Cet ouvrage porte sur la conception, la synthèse, les propriétés physico-chimiques et les propriétés pharmacologiques de peptides analogues de la Leu enképhaline. Ces travaux ont été effectués dans une collaboration entre les laboratoires des Pr Yves Dory et Louis Gendron. Le but à long terme de cette recherche est de développer des analgésiques (antidouleurs) basés sur le squelette de la Leu enképhaline, mais possédant une action orale. Bien sûr, par ces recherches, la compréhension des interactions intermoléculaires entre la Leu enképhaline et sa cible biologique (le récepteur opioïdergique delta; DOP) a pu être améliorée. Les informations recueillies par ces travaux pourront être d’une utilité notoire dans le développement futur d’analgésiques. Trois articles originaux sont insérés dans cet ouvrage (chapitres 1 et 3). Une introduction détaillée sur l’état des connaissances sur les analgésiques, plus particulièrement des peptides opioïdes, est présentée en premier lieu. Le chapitre 1 présente une série d’analogues d’enképhalines obtenus par remplacement systématique des amides par des alcènes. La deuxième section de ce chapitre présente une amélioration portée à la synthèse de ces analogues (réaction de déconjugaison cinétique). Aux chapitres 2 et 3 sont présentés d’autres analogues d’enképhalines obtenus par remplacement systématique des amides. Le chapitre 2 comporte les remplacements de type ester et N-méthyl amide. Le chapitre 3 comporte le remplacement de type triazole, obtenu par chimie de type « click ». Le chapitre 4 comporte des analogues de la Leu enképhaline obtenus par modification des chaînes latérales du peptide. Les chaînes des acides aminés 2 et 5 ont été modifiées pour obtenir des peptides plus sélectifs pour DOP, ainsi que pour avoir la possibilité de marquer le peptide avec un atome radioactif. L’annexe 5 relate la synthèse du SB-235863. Ce composé est un agoniste sélectif de DOP dérivé de la codéine.

Cet ouvrage porte sur la conception, la synthèse, les propriétés physico-chimiques et les propriétés pharmacologiques de peptides analogues de la Leu enképhaline. Ces travaux ont été effectués dans une collaboration entre les laboratoires des Pr Yves Dory et Louis Gendron. Le but à long terme de cette recherche est de développer des analgésiques (antidouleurs) basés sur le squelette de la Leu enképhaline, mais possédant une action orale. Bien sûr, par ces recherches, la compréhension des interactions intermoléculaires entre la Leu enképhaline et sa cible biologique (le récepteur opioïdergique delta; DOP) a pu être améliorée. Les informations recueillies par ces travaux pourront être d’une utilité notoire dans le développement futur d’analgésiques. Trois articles originaux sont insérés dans cet ouvrage (chapitres 1 et 3). Une introduction détaillée sur l’état des connaissances sur les analgésiques, plus particulièrement des peptides opioïdes, est présentée en premier lieu. Le chapitre 1 présente une série d’analogues d’enképhalines obtenus par remplacement systématique des amides par des alcènes. La deuxième section de ce chapitre présente une amélioration portée à la synthèse de ces analogues (réaction de déconjugaison cinétique). Aux chapitres 2 et 3 sont présentés d’autres analogues d’enképhalines obtenus par remplacement systématique des amides. Le chapitre 2 comporte les remplacements de type ester et N-méthyl amide. Le chapitre 3 comporte le remplacement de type triazole, obtenu par chimie de type « click ». Le chapitre 4 comporte des analogues de la Leu enképhaline obtenus par modification des chaînes latérales du peptide. Les chaînes des acides aminés 2 et 5 ont été modifiées pour obtenir des peptides plus sélectifs pour DOP, ainsi que pour avoir la possibilité de marquer le peptide avec un atome radioactif. L’annexe 5 relate la synthèse du SB-235863. Ce composé est un agoniste sélectif de DOP dérivé de la codéine.

Afin de déterminer le rôle de l'augmentation des peptides opioïdes dans la dyskinésie induite par la L-DOPA (DIL), nous avons utilisé le transfert de gène par vecteur viral pour surexprimer la pré-enképhaline (pENK) dans le striatum du modèle de souris unilatérale au 6-hydroxydopamine. Trois groupes ont reçu soit une injection striatale de : salin (Saline); virus adéno-associé exprimant la « Green Fluorescent Protein » (AAV-GFP); ou AAV-GFP-pENK. Le 4e groupe a reçu la L-DOPA sans injection striatale (NSI) et le 5e groupe n'a pas reçu de L-DOPA. Les résultats ont démontré une réduction importante de la DIL chez les groupes GFP et pENK (-70% à -82%) comparativement aux groupes Saline et NSI. Le niveau d'ARNm de pENK était plus élevé dans les régions striatales antérieur et postérieur chez les groupes pENK et GFP, respectivement. Notre étude présente la première preuve que l'augmentation striatale d'ARNm de pENK peut réduire la DIL. / To address the role of striatal upregulation of opioid peptides in L-DOPA-induced dyskinesia (LID), we used viral vector gene transfer to overexpress pre-enkephalin (pENK) in striatum of unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of LID. One week before L-DOPA treatment (3 weeks after dopamine lesion) three groups received either striatal injection of: Saline (Saline); or Adeno-Associated Virus expressing Green Fluorescent Protein (AAV-GFP); or AAV-GFP-pENK. 4th group only received L-DOPA without any striatal injection (NSI), and 5th group did not receive L-DOPA. The severity of dyskinesia after L-DOPA administration was assessed, during 3 weeks. Our results showed an important reduction of LID in GFP- and pENK- injected mice (-70% to -82%) compared with Saline and NSI groups. The level of pENK mRNA was higher in the anterior and posterior parts of lesioned-striatum in pENK and GFP groups, respectively. Our study provides the first evidence that upregulation of striatal pENK mRNA could reduce LID.

Les dynorphines sont des neuropeptides importants avec un rôle central dans la nociception et l’atténuation de la douleur. De nombreux mécanismes régulent les concentrations de dynorphine endogènes, y compris la protéolyse. Les Proprotéines convertases (PC) sont largement exprimées dans le système nerveux central et clivent spécifiquement le C-terminale de couple acides aminés basiques, ou un résidu basique unique. Le contrôle protéolytique des concentrations endogènes de Big Dynorphine (BDyn) et dynorphine A (Dyn A) a un effet important sur la perception de la douleur et le rôle de PC reste à être déterminée. L'objectif de cette étude était de décrypter le rôle de PC1 et PC2 dans le contrôle protéolytique de BDyn et Dyn A avec l'aide de fractions cellulaires de la moelle épinière de type sauvage (WT), PC1 -/+ et PC2 -/+ de souris et par la spectrométrie de masse. Nos résultats démontrent clairement que PC1 et PC2 sont impliquées dans la protéolyse de BDyn et Dyn A avec un rôle plus significatif pour PC1. Le traitement en C-terminal de BDyn génère des fragments peptidiques spécifiques incluant dynorphine 1-19, dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7 et Dyn A génère les fragments dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7. Ils sont tous des fragments de peptides associés à PC1 ou PC2. En plus, la protéolyse de BDyn conduit à la formation de Dyn A et Leu-Enk, deux peptides opioïdes importants. La vitesse de formation des deux est réduite de manière significative dans les fractions cellulaires de la moelle épinière de souris mutantes. En conséquence, l'inhibition même partielle de PC1 ou PC2 peut altérer le système opioïde endogène. / Dynorphins are important neuropeptides with a central role in nociception and pain alleviation. Many mechanisms regulate endogenous dynorphin concentrations, including proteolysis. Proprotein convertases (PCs) are widely expressed in the central nervous system and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue. The proteolysis control of endogenous Big Dynorphin (BDyn) and Dynorphin A (Dyn A) levels has a profound impact on pain perception and the role of PCs remain unclear. The objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis control of BDyn and Dyn A levels using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1-/+ and PC2-/+ animals and mass spectrometry. Our results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 are involved in the proteolysis regulation of BDyn and Dyn A with a more important role for PC1. C-terminal processing of BDyn generates specific peptide fragments Dynorphin 1-19, Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7 and C-terminal processing of Dyn A generates Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7, all these peptide fragments are associated with PC1 or PC2 processing. Moreover, proteolysis of BDyn leads to the formation of Dyn A and Leu-Enk, two important opioid peptides. The rate of formation of both is significantly reduced in cellular fractions of spinal cord mutant mice. As a consequence, even partial inhibition of PC1 or PC2 may impair the endogenous opioid system.

Les peptides appartenant à la famille des tachykinines telle que la substance P (SP) sont des acteurs essentiels contribuant à l’hyperalgésie primaire et secondaire. La SP libérée par les neurones afférents primaires, ne provoque pas à elle seule des décharges nociceptives, mais elle potentialise l’effet de divers neurotransmetteurs tel que le glutamate. Pour ces différentes raisons, de nombreuses recherches ont été effectuées avec des antagonistes des récepteurs neurokinines et en particulier des récepteurs NK1. Cependant, malgré des études pré-cliniques prometteuses, les antagonistes du récepteur NK1 n’ont pas montré d’effet significatif chez l’Homme. La biosynthèse des neuropeptides actifs passe par la maturation protéolytique des pro-neuropeptides. La compréhension des mécanismes de la maturation enzymatique des précurseurs des tachykinines, ainsi que l’étude de la stabilité métabolique de la substance P (SP) permettraient d’élucider des stratégies de traitement innovateur en favorisant l’inhibition du processus de maturation ou la production de fragments peptidiques moins actifs ou inactifs. Le premier objectif de cette étude était d’élucider le rôle de la Proproteine convertase 1 (PC1) et de la Proproteine convertase 2 (PC2) dans la maturation de la protachykinine en utilisant des fractions S9 de la moelle épinière des souris du type sauvage (WT), PC1-/+ et PC2-/+. La caractérisation et la quantification des neuropeptides ont été réalisées à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance et de la spectrométrie de masse. Les résultats montrent que PC1 et PC2 interviennent dans la maturation de la protachykinine et ces deux enzymes sont essentielles pour la biosynthèse de la Tachykinine58-71, le précurseur de la SP. Une réduction de plus de 50% de la vitesse de formation dans les fractions S9 de la moelle épinière de souris mutantes PC1 et PC2 a été observée. Les résultats obtenus révèlent que PC1 et PC2 sont impliquées dans la protéolyse de la protachykinine et suggèrent un rôle important de ces enzymes dans la maturation de la protachykinine-1. La protéolyse régule probablement les concentrations extracellulaires de la SP, mais peu d'études ont été menées sur le métabolisme des tachykinines. Dans ce présent travail, nous démontrons que la protéolyse contrôle le niveau de la SP dans la moelle épinière menant à la formation de fragments C-terminaux actifs. La stabilité métabolique de la β-tachykinine58-71 et de la SP était très courte, avec une demi-vie de 5.7 et 3.5 min, respectivement. Plusieurs fragments C-terminaux ont été identifiés, y compris la SP3-11, la SP5-11 et la SP8-11, qui conservent leurs affinités vis-à-vis des récepteurs neurokinines. La stabilité métabolique des fragments C-terminaux était significativement supérieure à celle de la β-Tachykinine58-71 et de la SP. Deux inhibiteurs de Prolyl endopeptidase spécifiques ont été utilisés et ont montré une réduction significative de la vitesse de formation de SP3-11 et de SP5-11. Ainsi, nous avons démontré que le Prolyl endopeptidase est impliqué dans le traitement N-terminal de la SP dans la moelle épinière et dans la formation de la SP3-11 et la SP5-11. Étant donné que la régulation des niveaux endogènes de peptides opioïdes (DynA, Leu-Enk, Met-Enk) et des tachykinines (Tach58-71, SP) dépend fondamentalement de l'activité de PC1 et de celle de PC2, l'analyse des tachykinines et des neuropeptides opioïdes ont été réalisées. Les résultats obtenus révèlent une diminution significative des neuropeptides pro nociceptifs la Tach58-71 (p <0,05), de la SP (p <0,01) et du NKA (P <0,001)), et des neuropeptides opioïdes DynA (p <0,01), de Leu-Enk (p <0,001), de Met-Enk (p <0,001), dans la moelle épinière de souris PC1 - / + et PC2 - / +. Par conséquent, la modulation de l'activité des PCs a un impact important sur les peptides pro-nociceptifs, mais également sur le système opioïde endogène et par conséquent elle affectera significativement les voies modulatrices de la douleur. Ces résultats suggèrent également que la réduction significative des concentrations de peptides pro-nociceptifs peut altérer la réponse du système opioïde endogène. Les analyses des concentrations des peptides opioïdes chez les souris Tac1-/- ont montré spécifiquement que les concentrations en Endomorphine-2 (EM2), en Leu-Enk et en Dyn A sont significativement inférieures que celles obtenues dans la moelle épinière chez les souris WT. Par conséquent, l’absence de la SP a un impact sur les mécanismes endogènes de modulation de la douleur. Mots clés : Tachykinines, substance P, proprotéines convertases, protéolyse, peptides opioïdes, moelle épinière, douleur, chromatographie liquide à haute performance, spectrométrie de masse. / SP is a major proteolytic product of the protachykinin-1 primarily synthesized in neurons and plays a central role in nociceptive transmission. The SP does not acte alone to cause nociceptive discharges, but it potentiates the effect of various neurotransmitters such as glutamate. For these various reasons, much research has been carried out with antagonists of neurokinin receptors and in particular NK1 receptors. However, despite promising pre-clinical studies, NK1 receptor antagonists have not shown significant effect in Humans. The proteolysis control of endogenous protachykinins has a profound impact on pain perception. Proprotein convertases (PCs) are extensively expressed in the central nervous system and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue but the role of PCs remains unclear. The first objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis of protachykinins using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1 -/+ and PC2 -/+ mices and mass spectrometry. The results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 mediate the formation of SP and β-Tachykinin58-71, an important SP precursor, with over 50 % reduction of the rate of formation in mutant PC1 and PC2 mouse S9 spinal cord fractions. The results obtained revealed that PC1 and PC2 are involved in the C-terminal processing of protachykinin peptides and suggest a major role in the maturation of the protachykinin-1 protein. The proteolysis is suspected to regulate extracellular SP concentrations but few studies were conducted on the metabolism of proneuropeptides and neuropeptides. In the present study, we provide evidence that proteolysis controls SP levels in the spinal cord leading to the formation of active C-terminal fragments. The metabolic stability of β-Tachykinin58-71 and SP were very short resulting in half-life of 5.7 and 3.5 min, respectively. Several C-terminal fragments were identified, including SP3-11, SP5-11 and SP8-11, which conserve affinity for the neurokinin receptors. Interestingly, the metabolic stability of C-terminal fragments were significantly superior. Two specific Prolyl endopeptidase inhibitors were used and showed a significant reduction in the rate of formation of SP3-11 and SP5-11 providing strong evidence that Prolyl endopeptidase is involved into N-terminal processing of SP in the spinal cord. The role of proprotein convertases (PCs) in the proteolysis of proneuropeptides was previously established but few studies have shown the direct impact of PCs on the regulation of specific tachykinin and opioid peptides in the central nervous system. This study has determined the relative concentration of targeted neuropeptides in the spinal cord of WT, PC1- / + and PC2- /+ mice to establish the impact of a restricted PCs activity on the regulation of specific neuropeptides. The results revealed a significant decrease of Dyn A (p < 0.01), Leu-Enk (p < 0.001), Met-Enk (p < 0.001), Tach58-71 (p < 0.05), SP (p < 0.01) and NKA (p < 0.001) spinal cord concentrations in both, PC1 -/+ and PC2 -/+ mice. Therefore, the modulation of PCs activity has an important impact on specific pronociceptive peptides (SP and NKA), but the results also showed that endogenous opioid system is hindered and consequently it will affect significantly the pain modulatory pathways. Tachykinin and opioid peptides play a central role in pain transmission, modulation and inhibition. Recent investigations suggest that both pronociceptive tachykinins and the analgesic opioid systems are important for normal pain sensation. The analysis of opioid peptides in Tac1-/- spinal cord tissues offers a great opportunity to verify the influence of the tachykinin system on specific opioid peptides. Our results reveal that Endomorphin-2 (EM2), Leu-Enk and Dyn A were down regulated in Tac1-/- spinal cord tissues that strongly suggest a significant impact on the endogenous pain-relieving mechanisms. These results may have insightful impact on future analgesic drug developments and therapeutic strategies. Key words: Tachykinins, substance P, proprotein convertases, proteolysis, opioid peptides, spinal cord, pain, high performance liquid chromatography, mass spectrometry.