. falciparum, for future biomedical applications. Toxic effects of PS-1 were observed on mammalian cells exclusively with larger concentrations of the peptide, whereas with the smaller ones, immunomodulation was observed, affecting macrophage adherence, phagocytosis, production of hydrogen peroxide and nitric oxide by mouse peritoneal macrophages, and tumor necrosis factor by human monocytes. PS-1 showed strong activity against L. (L.) amazonensis and P. falciparum, and at concentrations of 1 or 48μg/mL, respectively, the peptide was able to inhibit 50% of these parasites, respectively. Our results showed that PS-1 presents an important potential for biomedical applications, both as an immunomodulatory product, and as an antimicrobial agent against plasmodium and leishmania species.
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Estudo da atividade de proteínas cry, derivadas de Bacilos thuringiensis ativas para insetos-praga do algodoeiro

Martins, Érica Soares 16 July 2009 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-22T16:35:44Z No. of bitstreams: 1 2009_EricaSoaresMartins.pdf: 5953401 bytes, checksum: a4306cdea8c67f736b4ad735799a7225 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:22:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_EricaSoaresMartins.pdf: 5953401 bytes, checksum: a4306cdea8c67f736b4ad735799a7225 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_EricaSoaresMartins.pdf: 5953401 bytes, checksum: a4306cdea8c67f736b4ad735799a7225 (MD5) Previous issue date: 2009-07-16 / Toxinas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) são proteínas inseticidas utilizadas para controle de insetos. Elas agem por ingestão e são ativadas por proteases e interagem com receptores específicos localizados na superfície da célula hospedeira, resultando na lise de células do intestino médio. Este trabalho está dividido em quatro capítulos. No primeiro, foi feita uma revisão sobre Bacillus, ecologia e modo de ação, e insetos-praga do algodão. O segundo capítulo descreve a seleção e o estudo do conteúdo de genes cry de estirpes de B. thuringiensis com atividade para Anthonomus grandis. O terceiro capítulo descreve a clonagem, sequenciamento e expressão da toxina Cry1Ba da estirpe S601 de B thuringiensis, que é tóxica para A. grandis. A ligação da toxina Cry1Ba6 a proteínas localizadas na borda escovada de células do intestino médio de A. grandis foi analisada e descobriu-se que a proteína Cry1Ba6 se liga a duas proteínas (62 e 65 kDa) com atividade de fosfatase alcalina (ALP). Este trabalho é o primeiro relato da localização de receptores de toxina Cry em células do intestino médio de A. grandis. Finalmente, o capítulo quatro mostra como outras toxinas (Cry1Ia e Cry10A) expressas em Bt, com atividade já descrita para A. grandis interagem com BBMVs de A. grandis e S. frugiperda. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cry toxins from Bacillus thuringiensis (Bt) are isecticidal proteins used for insect control. They actin by ingetion and are activated by host proteases and interact with specific receptors located on the host cell surface, resulting in midgut epithelial cells lysis. This work is divided in four chapters. In the first, a review was done o Bacillus, ecology and action mode, and cotton insect-pests. The second chapter describes the selection and study of the content of cry genes of B. thuringiensis strains with activity against nthonomus. grandis. The third chapter describes cloning, sequencing and expression of a cry1Ba toxin gene from the B. thuringiensis S601 strain which is toxic to A. grandis. The binding of Cry1Ba6 toxin to proteins located on the midgut brush border membrane of A. grandis was analyzed and it was found that Cry1Ba6 binds to two proteins (62 and 65 kDa) that showed alkaline phosphatase (ALP) activity. This work is the first report that shows the localization of Cry toxin receptors on the midgut cells of A. grandis. Finally, the chapter four shows how other toxins (Cry1Ia and Cry10A) expressed in Bt, which previously had activity described to A. grandis, interact with A. grandis and S. frugiperda BBMVs.
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Estudo da toxicidade de diferentes estágios de crescimento da Brachiaria decumbens em ovinos

Santos Júnior, Helvécio Leal 11 December 2008 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-03-24T21:50:33Z No. of bitstreams: 1 2009_HelvecioLealSantosJunior.pdf: 1422454 bytes, checksum: d6ba3f63ea8dba7e9c2cd063c4a2d68f (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-17T18:27:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_HelvecioLealSantosJunior.pdf: 1422454 bytes, checksum: d6ba3f63ea8dba7e9c2cd063c4a2d68f (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-17T18:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_HelvecioLealSantosJunior.pdf: 1422454 bytes, checksum: d6ba3f63ea8dba7e9c2cd063c4a2d68f (MD5) Previous issue date: 2008-12-11 / Foram introduzidos em três piquetes (P, M e G) cultivados com Brachiaria decumbens, 21 ovinos, machos, de 4 meses de idade, durante dois meses. Nos piquetes a forrageira tinha 15, 45 e 90 dias de crescimento respectivamente. O aumento na concentração da enzima sérica aspartatoaminotransferase ocorreu na semana após o inicio do experimento nos grupos P e M e sétima semana no grupo G, enquanto que o aumento da gamaglutamiltransferase ocorreu na segunda semana no grupo P e M e no grupo G ocorreu na quarta semana. Os principais sinais clínicos incluíram apatia, fotofobia, secreção ocular bilateral, hiperemia e icterícia de mucosas além de edema de face. Quando os animais apresentavam os sinais clínicos severos da intoxicação eram retirados do experimento e realizava-se a biópsia hepática guiada por ultrasom. Os ovinos que morreram foram necropsiados. Os achados de necropsia foram a hepatomegalia e distensão da vesícula biliar. Na avaliação microscópica das biópsias e dos animais necropsiados os principais achados incluíam: tumefação e vacuolização de hepatócitos, macrófagos espumosos, colestase e cristais na luz de ductos biliares. A microscopia eletrônica do fígado dos animais intoxicados revelou hiperplasia de retículo endoplasmático liso associado a presença de cristais no citoplasma de hepatócitos. Não foram observados esporos do fungo Pithomyces chartarum nas coletas realizadas durante o experimento. Na avaliação dos níveis de protodioscina o grupo P, grupo em que a pastagem apresentava intensa brotação apresentou a maior concentração dos níveis de protodioscina. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Were introduced into three paddocks (P, M e G) cultivated with Brachiaria decumbens, 21 sheep, male, from 4 months of age, for two months. In the pickets had forage 15, 45 and 90 days of growth respectively. Increase in the concentration of seric enzyme aspartatoaminotransferase occurred in the after the start of the experimente in group P and M and at the seventh week in group G, while the increase in gamaglutamiltransferase ocorred in the second week in group P and M and in group G occurred in the fourth week. The main clinical signs included apathy, photophobia, bilateral ocular secretions, mucous hyperemia of jaundice and facial swelling. When the animals showed clinical signs of sever intoxication they were withdraw from the experiment and it was performed an ultrasound guided liver biopsy. The sheep´s that died were necropsied. The findings of the necropsy were hepatomegaly and distension of the gallbladder. In the microscopic assessment of biopsies and animals corpses the main findings included: swelling and vacuolization of hepatocytes, macrophages sparkling, crystal and cholestasis in light of bile ducts. The electron microscopy of liver of the poisoned animals reveled hyperplasia of smooth endoplasmic reticulum associated with the presence of crystals in the cytoplasm of hepatocytes. There were no Pitomyces chartarum spore in samples taken during the experiment. In assessing the levels of protodioscina the group P, group where the pasture was intense shooting had the highest concentration levels of protodioscina.
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Toxinas recombinantes Cry2Aa e Cry11A de Bacillus thuringiensis expressas em células de inseto são tóxicas para larvas de Lepidoptera e Diptera

Lima, Gláucia Manoella de Souza January 2009 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-03-29T13:47:46Z No. of bitstreams: 1 2009_GlauciaManoelladeSouzaLima.pdf: 6424079 bytes, checksum: ebb433df2157258c4cb5131712e0b77e (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:10:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_GlauciaManoelladeSouzaLima.pdf: 6424079 bytes, checksum: ebb433df2157258c4cb5131712e0b77e (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:10:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_GlauciaManoelladeSouzaLima.pdf: 6424079 bytes, checksum: ebb433df2157258c4cb5131712e0b77e (MD5) Previous issue date: 2009 / Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva, entomopatogênica, que se caracteriza pela presença de inclusões cristalinas denominadas de #-endotoxinas ou proteínas Cry. Essas proteínas podem ser altamente tóxicas para insetos suscetíveis, não apresentando atividade para outros organismos. Alguns sistemas de expressão vêm sendo utilizados para expressar proteínas Cry com a finalidade de aumentar a sua toxicidade para diversas ordens de insetos. Os baculovírus são vírus de insetos que têm sido muito utilizados como vetores de expressão de genes heterólogos em células de insetos, devido principalmente à presença de promotores fortes que permitem altos níveis da proteína heteróloga na fase tardia da infecção. Neste trabalho, foram clonados genes cry (cry2Aa e cry11A) isolados das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki S447 e subsp. israelensis S1806, respectivamente, no genoma do baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), por transposição sítio-específica, gerando os vírus vAcCry2Aa e vAcCry11A. A avaliação da expressão bem como a presença do transcrito foi realizada por RT-PCR. As proteínas heterólogas Cry2Aa e Cry11A foram analisadas em gel SDS-PAGE 12%, revelando a presença de bandas de aproximadamente 65 kDa e 70 kDa, respectivamente. A toxicidade das proteínas heterólogas foi testada para larvas de inseto das ordens Lepidoptera e Diptera. A proteína heteróloga Cry2Aa apresentou uma CL50 1,036 $g/mL para larvas de segundo instar de Anticarsia gemmatalis , enquanto Cry11A mostrou ser bastante tóxica para larvas de segundo instar de Aedes aegypti com CL50 de 53,3 ng/mL. A presença de cristais derivados da proteínas heteróloga Cry2Aa só foi evidenciada nos extratos de lagartas infectadas com os vírus recombinantes. A análise ultraestrutural da proteína heteróloga Cry2Aa purificada a partir dos extratos das larvas de terceiro instar infectadas com o vírus recombinante vAcCry2Aa mostrou a presença de grandes cristais na forma cubóide Neste trabalho foi possível avaliar que o baculovírus é um bom vetor de expressão de proteínas Cry. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram positive, entomopathogenic bacteria that produces crystalline inclusions called -endotoxins or Cry proteins. These proteins are highly toxic to susceptible insects, not showing activity against others organisms. Some expression systems have been used to express crystal proteins with the aim to increase their toxicity for several insect orders. Baculoviruses are insect viruses that have been widely used as expression vectors of heterologous proteins in insect cells, mainly due to the presence of strong promoters that allow high levels of expression of the heterologous protein during the late phase of virus infection. In this work, cry genes (cry2Aa and cry11A) from B. thuringiensis subsp. Kursaki S447 and subsp. israelensis S1806, respectively, were introduced into the genome of the baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), by site-specific transposition, generating the recombinant viruses vAcCry2Aa and vAcCry11A. Transcription of the heterologous genes were confirmed using mRNA from recombinant viruses infectedinsect cells (72 h p.i) by RT-PCR . The heterologous Total extracts from Spodoptera frugiperda infected with the recombinant viruses (vAcCry2Aa and vAcCry11A) were analyzed by SDS-PAGE, which detected the presence of polypeptides around 65 kDa and 70 kDa, respectively. Bioassays, using the heterologous proteins showed that Cry2Aa had toxicity to second instar Anticarsia gemmatalis larvae with a LC50 of 1.03 $g/mL and that Cry11A had toxicity to second instar Aedes aegypti larvae (Cry11A) with a LC50 of 53.3 ng/mL. Cuboid-shaped protein crystals (Cry2Aa) were observed only in vAcCry2Aa S. frugiperda infected-extracts by light and scanning electron microscopy. This work confirms the utility of the baculovirus expression system for the efficient expressionof Cry proteins.
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Avaliação da toxicidade aguda e genotoxicidade de extrato de floração de Microcystis spp para peixes de água doce

Silva, Ricardo Rocha Pavan da January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-04-13T13:54:38Z No. of bitstreams: 1 2009_RICARDOROCHAPAVANDASILVA_dissertaçao.pdf: 2120078 bytes, checksum: 0eb01ef36a8d23ea73bca49643bf19b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-15T00:09:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_RICARDOROCHAPAVANDASILVA_dissertaçao.pdf: 2120078 bytes, checksum: 0eb01ef36a8d23ea73bca49643bf19b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-15T00:09:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_RICARDOROCHAPAVANDASILVA_dissertaçao.pdf: 2120078 bytes, checksum: 0eb01ef36a8d23ea73bca49643bf19b7 (MD5) Previous issue date: 2009 / A preocupação dos efeitos de cianobactérias na saúde humana cresce em muitos países. Casos de florações de cianobactérias em reservatórios e lagos criam problemas para o abastecimento de água, além de envenenamento, tanto animal como humano, se tornando uma preocupação para a saúde pública. As toxinas das cianobactérias são um grupo de toxinas naturais do ponto de vista químico e toxicológico. Podem ser neurotoxinas, hepatotoxinas, citotoxinas, toxinas irritantes e gastrintestinais. Microcystis aeruginosa é a espécie mais comum em florações de água doce de cianobactérias nocivas. Este trabalho teve como objetivo a avaliação da toxicidade e da genotoxicidade do extrato de uma floração de Microcystis spp contendo microcistina em peixes. Utilizaram-se duas espécies de peixes, sendo uma exótica (Oreochromis niloticus) e outra nativa do Brasil (Astyanax bimaculatus). Para a determinação da toxicidade aguda, utilizouse o método Trimed Spearman-Karber, e para a genotoxicidade aplicaram-se os testes de micronúcleo, do cometa e necrose versus apoptose com eritrócitos de sangue periférico coletados dos peixes. Estes foram expostos por duas vias (exposição corpórea e intraperitoneal) em diferentes concentrações. Verificou-se que em O. niloticus a CL50 (72 h) foi maior que 103,725 μg/L e a DL50 (72h) maior que 138 μg/100g de peso corpóreo. E para A. bimaculatus a CL50 (72h) calculada foi de 242,81 com intervalo de confiança de 152,74 a 386,00 μg/L e a DL50 (72h) igual a 491,9 com intervalo de confiança de 385,8 a 627,3 μg/100g de peso corpóreo. A maior média de micronúcleos observada em O. niloticus foi através de exposição corpórea à concentração de 103,725μg/L. Em A. bimaculatus a maior média foi na concentração 368,8μg/100g de peso expostos via i.p., seguida pela média da concentração 103,725μg/L e pela média da concentração 245,86μg/100g de peso via i.p. No teste do cometa os resultados demonstraram, tanto para O. niloticus como para A. bimaculatus, que em ambas as vias de exposição e concentrações mais elevadas, observaram-se valores significativos. No teste de necrose versus apoptose, observou-se, em O. niloticus, um maior índice de células em necrose com a maior dose e um maior índice de apoptoses na dose mais baixa. Em A. bimaculatus observaram-se células em necrose e em apoptose na dose mais alta e células em apoptoses com a dose mais baixa. O extrato da floração apresentou ação tóxica apenas para A. bimaculatus e ação genotóxica nas duas espécies de peixes. Em concentrações maiores, o extrato provocou necrose e em doses baixas provocou apoptose. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The concern with the effects of cyanobateria in the humans health raise in many countries. Cases of cyanobacteria bloom in reservoir and lakes turn out to be a problem for the water supply besides poisoning animals as human being becoming a source of issue for the public health. The cyanotoxins are a group of natural toxins form the toxicological and chemist point of view. They can be neurotoxin, hepatotoxin, citotoxin, irritating and gastrointestinal toxin. Microcystis aeruginosa is the most ordinary specie in fresh water bloom of harmful cyanobacteria. The objective of this project was the valuation of toxicity and the genotoxicity in fishes of the extract of a bloom of Microcystis spp containing microcystin. Two species were used, one of them is exotic (Oreochromis niloticus) and the other is native from Brazil (Astyanax bimaculatus). To determine the toxicity the method Trimed Spearman- Karber was used, and for the genotoxicity the micronucleus test, the comet assay and necrosis versus apoptosis test were applied using erythrocytes of peripheral blood from fishes. These were exposed by two ways (body exposure and via intraperitoneal (i.p.)) in different concentrations. One has checked that in O. niloticus. the LC50 (72 h) surpassed 103,725 μg/L and the LD50 (72h) surpassed 138 μg/100g of body weight. For A. bimaculatus the LC50 (72h) calculated was the 242,81 with confidence interval of 152,74 at 386,00 μg/L and the LD50 (72h) equal to 491,9 with confidence interval of 385,8 at 627,3 μg/100g of body weight. The largest average of the micronucleus observed in O. niloticus was given by the body exposition to the concentration of 103,725μg/L. In A. bimaculatus the largest average was in the concentration 368,8μg/100g of exposed weights via i.p., followed by the concentrated average 103,725μg/L and by the concentrated average 245,86μg/100g of weight via i.p. In the comet assay, for both O. niloticus and A. bimaculatus, the results show that in both ways of exposition and the highest concentrations, significant values were observed. In the necrosis versus apoptosis test one has observed a larger incidence of cells in necrosis with the highest dose and a higher incidence of apoptosis in the lowest dose in O. niloticus. And one has observed cells in necrosis and in apoptosis in the highest dose and cells in apoptosis with the lowest dose in A. bimaculatus. The extract of bloom has shown toxic action only for the A. bimaculatus. In higher concentrations the extract causing necrosis and in low doses the extract caused apoptosis.
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Estudo farmacognóstico e da toxicidade experimental (aguda e subaguda) do extrato etanólico da casca do guatambu (Aspidosperma subincanum Mart.)

Alves, Nilda Maria 05 March 2007 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2007. / Submitted by Aline Jacob (alinesjacob@hotmail.com) on 2010-02-25T15:02:40Z No. of bitstreams: 1 2007_NildaMariaAlves.PDF: 1456275 bytes, checksum: fef55b4105277c6121fc938fa18beb03 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-02-25T23:44:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_NildaMariaAlves.PDF: 1456275 bytes, checksum: fef55b4105277c6121fc938fa18beb03 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-25T23:44:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_NildaMariaAlves.PDF: 1456275 bytes, checksum: fef55b4105277c6121fc938fa18beb03 (MD5) Previous issue date: 2007-03-05 / Embora no Brasil existam normas e legislação para garantir a segurança e qualidade dos fitoterápicos, para muitas das plantas utilizadas popularmente, não há registros facilmente disponíveis de suas características macroscópicas ou de marcadores químicos. Dessa forma, informações que possam fornecer subsídios para a correta identificação e garantia dos três princípios fundamentais para um medicamento – qualidade, eficácia e segurança – são necessárias, principalmente para aquelas espécies que têm uso mais evidente no Brasil. O cerrado goiano é muito rico em espécies medicinais, que se devidamente utilizadas podem trazer benefícios substanciais, sobretudo às populações mais carentes. Uma das espécies utilizadas na região é o guatambu (Aspidosperma subincanum Mart.) no tratamento do diabetes e da hipercolesterolemia. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram o de realizar a caracterização farmacognóstica e avaliar a toxicidade pré-clínica (toxicidade aguda e subaguda) do extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum Mart.(EEAS). A caracterização farmacognóstica do guatambu, além de ser uma contribuição para a informação sobre plantas medicinais brasileiras, per si, forneceu parâmetros a serem empregados no controle de qualidade do guatambu utilizado como matéria prima na preparação de fitoterápicos. Os efeitos da administração oral aguda e subaguda do extrato etanólico de Aspidosperma subincanum Mart. foram investigados pelo método screening hipocrático, pelos parâmetros hematológicos e bioquímicos e pela análise histopatológica em ratos Wistar adultos e machos. Na avaliação da toxicidade aguda os animais foram tratados com doses únicas de EEAS (500, 1000, 2000, 3000 e 5000 mg/kg de peso) e observados por 24 horas, sendo que não foi observado qualquer sinal de toxicidade ou morte, o que sugere que o EEAS é praticamente atóxico em exposição aguda a altas doses. No estudo da toxicidade subaguda, os ratos foram tratados durante 30 dias consecutivos com EEAS por via oral nas doses de 125, 250, 500 mg/kg de peso. Os resultados mostraram que durante o período de tratamento, o EEAS provocou poucas alterações nos níveis séricos, assim como não houve modificações nos pesos dos animais. Na avaliação histopatológica EEAS provocou alterações celulares nos rins, pulmões e fígado em todas as doses avaliadas, caracterizando que tais órgãos foram lesados pela administração de EEAS. Entretanto, tais sinais de toxicidade demonstraram reversibilidade após 30 dias. Assim, nas condições experimentais, EEAS apresentou uma baixa toxicidade. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although in Brazil there are norms and legislation to guarantee the safety and quality of the phytotherapeutical, for many of the plants used popularly, there are not easily available registrations of their macroscopic characteristics or of chemical markers. In that way, information that can provide subsidies for the correct identification and guarantee of the three fundamental principles for a medicine is necessary - quality, effectiveness and safety - mainly for those species that have more evident use in Brazil. The savannah from the state of Goiás, Brazil, is very rich in medicinal species that, if properly used, can bring substantial benefits, especially to the poor populations. One of the species used in the area it is the guatambu (Aspidosperma subincanum Mart.) in the treatment of the diabetes and of the hypercholesterolemia. Thus, the objectives of this study were to accomplish the pharmacognostic characterization and to evaluate the pre- clinic toxicity (acute and sub-acute toxicity) of the ethanolic extract of the peel of the stem of Aspidosperma subincanum Mart. (EEAS). The pharmacognostic characterization of the guatambu, besides being a contribution for the information on Brazilian medicinal plants, itself, provided parameters to be applied in the quality control of the guatambu used as raw material in the preparation of the phytomedicinel. The effects of the acute and sub-acute oral administration of the ethanolic extract of Aspidosperma subincanum Mart. were investigated by the hippocratic screening method, by the hematological and biochemical parameters and by the histopathological analysis in Wistar mice - adults and males. In the evaluation of the acute toxicity the animals were treated with only doses of EEAS (500, 1000, 2000, 3000 and 5000 mg/kg of weight) and observed for 24 hours, considering that no sign of toxicity or death was observed, which suggests that EEAS is practically non-toxicant in acute exhibition to high doses. In the study of the sub-acute toxicity, the mice were treated orally for 30 consecutive days with EEAS in the doses of 125, 250, 500 mg/kg of weight. The results showed that during the treatment period, EEAS provoked few alterations in the serical levels, as well as there were not modifications in the weights of the animals. In the histopathological evaluation EEAS provoked cellular alterations in the kidneys, lungs and liver in all the doses evaluated, characterizing that such organs were harmed by the administration of EEAS. However, such toxicity signs demonstrated reversibility after 30 days. So, in the experimental conditions, EEAS presented a low toxicity.
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Clonagem e avaliação da toxicidade de proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis para populações de Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: noctuidae) e Aedes aegypti (Diptera: culicidae)

Dumas, Vinícius Fiuza 15 May 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-03-31T12:08:06Z No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:43:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:43:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_ViniciusFiuzaDumas.pdf: 2487859 bytes, checksum: 18a4a6f267ffbccc4a5f9c47d3328dc3 (MD5) Previous issue date: 2009-05-15 / Nas últimas décadas, a agricultura mundial vem crescendo exponencialmente. Culturas como as da soja recebem destaque por influenciar na geração de divisas e empregos em todo mundo. Essa cultura está vulnerável a diversas pragas, dentre estas, destaca-se a lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis Hübner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae), que é a principal desfolhadora da soja no Brasil. Além de provocar danos econômicos no setor agrícola, os insetos podem causar problemas relacionados à saúde pública. O principal exemplo é o Aedes aegypti, que é o vetor de doenças como a dengue e a febre amarela. Uma alternativa para o controle desses insetos é a utilização de agentes de controle biológico, como Bacillus thuringiensis (Bt). Essa bactéria possui a capacidade de produzir inclusões protéicas (proteínas Cry e Cyt) tóxicas para insetos e são largamente utilizadas no controle de pragas na agricultura e no controle de vetores de doenças humanas. Desta forma, o estudo do modo de ação e toxicidade dessas proteínas é importante para um melhor entendimento dos mecanismos de interação entre o patógeno e as pragas. Este trabalho teve como objetivo determinar a toxicidade de quatro proteínas Cry de B. thuringiensis para populações susceptíveis e resistentes de A. gemmatalis, e a construção de um baculovírus e de uma estirpe de Bt recombinantes contendo o gene cyt1Aa. Para o primeiro trabalho, as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa foram expressas individualmente por estirpes de Bt. As proteínas foram purificadas, solubilizadas, ativadas com tripsina e biotiniladas para a realização de bioensaios, ensaios de ligação e ensaios de competição heteróloga. O ensaio de ligação mostrou que ocorreu interação entre todas as proteínas e os receptores das duas populações de lagartas. O ensaio de competição heteróloga e os bioensaios demonstraram haver competição das proteínas pelos mesmos sítios de ligação para a população resistente de A. gemmatalis e que essa população tornou-se resistente, provavelmente, devido a alterações nos seus receptores. Além disso, os resultados obtidos nos bioensaios demonstraram que, apesar de todas as toxinas testadas apresentarem toxicidade para lagartas de segundo instar de A. gemmatalis, as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac possuem toxicidade elevada quando comparadas com as outras proteínas testadas. No segundo trabalho, o gene cyt1Aa da estirpe S1806 de B. thuringiensis subsp. israelensis, foi amplificado por PCR, clonado em um vetor de clonagem e seqüenciado. A análise da seqüência do gene mostrou 100% de identidade com o gene cyt1Aa depositado no GenBank. O gene foi removido do vetor de clonagem, introduzido em um vetor de transferência (pFastBacTM1) e transferido para o genoma do baculovírus AcMNPV, utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), originando o baculovírus recombinante vFastCyt1Aa. Entretanto, a expressão da proteína recombinante não foi detectada em células de inseto infectadas com o vFastCyt1Aa. Além disso, o gene cyt1Aa foi inserido em um vetor de expressão para células de Bt (pSVP27A) e o plasmídeo recombinante (pSVPcyt1Aa) foi introduzido em uma estirpe de Bt acristalífera. Uma proteína de 27 kDa correspondente ao tamanho esperado para a proteína recombinante Cyt1Aa foi detectada por SDS-PAGE e Western-Blot de extratos de Bt recombinante. Entretanto, o extrato do Bt recombinante mostrou baixa toxicidade para mosquitos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the last decades, the world agriculture has grown exponentially. Crops like soybean have an important role in increasing foreign exchange and jobs all over the world. However, this crop is vulnerable to a diversity of insect pests that cause great economic losses. Among these insect pests, the soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis Hubner, 1918 (Lepidoptera: Noctuidae) is the main defoliator of soybean in Brazil. Besides the economic damage in agriculture, insects can also cause public health problems. Aedes aegypti, the vector of the dengue and yellow fever diseases is the main example. One alternative to control this insect is the use of biological control agents such as Bacillus thuringiensis (Bt). This bacterium produces protein inclusions (Cry and Cyt proteins) that are toxic to insects and are widelly used for the control of insect pests in agriculture and for the control of human disease vectors. Therefore, the study of the toxins mode of action and toxicity has a great importance for understanding the mechanisms of interaction between insect pests and their patogens. The aim of this study was the toxicity determination of four Cry proteins of B. thuringiensis to resistant and susceptible A. gemmatalis populations, and the construction of recombinant baculovirus and Bt containing the cyt1Aa gene. For the first work, the proteins Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry2Aa were expressed individually by Bt strains. The proteins were purified, solubilized, activated with trypsin and biotinilated for bioassays, binding assays and heterologous competition assays. The binding assay showed binding affinities between all the proteins and the receptors in both populations of caterpillars. The heterologous competition assay and the bioassays showed competition between proteins for the same binding site in the resistant population of A. gemmatalis and this population became resistant probably because of modifications in their receptors. Besides that, the results of the bioassays demonstrate that Cry1Ab and Cry1Ac have higher toxicity to second instar larvae of A. gemmatalis when compared to the others toxins tested. In the second work, the cyt1Aa gene from the strain S1806 of B. thuringiensis subsp. israelensis was amplified by PCR, cloned in a vector and sequenced. The sequence analyses showed that the cloned gene from strain S1806 has 100% identity with a cyt1Aa gene deposited in GenBank. The gene was removed from the cloning vector, introduced into a transfer vector (pFastBacTM1) and transferred to the baculovirus genome AcMNPV, using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), originating the recombinant baculovírus vFastCyt1Aa. However, no recombinant protein expression was detected in insect cells infected with vFastCyt1Aa. Furthermore, the cyt1Aa gene was also inserted in an expression vector for Bt cells (pSVP27A) and the recombinant plasmid (pSVPcyt1Aa) introduced into an acrystalliferous strain of Bt. A 27 kDa protein of the expected size for the recombinant Cyt1Aa was detected by SDS-PAGE and Western-Blot in recombinant Bt extracts. However, the recombinant Bt extracts showed low toxicity towards mosquitoes.
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Avaliação toxicológica do óleo-resina de copaíba em ratos : estudos de toxidade aguda, neurotoxidade e embriofetotoxidade

Sachetti, Camile Giaretta 28 January 2010 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2010. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2011-06-13T19:31:58Z No. of bitstreams: 1 2010_CamileGiarettaSachetti.pdf: 1456123 bytes, checksum: 3413ee90934c482d79e2a06a50f5c289 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-27T14:19:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_CamileGiarettaSachetti.pdf: 1456123 bytes, checksum: 3413ee90934c482d79e2a06a50f5c289 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-27T14:19:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_CamileGiarettaSachetti.pdf: 1456123 bytes, checksum: 3413ee90934c482d79e2a06a50f5c289 (MD5) / Conhecida popularmente como copaíba, o gênero Copaifera L., Fabaceae, é uma das plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil. Embora haja vários estudos mostrando algumas das atividades farmacológicas desse óleo-resina, existem poucos trabalhos relacionados à sua toxicidade. No presente estudo, ratas Wistar foram expostas a diferentes doses do óleo-resina de Copaifera reticulata, via gavagem, dissolvida em Tween 80 2%, para se avaliar sua toxicidade aguda e neurotóxica, seu potencial tóxico durante o período gestacional e sua toxicidade embriofetal. O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nulíparas distribuídas em grupos de doses únicas de 300 e 2000 mg/kg p.c., conforme o Guia OECD-423/2001. Uma hora após a administração, os animais foram avaliados quanto à função comportamental, motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em Cruz Elevado. A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mg/kg p.c e não houve sinais clínicos de toxicidade ou neurotoxicidade, indicando uma baixa toxicidade aguda. A toxicidade do óleo-resina no desenvolvimento embriofetal em ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 414/2001. Ratos prenhes foram distribuídas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fêmeas cada, e a partir do 6° dia de gestação (DG) iniciou-se a administração do óleo resina nas doses de 500, 1000 e 1250 mg/kg e grupo controle. No 20º DG, as fêmeas foram sacrificadas por inalação de CO2. Os seguintes parâmetros foram avaliados: peso materno corpóreo; consumo de ração; peso do fígado, rins, cérebro e útero; número de reabsorções; número de corpos lúteos; número de fetos vivos e mortos; peso dos fetos e suas respectivas placentas; peso dos rins, baço, fígado, timo, coração e pulmão dos fetos; avaliação externa, visceral e esquelética da prole; e exame macro e microscópico do fígado, rim direito e esquerdo e cérebro das fêmeas adultas. Todos os animais sobreviveram nesse estudo, e nenhuma alteração comportamental foi evidenciada, bem como não foi encontrada qualquer alteração histopatológica significativa nos órgãos das fêmeas. O óleo-resina de copaíba foi tóxico para o organismo materno nas doses de 1000 e 1250 mg/kg, evidenciado pela redução no ganho de peso corpóreo e pela diminuição no consumo de ração. Nas maiores doses, o óleo-resina também afetou o desenvolvimento embriofetal, causando retardo no crescimento fetal, evidenciado pela diminuição do peso da prole. Uma ingestão oral segura de 5 mg/kg pc/dia para mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mg/kg pc/dia. Não houve aumento da freqüência de malformações viscerais e/ou esqueléticas grosseiras nos fetos, indicando que o produto não é teratogênico em ratos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Popularly known as copaiba, the genus Copaifera L., Fabaceae, is one of the medicinal plants most known and used in Brazil. Although there are several studies showing some of the pharmacological activities of this oil, there are few studies related to its toxicity. In this study, female Wistar rats were exposed orally to different doses of Copaifera reticulata oilresin, dissolved in Tween 80 2%, to evaluate its acute toxicity and neurotoxicity, its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity. The study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single doses of 300 e 2000 mg/kg b.w., according to Guide OECD-423/2001. One hour after administration, the animals were evaluated for functional behavioral, motor and sensory function in open-field test and elevate plus-maze test. The acute lethal dose was estimated as greater than 2000 mg/kg b.w. and there were no clinical signs of toxicity or neurotoxicity, indicating a low acute toxicity. The toxicity of the oilresin on fetal development was evaluated according to OECD Guide 414/2001. Pregnat rats were randomly distributed in 4 groups of 25 females each, and the administration of the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500, 1000 and 1250 mg/kg, plus the control group. In the 20th DG, the females were sacrificed by CO2 inhalation. The following parameters were evaluated: maternal body weight; food intake; weight of liver, kidney, brain and uterus; number of resorptions, number of corpora lutea; live and dead fetuses; weight of fetuses and their placentas; weight of fetus kidneys, liver, spleen, thymus, heart and lung; external, visceral and skeletal evaluation of the offsprings. The liver, kidney and brain were examined visually and microscopically. All animals survived the study. No abnormal behaviour was observed and no significant pathological changes in the female organs were found. The copaiba oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mg/kg as evidenced by decrease in body weight and decreased feed intake. At the higher doses, the oil-resin also affected the developing embryo, causing fetal growth retardation, evidenced by decreased in body weight of the offsprings. A safe oral dose of 5 mg/kg bw/day for pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mg/kg bw/day. There was no increased in the frequency of visceral and/or skeletal gross fetus malformations, indicating that the product is not teratogenic in rats.
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Caracterização eletrofisiológica dos peptídeos To4 E To5, duas β-toxinas presentes na peçonha do escorpião Tityus obscurus

Morales Duque, Harry 24 May 2017 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-10-25T11:17:38Z No. of bitstreams: 1 2017_HarryMoralesDuque.pdf: 4563170 bytes, checksum: c4e65c2f9e037eeb6f5786fa0c41a04a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-30T19:39:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_HarryMoralesDuque.pdf: 4563170 bytes, checksum: c4e65c2f9e037eeb6f5786fa0c41a04a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-30T19:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_HarryMoralesDuque.pdf: 4563170 bytes, checksum: c4e65c2f9e037eeb6f5786fa0c41a04a (MD5) Previous issue date: 2017-10-30 / Toxinas de escorpiões têm sido alvo de pesquisa dada suas propriedades farmacológicas. Estas toxinas agem sobre quatro tipos de canais iônicos (Na+ , K+ , Ca++ e Cl- ). As que agem sobre os canais iônicos para sódio (NaScTx) são divididas em dois grupos α- ou β-toxinas segundo seu alvo molecular dentro desses canais iônicos. As primeiras interferem na cinética de inativação e as do segundo grupo afetam a cinética de ativação do canal iônico alvo. Muitas destas toxinas já foram identificadas e testadas sobre diferentes alvos farmacológicos. A maioria é proveniente de escorpiões da família Buthidae, conhecidos como os escorpiões de relevância médica devido à capacidade toxica de sua peçonha. No entanto, ainda falta elucidar sobre toxinas das peçonhas de espécies potencialmente perigosas à saúde humana. A pesquisa de toxinas está sendo promissora para diversos estudos e desenvolvimento biotecnológico. Dado que a maioria age sobre canais iônicos, elas se tornam ferramentas para estudar interações ou mecanismos moleculares de ação desses alvos. Portanto, as toxinas podem favorecer direta ou indiretamente no desenvolvimento de estratégias para tratar, por exemplo, doenças como as canalopatias. Tityusobscurus é um escorpião que ocorre no norte do Brasil, onde acontecem acidentes por sua picada. Os componentes de sua peçonha estão sendo pesquisados e os alvos farmacológicos das NaScTxs descritas ainda não foram identificados. Neste trabalho, pela primeira vez, duas NaScTxs (To4 e To5) foram purificadas da peçonha de T. obscurus por cromatografia RP-HPLC, sequênciadas por in-sourcedecay ISD e por meio da biblioteca de cDNA previamente descrita. A validação do alvo molecular especifico destas toxinas foi realizada testando sete subtipos de canais iônicos humanos hNav1.1 – hNav1.7 usando a técnica eletrofisiológica de patch clamp. Adicionalmente, tentou-se expressar a toxina To5 heterólogamente em Escherichia coli, visando comparar a atividade eletrofisiológica desta com a nativa. Nossos resultados mostraram que tanto a To4, quanto a To5 são β-toxinas que afetam a ativação e correntes de todos os canais iônicos testados. Estas toxinas não mostraram algum efeito tipo α, assim, descarta-se a possibilidade de estas agirem sobre outro sitio destes canais testados. Futuros testes eletrofisiológicos poderão ser feitos sobre canais iônicos próprios de inseto, já que estas duas toxinas potencialmente agem nos dois grupos taxonômicos. Dada sua capacidade promiscua sobre os hNavs testados, as toxinas To4 e To5 mostram ser componentes virtualmente tóxicos da peçonha deste escorpião. Estes e outros componentes dessa peçonha tornam do T. obscurus, um escorpião potencialmente perigoso à saúde humana. / Scorpion toxins have been research targets due its pharmacological properties. They can target four ion-channels types (Na+ , K+ , Ca++ e Cl- ). Such toxins active on sodium channels (NaScTx) have two interaction points on them, thus being classified as α- or β-toxins. The first group interferes with the kinetic inactivation, and the second group affects the kinetic activation from sodium channels (Navs). Several toxins were identified and tested on pharmacological targets. Most of these are from Buthidae scorpion family, a taxonomic group considered as of medical relevance. It is necessary to elucidate toxins from potentially dangerous scorpion venom species yet not described. The toxins study is being promissory to diverse research and biotechnological development. Due that the most of them target on ion channels, they would become tools to ion channels interaction studies or action molecular mechanisms analysis of them. Thus, toxins could promote direct or indirectly the strategies development to treat, for example, diseases as channelopathies. Tityus obscurus scorpion from north of Brazil is cause of accidents for sting. Its venom components are being investigated, among them, the described NaScTxs do not have the target Navdefined. By first time, in this work, two T. obscurusNaScTxs (To4 e To5) were purified from venom by RP-HPLC chromatography, sequenced by in-source decay ISD and by cDNA library previously described. The specific molecular target validation was testing the human Navs (hNav1.1 – hNav1.7) by electrophysiological technique patch clamp. Additionally, To5 toxin was expressed in Escherichia coli to perform futures electrophysiological tests. Our results showed than To4 and To5 are β-toxins affecting the both activation and ionic currents from all hNavs isoforms tested. These toxins did not show α- activity discarding other possible target site on these hNavs. Electrophysiological tests on insect Navs are recommended because these toxins are potentially active on them. The promiscuous capacity of the To4 and To5 toxins on hNavs make of them compounds potentially toxic to humans. The T. obscurus venom would be potentially dangerous to human health.
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Quantificação de substâncias com atividade estrogênica e caracterização da toxicidade embriolarval em zebrafish (Danio rerio) nos efluentes das estações de tatamento de esgotos sul e norte e no Lago Paranoá, Brasília-DF

Silva, Sandra Rita 10 July 2015 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2015-11-27T13:53:54Z No. of bitstreams: 1 2015_SandraRitaSilva.pdf: 5588058 bytes, checksum: d10d68d2a8dd77637b85e001313eaba5 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-04T12:45:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_SandraRitaSilva.pdf: 5588058 bytes, checksum: d10d68d2a8dd77637b85e001313eaba5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T12:45:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_SandraRitaSilva.pdf: 5588058 bytes, checksum: d10d68d2a8dd77637b85e001313eaba5 (MD5) / O lançamento de esgoto doméstico em corpos hídricos resulta na deposição de vários poluentes, entre eles os chamados poluentes emergentes. Dentre esses destacam-se os interferentes endócrinos (IEs), agentes exógenos que mimetizam os hormônios naturais ativando ou bloqueando vias de sinalização que desencadeiam a função hormonal. Esses poluentes têm sido encontrados em amostras ambientais do mundo todo, incluindo o Brasil, em baixas concentrações, causando efeitos aos organismos expostos. Nesse contexto, os objetivos do presente trabalho foram: investigar a ocorrência de três poluentes emergentes com atividade estrogênica -17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e bisfenol A (BPA) em amostras de água do Lago Paranoá e de efluentes das Estações de Tratamento de Esgoto (ETEs) Sul e Norte, Brasília-DF; verificar a toxicidade das amostras e do poluente mais frequentemente detectado (BPA), através de ensaios de exposição em embriões de Danio rerio e da avaliação de marcadores bioquímicos e, por fim, comparar os resultados obtidos com concentrações de efeito para animais aquáticos do primeiro e do segundo níveis tróficos descritos na literatura. Para as análises de quantificação, as amostras foram processadas por extração em fase sólida (SPE) e submetidas a um método analítico desenvolvido em HPLC/DAD/FL. A fase móvel utilizada na separação foi acetonitrila com água na proporção 40:60 (v/v), acidificadas com ácido trifluoracético (0,12%), em condição isocrática. Os ensaios de toxicidade seguiram o protocolo OCDE nº 236 (Guideline on Fish Embryo Toxicity Test-FET). As determinações enzimáticas foram feitas em espectrofotômetro usando microplacas de 96 poços. Os resultados obtidos revelaram que o BPA é o contaminante mais predominante, com frequência de detecção de 100% nas amostras de esgoto tratado e 23% nas amostras de água superficial. As concentrações obtidas variaram entre ˂394 ng L-1 e 1231 ng L-1 no efluente e entre ˂197 ng L-1 e 644 ng L-1 nas amostras do Lago. Os demais compostos, E2 e EE2, apresentaram baixa frequência de detecção (<18%), sendo que, em apenas uma amostra de efluente, o EE2 pode ser quantificado, apresentando concentração de 591 ng L-1. Os testes de toxicidade demonstraram que as amostras de água do Lago Paranoá e efluente da ETE Sul não apresentam toxicidade para embriões de Danio rerio, no que se refere aos parâmetros analisados; o BPA é pouco tóxico (CL50 de 13,45 mg L-1) além de ser rapidamente degradado em meio aquoso (4 - 5 dias). No entanto, efeitos na eclosão (CEO = 10 mg L-1), atraso na pigmentação e na formação crânio-facial (CEO = 21,54 mg.L-1) e inibição da GST (CEO = 11,68 μg L-1) foram observados nos embriões expostos a BPA. Os níveis em que os três poluentes foram encontrados nas amostras estão entre as concentrações de efeito relatadas na literatura para animais aquáticos do primeiro e do segundo níveis tróficos, com exceção do BPA, onde as concentrações obtidas estiveram acima das CEO descritas para consumidores primários. Além disso, dados da literatura sugerem que o BPA tende a ser menos tóxico quando comparado ao E2 e EE2, de onde se conclui que, apesar de ser o composto mais frequentemente detectado nas amostras, o BPA é o que apresenta menor toxicidade para animais aquáticos. Os dados obtidos contribuem para ampliar o banco de dados relacionado à presença de contaminantes com atividade estrogênica no Lago Paranoá e nos efluentes ETEs, além de fornecer ferramentas para a avaliação da toxicidade das amostras. Considerando que em breve o Lago Paranoá será utilizado para abastecimento de água de parte da população do DF, esses resultados deverão auxiliar na tomada de decisões referentes aos processos de tratamento a serem implantados. / Sewage release results in the disposal of various pollutants in water bodies, including the so-called emerging pollutants. Among these are the endocrine disrupters, exogenous agents that mimic the natural hormones binding to cell receptor sites activating or blocking cell signaling pathways that trigger hormone function. These pollutants have been found in environmental samples all over the world, including Brazil, at low concentrations causing effects to exposed organisms. In this context, the aims of this study were to investigate the occurrence of three emerging pollutants with estrogenic activity (17β-estradiol-E2, 17α-ethinylestradiol-EE2 and bisphenol A-BPA) in water samples from Paranoá Lake and effluent of Sewage Treatment Plants (STPs), North and South, in Brasília-DF; Evaluate the toxicity of both environmental samples as the pollutant most frequently detected (BPA) to zebrafish embryonic development. In addition, it was tested, in the same animal model, sub lethal doses of BPA by biochemical markers. Finally, the environmental concentrations detected were compared with effect concentrations, described in literature, for aquatic animals from the first and second trophic levels. In the quantification analysis, samples were processed by solid phase extraction (SPE) and subjected to an analytical method developed in HPLC/DAD/FL. In this case, the mobile phase was acetonitrile with water in the ratio 40:60 (v/v), acidified with trifluoroacetic acid (0,12%) in isocratic condition. All the toxicity assays was performed following the OECD Protocol 236 (Guideline on Fish Embryo Toxicity Test-FET). The results showed that BPA was the most predominant pollutant in analyzed samples, with 100% of detection in the treated wastewater and 23% in surface water. The concentrations found were between <394-1231 ng L-1 in the effluent and <197-644 ng L-1 in Lake samples. Other compounds, E2 and EE2, showed low frequency of detection (<18%) in both Lake and effluent samples and, for only one effluent sample, EE2 was quantified in concentration of 591 ng L-1.Toxicity tests showed that water samples from Paranoá Lake and South STP effluent were no toxic to zebrafish embryos; BPA is slightly toxic to zebrafish embryos (LC50 13.45 mg L-1) and was rapidly degraded in an aqueous medium (4 - 5 days). However, effects on hatching (CEO = 10 mg L-1), delayed pigmentation, craniofacial formation (CEO = 21.54 mg L-1) and inhibition of GST (CEO = 11.68 ug L-1) were observed in embryos exposed to BPA. In addition, the levels at which the three pollutants were found in the analyzed samples are among the effects concentrations reported in the literature for aquatic animals of the first and second trophic levels, with the exception of BPA for primary consumers. Moreover, the literature suggests that BPA tends to be less toxic than E2 and EE2. It follows that, despite being the most often detected in samples, BPA is the one with less toxicity to aquatic animals. This data contribute to enlarge the database related to the presence of contaminants with estrogenic activity on Paranoá Lake and the effluent of the main treatment plants, which discharge into Lake, as well as, provide tools for assessing the toxicity of the water Lake and the Sewage Treatment Plants. Considering that, the Paranoá Lake will be used to supply water to part of the DF population, these results should also assist in the selection of the most appropriate water treatment processes.

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