Ce travail porte sur le développement de sondes peptidiques pour le suivi de la protéolyse par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) et pour l'imagerie in vivo par résonance magnétique rehaussée de l’effet Overhauser (OMRI). Plus précisément, ce travail étudie pour la première fois une famille d’agents d’imagerie appelée « nitroxyde à déplacement de raies spectrales » spécifique d’activités enzymatiques. L'activité protéolytique, entraînant un décalage de 5 G dans les constantes de couplages hyperfins, permet une quantification individuelle des espèces substrat et produit par RPE et une excitation sélective par OMRI. Trois substrats ont été élaborés, montrant une spécificité enzymatique pour l’élastase du neutrophile (NE) (MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-Nitroxyde & Suc-Ala-Ala-Pro-Val-Nitroxyde), et pour la chymotrypsine et la cathepsine G (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Nitroxyde). Les constantes enzymatiques ont montré de bonnes valeurs avec globalement, Km = 28 ± 25 µM et kcat = 19 ± 3 s-1. Ex vivo, l’utilisation des substrats NE en OMRI a révélé un contraste élevé dans les lavages broncho-alvéolaires de souris sous stimulus inflammatoire. Les rehaussements de signaux IRM sont en corrélation avec la sévérité de l’inflammation. L'irradiation à la fréquence RPE de 5425,6 MHz a permis d'accéder à la bio-distribution des substrats in vivo et pourrait ainsi servir d’outil diagnostic. Les perspectives à moyen terme de ce travail reposent sur le développement de l’OMRI à très faibles champs magnétiques en vue d’une application chez l’homme. / This work focuses on substrate-based probes for proteolysis monitoring by Electron Paramagnetic Resonance spectroscopy (EPR) and for in vivo imaging by Overhauser-enhanced Magnetic Resonance (OMRI). More precisely, this work investigates for the first time a family of MRI agents named “line-shifting nitroxide” specific for proteolytic activities. Proteolytic action results in a shift of 5 G in EPR hyperfine coupling constants allowing individual quantification of substrate and product species by EPR and selective excitation by OMRI. Three substrates were worked out, showing enzymatic specificity for neutrophil elastase (MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-Nitroxide & Suc-Ala-Ala-Pro-Val-Nitroxide), and for Chymotrypsin/Cathepsin G (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Nitroxide). Enzymatic constants were remarkably good with globally Km = 28 ± 25 µM and kcat = 19 ± 3 s-1. Ex vivo, the use of NE substrates in OMRI revealed a high contrast in bronchoalveolar lavages of mice under inflammatory stimulus. MRI signal enhancements correlate with the severity of inflammation. Irradiation at the RPE frequency of 5425.6 MHz provided access to the bio-distribution of substrates in vivo and could thus serve as a diagnostic tool. The medium-term perspectives of this work are based on the development of OMRI with very low magnetic fields for human application

Les dépôts intracellulaires de la protéine Tau agrégée sont la caractéristique commune des tauopathies, une famille de maladies neurodégénératives dont fait partie la maladie d’Alzheimer. Alors que les isoformes de Tau contenant trois (3R) ou quatre (4R) domaines de liaison aux microtubules sont retrouvées à des niveaux similaires dans le cerveau des individus sains, elles diffèrent au sein des inclusions intracellulaires en fonction des tauopathies. Notre étude repose sur l’identification de déterminants structuraux communs et distincts de fibres de Tau 3R et 4R. Pour cela deux approches de protéomique structurale complémentaires ont été mises au point à partir de fibres de Tau 1N3R et 1N4R produites in vitro. La première stratégie, reposant sur l’utilisation de protéolyses ménagées, nous a permis d’identifier les fragments protéolytiques qui composent un « code-barre » moléculaire propre à chaque assemblage. La seconde stratégie a utilisé un marquage chimique covalent des lysines accessibles suivi de l’analyse qualitative et quantitative des acides aminés marqués par spectrométrie de masse. Nous avons ainsi pu montrer que la partie N-terminale de la protéine était accessible au sein des fibres 1N3R et 1N4R tandis que la région C-terminale de la protéine est protégée pour Tau 1N3R et accessible au solvant pour Tau 1N4R. Nos résultats ouvrent la voie à de nouveaux outils moléculaires pour discriminer les tauopathies. / Intracellular deposits of Tau protein aggregates are the common hallmark of tauopathies, a range of neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease. Levels of tau with three (3R) or four (4R) microtubule binding repeats are found similar in the normal adult brain, whereas they differ in neuropathological intracellular Tau inclusions, according to the type of tauopathy. Our study consists of the identification of common and different structural molecular determinants of 3R and 4R Tau fibrils. To this end, two proteomic approaches were optimized using 1N3R and 1N4R recombinant fibrils. The first strategy, using limited proteolysis, allowed us to identify the proteolytic fragments composing the molecular “bar-code” for each type of fibril. The second strategy we optimized used chemical covalent surface labelling of accessible lysines, and qualitative and quantitative analysis of the biotinylated residues using mass spectrometry. We show that, while the N-terminal part of the protein remains accessible within 1N3R and 1N4R fibrils, the C-terminal region is protected within 1N3R yet solvent accessible for 1N4R assemblies. Our results pave the way to new molecular tools to discriminate tauopathies.

Les dynorphines sont des neuropeptides importants avec un rôle central dans la nociception et l’atténuation de la douleur. De nombreux mécanismes régulent les concentrations de dynorphine endogènes, y compris la protéolyse. Les Proprotéines convertases (PC) sont largement exprimées dans le système nerveux central et clivent spécifiquement le C-terminale de couple acides aminés basiques, ou un résidu basique unique. Le contrôle protéolytique des concentrations endogènes de Big Dynorphine (BDyn) et dynorphine A (Dyn A) a un effet important sur la perception de la douleur et le rôle de PC reste à être déterminée. L'objectif de cette étude était de décrypter le rôle de PC1 et PC2 dans le contrôle protéolytique de BDyn et Dyn A avec l'aide de fractions cellulaires de la moelle épinière de type sauvage (WT), PC1 -/+ et PC2 -/+ de souris et par la spectrométrie de masse. Nos résultats démontrent clairement que PC1 et PC2 sont impliquées dans la protéolyse de BDyn et Dyn A avec un rôle plus significatif pour PC1. Le traitement en C-terminal de BDyn génère des fragments peptidiques spécifiques incluant dynorphine 1-19, dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7 et Dyn A génère les fragments dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7. Ils sont tous des fragments de peptides associés à PC1 ou PC2. En plus, la protéolyse de BDyn conduit à la formation de Dyn A et Leu-Enk, deux peptides opioïdes importants. La vitesse de formation des deux est réduite de manière significative dans les fractions cellulaires de la moelle épinière de souris mutantes. En conséquence, l'inhibition même partielle de PC1 ou PC2 peut altérer le système opioïde endogène. / Dynorphins are important neuropeptides with a central role in nociception and pain alleviation. Many mechanisms regulate endogenous dynorphin concentrations, including proteolysis. Proprotein convertases (PCs) are widely expressed in the central nervous system and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue. The proteolysis control of endogenous Big Dynorphin (BDyn) and Dynorphin A (Dyn A) levels has a profound impact on pain perception and the role of PCs remain unclear. The objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis control of BDyn and Dyn A levels using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1-/+ and PC2-/+ animals and mass spectrometry. Our results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 are involved in the proteolysis regulation of BDyn and Dyn A with a more important role for PC1. C-terminal processing of BDyn generates specific peptide fragments Dynorphin 1-19, Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7 and C-terminal processing of Dyn A generates Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7, all these peptide fragments are associated with PC1 or PC2 processing. Moreover, proteolysis of BDyn leads to the formation of Dyn A and Leu-Enk, two important opioid peptides. The rate of formation of both is significantly reduced in cellular fractions of spinal cord mutant mice. As a consequence, even partial inhibition of PC1 or PC2 may impair the endogenous opioid system.

L’exposition à une situation d’hypokinésie induit une atrophie fonctionnelle et phénotypique du musclesquelettique. Différents mécanismes sont suggérés contribuer à ce phénomène de plasticité musculaire,incluant en particulier des modifications de l’homéostasie calcique et de la production d’espèces réactivesde l’oxygène qui, en relation avec certains processus inflammatoires, activeraient des voies d’apoptose etde protéolyse musculaire. Le présent travail a porté un intérêt spécifique à ces phénomènes dans le cadrede l’atrophie musculaire induite par une hypokinésie ainsi que dans la récupération après cessation de ceprotocole. À l’aide d’approches cellulaires nous montrons que l’extrusion du calcium cytoplasmique estconsidérablement ralentie dans les fibres musculaires atrophiées. Cet effet, lié au moins en partie à unecontribution altérée des mitochondries, pourrait jouer un rôle dans l’activation de voies protéolytiquescalcium-dépendantes. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’évolution du niveau de stressoxydant et de l’expression de différentes cytokines ainsi que de marqueurs de la voie apoptotiquecaspase-dépendante et de la protéolyse musculaire au cours du phénomène de récupération après la fin del’hypokinésie. Les résultats montrent que le retour à la normale de la masse musculaire est facilité lors dela phase précoce (1-5 jours) de récupération via la modulation de l’apoptose mitochondriale et de laprotéolyse musculaire. Par contre le stress oxydant et la voie apoptotique impliquant TNF-a persistentjusqu’à 14 jours de récupération, alors que la masse musculaire est déjà reconstituée. / Exposure to hypokinesia induces a functional and phenotypic atrophy of skeletal muscle. Several types ofmechanisms have been suggested to contribute to this plasticity phenomenon, including changes inintracellular calcium handling and in production of reactive oxygen species which, together withinflammatory processes, would activate muscle apoptosis and proteolysis pathways. The present workspecifically focussed on these mechanisms within the framework of a model of hypokinesia-inducedatrophy and of recovery from this atrophy. Measurements on isolated muscle cells revealed that the rateof myoplasmic calcium extrusion was considerably reduced in atrophied muscle fibres. This effect whichappears to be, at least in part, related to an altered mitochondrial contribution, may play a pivotal role inthe activation of calcium-dependent proteolysis pathways. We then studied the time course of changes inoxidative stress as well as in the expression level of several cytokines and proteins specifically involvedin proteolysis and caspase-dependent apoptotic pathways, along the course of recovery from atrophy. Ourresults demonstrate that, at early stages (1-5 days) of recovery, muscle re-growth is mediated via themodulation of mitochondrial-driven apoptosis and muscle proteolysis. In contrast, oxidative stress and theTNF-a related apoptotic pathway remain activated until late stages (14 days) of recovery, at a time whenmuscle mass has already recovered.

Les aminopeptidases représentent un groupe d’enzymes qui possèdent une fonction cellulaire clef dans les mécanismes physiologiques et pathologiques. Elles interviennent dans la cascade enzymatique après l’action des endoprotéases, dans l’homéostasie au travers le renouvellement du pool d’acides aminés, dans le métabolisme énergétique, la régulation de l’activité des peptides bioactifs, la présentation antigénique ainsi dans une diversité de mécanismes pathologiques tels que les maladies neurologiques et les infections virales et parasitaires. Les aminopeptidases TETs sont capables de former des macro-assemblages tétraédriques comprenant douze sous-unités. En vue de mieux comprendre leur fonction biologique et leur mode d'action, nous avons étudié les propriétés fonctionnelles et structurales de deux nouveaux complexes TETs issus d'archées hyperthermophiles. L'archée hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii ne possède qu'une version de TET (MjTET) qui a été produite dans Escherichia coli et purifiée sous forme de dodécamère. La recherche de son activité enzymatique et de ses substrats peptidiques par des tests chromogéniques et fluorogéniques, ainsi que des études par HPLC en phase inverse, montre que cette enzyme est une leucine aminopeptidase activée par le cobalt se distinguant des autres aminopeptidases M42 par son très large spectre d'action qui s'étend aux résidus aromatiques. Une structure complète de cette aminopeptidase a été résolue en combinant la cristallographie (2.4 Å) et la cryo-EM (4,1 Å). L'analyse de la poche de spécificité de MjTET permet de mieux comprendre les bases structurales de la discrimination de substrat chez les TETs. De plus, l'analyse de la structure interne de la particule permet de proposer un nouveau mécanisme de navigation des peptides à l’intérieur des particules tétraédriques de la famille TET.L'archée hyperthermophile Pyrococcus horikoshii comporte trois types de complexes TETs. L'étude d'une protéine présentant ~20 % d'identité avec ces systèmes, nous a permis d'identifier une quatrième version du système TET dans cet organisme : PhTET4. La protéine recombinante a été purifiée. Elle forme un complexe dodécamérique tétraédrique. Les études biochimiques révèlent que l'enzyme possède une spécificité très étroite dirigée exclusivement vers l'hydrolyse des résidus glycines de l'extrémité N-terminale des peptides. De plus, elle estactivée par le nickel. Ces caractéristiques permettent de proposer que, chez les archées, la multiplication et la spécialisation des enzymes TETs seraient associées au caractère hétérotrophes alors que le système des archées autotrophes se réduirait à une TET unique apte à assurer une fonction de « ménage ». / Aminopeptidases represent a group of enzymes displaying key cellular function inphysiological and pathological mechanisms. They are involved in the enzymatic cascade beyond the action of endoproteases, in homeostasis through the renewal of the amino acid pool, in the energy metabolism, in the regulation of bioactive peptide activities, in the antigen presentation and in a diversity of pathological mechanisms such as neurological diseases as well as viral and parasitic infections. Aminopeptidases TET are able of forming tetrahedral macro-assemblies built by twelve subunits. In order to better understand their biological function and their mode of action, we studied the functional and structural properties of two novel TET complexes derived from hyperthermophilic archaea. The hyperthermophilic archaeon Methanocaldococcus jannaschii has only one version of TET (MjTET) that was produced in Escherichia coli and purified as dodecameric macromolecule. The search for its enzymatic activity and peptide substrates by using chromogenic/fluorogenic assays and reverse phase HPLC studies, demonstrated that this enzyme is a cobalt-activated leucine aminopeptidase, discriminated from other M42 aminopeptidases by its very broad activity spectrum, that extends to aromatic residues. Complete structure of this aminopeptidase was determined by combining X-ray crystallography (2.4 Å) and cryo-electron microscopy (4.1 Å). Analysis of MjTET specificity pocket indicated possible molecular bases for substrate discrimination in TET peptidases. In depth investigation of the particle internal structure allowed to propose a novel peptide trafficking mechanism for the TET family tetrahedral particles. Three types of TET complexes are present in the hyperthermophilic archaea, Pyrococcus horikoshii. The study of an unassigned protein displaying ~20% identity with the PhTETs systems allowed us to identify a fourth version of TET complex in this organism: PhTET4. The recombinant protein was purified. It formed tetrahedral dodecameric complex. Biochemical studies indicated that the enzyme has a very narrow hydrolytic specificity directed exclusively toward the peptide N-terminal glycine residues. In addition, this enzyme is activated by nickel ions. These features allowed proposing that, in archaea, the multiplicity of specialized TET systems could be associated with heterotrophy while unique TET system displaying “housekeeping” function is present in autotrophic organisms.

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La compréhension de la fonction des protéines et des systèmes biologiques passe par une connaissance fine des mécanismes moléculaires sous-jacents. La cristallographie et la résonance magnétique nucléaire permettent d'appréhender ces mécanismes au niveau atomique en fournissant des informations sur la structure et sur la dynamique des macromolécules biologiques. Nous nous sommes ainsi intéressés à deux protéines, la lipase lip2 de la levure Yarrowia lipolytica et la protéine membranaire OmpA de la bactérie Klebsiella pneumoniae. Nous avons recherché des conditions d'expression de la protéine lip2 marquée uniformément ou spécifiquement sur une boucle (appelée " lid ") afin d'en étudier la dynamique. Des conditions de marquage uniforme à l'azote 15 de lip2 recombinante dans Yarrowia lipolytica ont été mises au point, mais le marquage acide aminé spécifique n'a pu être réalisé à cause de phénomènes de dilution isotopique trop importants dans cette levure. Nous avons résolu par cristallographie aux rayons X la structure du domaine C-terminal de la protéine OmpA et étudié sa dynamique en solution par RMN (techniques de relaxation 15N). Nous avons caractérisé la dynamique de son domaine N-terminal membranaire reconstitué en liposomes par RMN du solide : en utilisant la rotation à l'angle magique à 60kHz et à la détection 1H sur un spectromètre 1 GHz, nous avons pu attribuer une majorité des résonances du tonneau ? et établir un profil de paramètre d'ordre des vecteurs NH. Des expériences de protéolyse ménagée ont révélé par ailleurs un site de coupure unique à la trypsine au sein de la boucle extracellulaire L3. Enfin, une première caractérisation de la protéine complète exprimée dans la membrane externe d'Escherichia coli a été entreprise par RMN du solide sur membranes externes natives. / Understanding the function of proteins and biological systems requires an accurate knowledge of the underlying molecular mechanisms. Crystallography and nuclear magnetic resonance provide a detailed description of these mechanisms, with an atomic resolution, by providing data on both structures and motions. We investigated two proteins, the lip2 lipase from the yeast Yarrowia lipolytica and the membrane protein OmpA from the bacteria Klebsiella pneumoniae. We tried to produce lip2 with uniform and amino-acid specific stable isotope labelling on its functional loop (the lid) for NMR experiments. The homologous recombinant expression in Yarrowia lipolytica turned out to be the most efficient for uniform labelling but failed for specific labelling due to extensive isotope scrambling. We solved the structure of OmpA C-terminal domain by X-ray crystallography, and analyzed its dynamics in solution by NMR (15N relaxation techniques). We characterized its transmembrane N-terminal domain in proteoliposomes by solid state NMR: using state of the art ultra-fast MAS (60 kHz), 1H detection and a 1 GHz spectrometer, we could assign most ?-barrel resonances and establish a NH order parameter profile. In a complementary approach, we used proteolysis to reveal a unique trypsin cleavage site on the extracellular loop 3. Finally, a first characterization of the full-length protein expressed in the outer membrane of Escherichia coli was initiated by solid state NMR on intact outer membranes.

Les peptides appartenant à la famille des tachykinines telle que la substance P (SP) sont des acteurs essentiels contribuant à l’hyperalgésie primaire et secondaire. La SP libérée par les neurones afférents primaires, ne provoque pas à elle seule des décharges nociceptives, mais elle potentialise l’effet de divers neurotransmetteurs tel que le glutamate. Pour ces différentes raisons, de nombreuses recherches ont été effectuées avec des antagonistes des récepteurs neurokinines et en particulier des récepteurs NK1. Cependant, malgré des études pré-cliniques prometteuses, les antagonistes du récepteur NK1 n’ont pas montré d’effet significatif chez l’Homme. La biosynthèse des neuropeptides actifs passe par la maturation protéolytique des pro-neuropeptides. La compréhension des mécanismes de la maturation enzymatique des précurseurs des tachykinines, ainsi que l’étude de la stabilité métabolique de la substance P (SP) permettraient d’élucider des stratégies de traitement innovateur en favorisant l’inhibition du processus de maturation ou la production de fragments peptidiques moins actifs ou inactifs. Le premier objectif de cette étude était d’élucider le rôle de la Proproteine convertase 1 (PC1) et de la Proproteine convertase 2 (PC2) dans la maturation de la protachykinine en utilisant des fractions S9 de la moelle épinière des souris du type sauvage (WT), PC1-/+ et PC2-/+. La caractérisation et la quantification des neuropeptides ont été réalisées à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance et de la spectrométrie de masse. Les résultats montrent que PC1 et PC2 interviennent dans la maturation de la protachykinine et ces deux enzymes sont essentielles pour la biosynthèse de la Tachykinine58-71, le précurseur de la SP. Une réduction de plus de 50% de la vitesse de formation dans les fractions S9 de la moelle épinière de souris mutantes PC1 et PC2 a été observée. Les résultats obtenus révèlent que PC1 et PC2 sont impliquées dans la protéolyse de la protachykinine et suggèrent un rôle important de ces enzymes dans la maturation de la protachykinine-1. La protéolyse régule probablement les concentrations extracellulaires de la SP, mais peu d'études ont été menées sur le métabolisme des tachykinines. Dans ce présent travail, nous démontrons que la protéolyse contrôle le niveau de la SP dans la moelle épinière menant à la formation de fragments C-terminaux actifs. La stabilité métabolique de la β-tachykinine58-71 et de la SP était très courte, avec une demi-vie de 5.7 et 3.5 min, respectivement. Plusieurs fragments C-terminaux ont été identifiés, y compris la SP3-11, la SP5-11 et la SP8-11, qui conservent leurs affinités vis-à-vis des récepteurs neurokinines. La stabilité métabolique des fragments C-terminaux était significativement supérieure à celle de la β-Tachykinine58-71 et de la SP. Deux inhibiteurs de Prolyl endopeptidase spécifiques ont été utilisés et ont montré une réduction significative de la vitesse de formation de SP3-11 et de SP5-11. Ainsi, nous avons démontré que le Prolyl endopeptidase est impliqué dans le traitement N-terminal de la SP dans la moelle épinière et dans la formation de la SP3-11 et la SP5-11. Étant donné que la régulation des niveaux endogènes de peptides opioïdes (DynA, Leu-Enk, Met-Enk) et des tachykinines (Tach58-71, SP) dépend fondamentalement de l'activité de PC1 et de celle de PC2, l'analyse des tachykinines et des neuropeptides opioïdes ont été réalisées. Les résultats obtenus révèlent une diminution significative des neuropeptides pro nociceptifs la Tach58-71 (p <0,05), de la SP (p <0,01) et du NKA (P <0,001)), et des neuropeptides opioïdes DynA (p <0,01), de Leu-Enk (p <0,001), de Met-Enk (p <0,001), dans la moelle épinière de souris PC1 - / + et PC2 - / +. Par conséquent, la modulation de l'activité des PCs a un impact important sur les peptides pro-nociceptifs, mais également sur le système opioïde endogène et par conséquent elle affectera significativement les voies modulatrices de la douleur. Ces résultats suggèrent également que la réduction significative des concentrations de peptides pro-nociceptifs peut altérer la réponse du système opioïde endogène. Les analyses des concentrations des peptides opioïdes chez les souris Tac1-/- ont montré spécifiquement que les concentrations en Endomorphine-2 (EM2), en Leu-Enk et en Dyn A sont significativement inférieures que celles obtenues dans la moelle épinière chez les souris WT. Par conséquent, l’absence de la SP a un impact sur les mécanismes endogènes de modulation de la douleur. Mots clés : Tachykinines, substance P, proprotéines convertases, protéolyse, peptides opioïdes, moelle épinière, douleur, chromatographie liquide à haute performance, spectrométrie de masse. / SP is a major proteolytic product of the protachykinin-1 primarily synthesized in neurons and plays a central role in nociceptive transmission. The SP does not acte alone to cause nociceptive discharges, but it potentiates the effect of various neurotransmitters such as glutamate. For these various reasons, much research has been carried out with antagonists of neurokinin receptors and in particular NK1 receptors. However, despite promising pre-clinical studies, NK1 receptor antagonists have not shown significant effect in Humans. The proteolysis control of endogenous protachykinins has a profound impact on pain perception. Proprotein convertases (PCs) are extensively expressed in the central nervous system and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue but the role of PCs remains unclear. The first objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis of protachykinins using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1 -/+ and PC2 -/+ mices and mass spectrometry. The results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 mediate the formation of SP and β-Tachykinin58-71, an important SP precursor, with over 50 % reduction of the rate of formation in mutant PC1 and PC2 mouse S9 spinal cord fractions. The results obtained revealed that PC1 and PC2 are involved in the C-terminal processing of protachykinin peptides and suggest a major role in the maturation of the protachykinin-1 protein. The proteolysis is suspected to regulate extracellular SP concentrations but few studies were conducted on the metabolism of proneuropeptides and neuropeptides. In the present study, we provide evidence that proteolysis controls SP levels in the spinal cord leading to the formation of active C-terminal fragments. The metabolic stability of β-Tachykinin58-71 and SP were very short resulting in half-life of 5.7 and 3.5 min, respectively. Several C-terminal fragments were identified, including SP3-11, SP5-11 and SP8-11, which conserve affinity for the neurokinin receptors. Interestingly, the metabolic stability of C-terminal fragments were significantly superior. Two specific Prolyl endopeptidase inhibitors were used and showed a significant reduction in the rate of formation of SP3-11 and SP5-11 providing strong evidence that Prolyl endopeptidase is involved into N-terminal processing of SP in the spinal cord. The role of proprotein convertases (PCs) in the proteolysis of proneuropeptides was previously established but few studies have shown the direct impact of PCs on the regulation of specific tachykinin and opioid peptides in the central nervous system. This study has determined the relative concentration of targeted neuropeptides in the spinal cord of WT, PC1- / + and PC2- /+ mice to establish the impact of a restricted PCs activity on the regulation of specific neuropeptides. The results revealed a significant decrease of Dyn A (p < 0.01), Leu-Enk (p < 0.001), Met-Enk (p < 0.001), Tach58-71 (p < 0.05), SP (p < 0.01) and NKA (p < 0.001) spinal cord concentrations in both, PC1 -/+ and PC2 -/+ mice. Therefore, the modulation of PCs activity has an important impact on specific pronociceptive peptides (SP and NKA), but the results also showed that endogenous opioid system is hindered and consequently it will affect significantly the pain modulatory pathways. Tachykinin and opioid peptides play a central role in pain transmission, modulation and inhibition. Recent investigations suggest that both pronociceptive tachykinins and the analgesic opioid systems are important for normal pain sensation. The analysis of opioid peptides in Tac1-/- spinal cord tissues offers a great opportunity to verify the influence of the tachykinin system on specific opioid peptides. Our results reveal that Endomorphin-2 (EM2), Leu-Enk and Dyn A were down regulated in Tac1-/- spinal cord tissues that strongly suggest a significant impact on the endogenous pain-relieving mechanisms. These results may have insightful impact on future analgesic drug developments and therapeutic strategies. Key words: Tachykinins, substance P, proprotein convertases, proteolysis, opioid peptides, spinal cord, pain, high performance liquid chromatography, mass spectrometry.

L'augmentation des concentrations de fond en ozone dans la troposphère depuis le XXéme siècle est responsable de baisses conséquentes des rendements des grandes cultures. Le maïs ne semble pas épargné et les pertes de rendement pour l'année 2000 seraient de l'ordre de 2,2% à 5%. Toutefois, ces estimations sont établies à partir des résultats d'un nombre très faible d'expérimentations, toutes réalisées en chambres d'ozonation à ciel ouvert. Afin de vérifier si ces projections sont véritablement transposables aux champs de maïs cultivé en conditions conventionnelles, des plants de la variété NK Perform ont été mis en culture et exposés en champ à différentes concentrations d'ozone, en conditions semi-contrôlées. Pendant le développement des plantes, des séries d'échantillons ont été prélevées afin de comprendre comment le stress oxydatif, potentiellement induit par l'ozone, pourrait les avoir affectées. Ainsi les niveaux d'activités endoprotéolytiques des feuilles de l'épi (précédemment proposés comme indicateurs du degré de contrainte hydrique) ont été mesurés à l'aide d'une méthode par fluorescence (nouvellement adaptée chez les plantes). Parallèlement, les variations des teneurs en protéines oxydées (groupements carbonyles), de la peroxydation lipidiques et de la teneur en espèces réactives de l'oxygène (ROS) ont également été analysées. Nos résultats mettent en évidence une stimulation des activités endoprotéolytiques en réponse aux niveaux élevés d'exposition à l'ozone, ainsi qu'une différence significative de teneurs en protéines oxydées entre les plants contrôles et les plants les plus exposés. De mêmes les teneurs en ROS et les niveaux de peroxydation lipidique témoignent d'un effet de l'exposition à l'ozone. Toutes ses réponses cellulaires sont également influencées par l'âge des tissus foliaires. Ces résultats semblent abonder dans le sens des modèles en démontrant un impact certain de l'ozone sur le maïs, cependant toutes les analyses menées sur les paramètres de rendement (poids de mille grains, biomasse, teneur en amidon…) ne laisse entrevoir aucune perte, nous obligeant alors à reconsidérer la sensibilité du maïs à l'ozone, généralement admise jusqu'ici / For the past 150 years, background tropospheric ozone concentrations have been increasing constantely to the point where they now affect grain yield in major cereals, such as maize. In 2000, it has been estimated that yield loss was between 2.2% and 5% in this crop. Such estimates have been established from a very low number of experiments, all carried out in open top ozone fumigation chambers. To verify the accuracy of these estimations, we cultivated maize plants and exposed them to various ozone concentrations in the field. During plant development, series of cob-leaf samples have been collected in order to analyze the impact of ozone-induced oxidative stress on various biochemical processes. Thus, we studied changes in leaf endoproteolytic activities (a parameter previously used as a dehydration stress indicator), using a fluorescence-based method newly adapted to plant tissues. Concurrently, changes in protein oxidation levels (carbonyl groups) were analyzed, along with lipid peroxidation and accumulation of reactive oxygen species (ROS).Our results indicate that ozone induced increases in the global level of protein oxidation, endoproteolytic processes and lipid peroxidation, most likely as a result of an over-accumulation of ROS in the leaf tissues. Furthermore, the impact of ozone is enhanced by aging. To some extent, these conclusions agree with those obtained from impact modeling that also show that maize is midly sensitive to ozone. However, because yield was not affected whatsoever in our experiment (1000 grain weight, biomass, starch accumulation), it is our opinion that the general consensus about the sensitivity of maize to ozone should be revised

Du fait de problèmes de santé publique, l’industrie agroalimentaire doit réduire la quantité de sel (chlorure de sodium) dans les aliments, et donc dans les charcuteries. Lors de la fabrication des jambons secs, une diminution du taux de sel pourrait se traduire par des problèmes de texture dus à une protéolyse excessive pouvant nuire à l’étape de tranchage industriel, et aussi par des problèmes de stabilité microbiologique. Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse sont : (1) d’étudier le lien entre l’évolution de la protéolyse, de la texture et de la structure, tout au long des différentes étapes de fabrication de jambons secs et (2) de développer un modèle de « jambon numérique » afin de prédire spatialement les dynamiques d’évolution des teneurs en eau, en sel et celle de l’activité de l’eau (a w ), et de coupler ces évolutions à celle de la protéolyse. Ce travail combine études expérimentales et modélisation/simulation numérique. Tout d’abord, une méthode de quantification de la protéolyse utilisant la « Fluorescamine » a été développée et validée sur des échantillons de viande de porc et des échantillons extraits de jambons industriels ; un nouvel indice de protéolyse (IP) a été défini. Sur la base d’un plan d’expériences, l’évolution de la protéolyse au sein d’échantillons différemment salés et séchés et préparés à partir de 5 muscles différents d’un jambon de porc, a été quantifiée. Suite à l’application d’une régression linéaire multiple, des lois phénoménologiques ont été construites permettant de calculer la vitesse de protéolyse, pour un muscle donné, en fonction de la température et des teneurs en eau et en sel. Ensuite, au moyen du logiciel Comsol ® Multiphysics, ces lois ont été combinées avec des modèles de transferts de matière (eau, sel), de chaleur (température), et de calcul de l’a w , constituant ainsi un modèle de « jambon numérique ». Enfin, la dynamique d’évolution de l’IP, de 5 paramètres texturaux (dureté, fragilité, cohésion, élasticité et adhésion) et de 4 paramètres structuraux (nombre des fibres, espaces extracellulaires, taille des fibres et surface de tissu conjonctif) a été mesurée sur des échantillons prélevés dans deux muscles extraits de jambons industriels pris à cinq stades de fabrication différents. L’application d’une régression polynômiale multiple à ces données expérimentales a conduit à l’établissement de corrélations permettent de calculer certains paramètres texturaux et structuraux à partir de l’IP et des teneurs en eau et en sel. A court terme, ces lois seront incorporées dans le modèle numérique afin de constituer un vrai simulateur de procédé. A moyen terme, le modèle de « jambon numérique » devra être amélioré afin de tenir compte (1) de la diminution du volume du jambon, du fait du séchage et (2) de la diminution de la vitesse de protéolyse en fonction du temps, du fait de la réduction de la quantité de protéines hydrolysables dans le jambon. Une fois complété et amélioré, le simulateur de procédé pourra aider les professionnels à tester des scénarios visant à réduire la quantité de sodium dans les jambons secs, sans altérer leur qualité finale. / Because of public health problems, the food industry must lower sodium content in all food products, therefore in cured meat products. During the dry-cured ham elaboration process, decreasing salt content may induce microbial safety problems and texture defects due to an excessive proteolysis that could affect later the industrial stage of slicing. On account of that, this work of thesis aims at (1) studying the relationship between proteolysis, structure and texture during the various stages of dry-cured ham manufacture, and (2) building a “numerical ham” model to predict spatially the time course of water and salt content, and thus water activity (a w ), and to couple these variations with proteolysis. This work combines experimental studies and numerical modelling and simulation. Firstly, a new and powerful technique for quantifying proteolysis that uses “Fluorescamine” was developed and validated on pork meat samples and samples extracted from industrial dry-cured hams; a new proteolysis index (PI) was defined. Based on an experimental design, the time course of proteolysis was quantified in laboratory-salted and dried pork meat samples prepared from five different types of pork muscle. Applying multiple linear regression enabled us to build phenomenological models relating, for each pork muscle, PI velocity to temperature, and to water and salt content. Using Comsol ® Multiphysics software, these phenomenological models were then combined with heat and mass transfer models and associated with calculation of a w , thus constituting the “numerical ham” model. In addition, the time course of PI, five textural parameters (hardness, fragility, cohesiveness, springiness and adhesiveness), and four structural parameters (fiber number, extracellular spaces, cross section area, and connective tissue area) was quantified on samples extracted from two different muscles of industrial dry-cured hams removed from the process at five different processing times. Multiple polynomial regression was applied to build phenomenological models relating PI, salt and water content to some textural and structural parameters investigated. These last models could be rapidly incorporated in the “numerical ham” model to constitute a real process simulator. In the future, the “numerical ham” model should be improved in order to take into account (1) the strong decrease in ham volume due to drying and also (2) the decrease in proteolysis velocity with time as a result of the reduction in the amount of protein that can be hydrolysed in the ham. Once completed and improved, the process simulator will be available to professionals to test scenarios allowing sodium content to be reduced in dry-cured hams without altering their final quality.