Orientador: Fábio César Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T06:35:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_TatianiBrenellide_M.pdf: 10987476 bytes, checksum: 5ef2abf84b79afba4ad901cc1e46c719 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A espectrometria de massas (MS) tem sido bastante utilizada em analises de amostras biológicas, tornando uma ferramenta indispensável para pesquisas na área de proteômica. A ligação cruzada é um processo de união covalente entre dois átomos espacialmente próximas. A ligação cruzada acoplada a MS permite estudos estruturais de proteínas baseado nas restrições de distância determinadas pelos espécies inter- intra-moleculares ligadas entre as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos. Essa técnica vem sendo bastante utilizada na análise de interação entre proteínas, entretanto, um aspecto pouco explorado é a analise estrutural de proteínas. O objetivo desse trabalho foi determinar as estruturas terciárias e quaternárias de proteínas de chaperonas moleculares de cana-de-açúcar ou proteínas de choque térmico (do inglês, sugarcane heat shock protein, SHsp) utilizando a técnica de ligação cruzada acoplada com MS e modelagem molecular. As restrições de distâncias obtidas pela ligação cruzada e o gráfico de Ramanchandran foram utilizados para validar as estruturas tridimensionais da SHsp70 e SHsp90 obtidas por modelagem por homologia. Informações adicionais de dinâmica e flexibilidade da SHsp90 foi obtida pela técnica de troca hidrogênio/deutério. As chaperonas moleculares são proteínas importantes presentes em células para evitar o enovelamento incorreto de outras proteínas e suas agregações. Em plantas, fatores que corroboram com a tolerância ao estresse ainda são pouco compreendidos, mas provavelmente as chaperonas moleculares desempenha um papel importante no controle aos danos desse organismo. Desse modo, caracterizar estruturas de Hsp de cana de açúcar é uma informação essencial para a compreensão do mecanismo deste acompanhante de ação. Os estudos estruturais baseados em ligação cruzada acoplada a MS e modelagem por homologia permitiu propor um modelo estrutural para SHsp90 e SHsp70 / Abstract: Mass spectrometry (MS) has been extensively used to analyze biological samples and has advanced as an indispensable tool for proteomics research. Cross-linking is the process of chemically joining two spatially close atoms by covalent bond. The chemical cross-linking coupled to MS allows structural studies of protein based on distance constrains determined by inter- and intra-molecular cross-link between side chains of amino acids residues. This technique has been normally used to analyze protein-protein interaction but is mostly unexplored for structural analysis of proteins. The aim of this work was to investigate tertiary and quaternary structure of sugarcane molecular chaperone or heat shock protein (SHsp) using chemical cross-linking coupled to MS and homology modeling. The distance constrains obtained by chemical crosslinking and Ramachandran plot were used to validate tridimensional structures of SHsp70 and SHsp90 that was predicted by homology modeling. Additional information about flexibility and dynamics of SHsp90 was obtained using hydrogen/deuterium exchange (HDX) coupled to MS. The molecular chaperones are important proteins present in cell that helps prevent incorrect folding of proteins and their aggregation. The stress tolerance in plants is still poorly understood, but heat shock proteins likely play a large role in the plant damage control machinery. Thereby, characterizing Sugarcane Hsp structures is essential information toward the understanding of this chaperone¿s mechanism of action. The structural study of molecular chaperones by chemical cross-linking coupled to MS and homology modelling allowed the generation of a structural model for SHsp90 and SHsp70 / Mestrado / Quimica Organica / Mestra em Química

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-20T04:44:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fioramonte_Mariana_M.pdf: 6585272 bytes, checksum: 7fcc677288d272f3c92f3e3116d43fa5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Ligação cruzada acoplada à espectrometria de massas (MS) é uma técnica que permite a caracterização estrutural de proteínas e complexos proteicos, especialmente nos casos em que estes não são passíveis de serem analisados por técnicas de alta resolução. O experimento baseia-se na reação de uma proteína ou no complexo proteico com um reagente bifuncional (agente de ligação cruzada, ALC) seguido de análise proteômica shotgun por MS. Isso trás para a técnica todas as vantagens da MS, como alta sensibilidade, rapidez de análise e facilidade de uso. Somente resíduos de aminoácidos espacialmente próximos podem ser ligados covalentemente pelo ALC, de forma que os peptídeos contendo a ligação cruzada, identificadas por MS, servem como restrições de distância entre os aminoácidos na estrutura nativa da proteína ou complexo proteico. O conjunto de peptídeos contendo a ligação cruzada fornece, assim, um conjunto de restrições de distâncias entre os aminoácidos que pode ser utilizado para montar um modelo molecular da proteína ou do complexo. O objetivo principal deste trabalho foi a aplicação da técnica de ligação cruzada acoplada a espectrometria de massas no mapeamento da interação entre as proteínas quinase de adesão focal (FAK), através de seu domínio FERM, e miosina. Esse complexo proteico está envolvido na sinalização molecular para o processo de hipertrofia cardíaca. A hipertrofia cardíaca é considerada um mecanismo de adaptação do miocárdio em resposta a sobrecargas hemodinâmicas e está associada com risco de desenvolvimento de insuficiência cardíaca, arritmias e morte súbita. Estímulos mecânicos são considerados os principais ativadores primários das respostas que conduzem às alterações fenotípicas do miocárdio nas várias doenças cardíacas. A caracterização estrutural do complexo FAK/miosina ao nível molecular permitiu a criação de um modelo molecular deste complexo, que foi validado através de mutações na região de interação entre as proteínas. Esse modelo permite que se entenda o processo de sinalização da hipertrofia ao nível molecular / Abstract: Chemical cross-linking coupled with mass spectrometry (MS) is a technique that allows the structural characterization of proteins and protein complexes, especially when these proteins are not amenable to be analyzed by high resolution techniques. The experiment is based on ther eaction of a protein or protein complex with a bifunctional reagent (cross-linking agent, ALC) followed by shotgun proteome analysis by MS. This brings to the technique all the advantages of MS, such as high sensitivity, short analysis time and ease of use. Only spatially close amino acid residues can be covalently bound by the reagent, so that the cross-linked peptides, identified by MS, serve as distance constraints between amino acids in the native structure of the protein or protein complex. The set of cross-linked peptides thus provides a set distance constraints among amino acids that can be used to build a molecular model of the protein or complex. The main objective of this work was to apply the cross-linking technique coupled to MS to map the interaction between the proteins Focal Adhesion Kinase (FAK), through its FERM domain, and myosin. This protein complex is involved in molecular signaling of the cardiac hypertrophy process. Cardiac hypertrophy is considered an adaptative mechanism of the myocardium in response to hemodynamic overload and it is associated with risk of developing heart failure, arrhythmias and sudden death. Mechamical stimuli are considered the main activator of the primary responses that lead to phenotypic changes of the myocardium in many cardiac diseases. The structural characterization of the complex FAK/myosin at the molecular level has allowed the creation of a molecular model of this complex, which was validated by mutations in the region of interaction between the proteins. This model allows the understanding the signaling processes of hypertrophy at the molecular level / Mestrado / Quimica Organica / Mestra em Química

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T10:34:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferrari_AllanJhonathanRamos_M.pdf: 2074796 bytes, checksum: a9fd65df7da4d527a33e2ef562c91f73 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Stanniocalcina-1 (STC1) é um hormônio glicoproteico que apresenta padrão de expressão diferencial destacado em diversas patologias, notadamente em neoplasias, mas seus aspectos funcionais e estruturais são pouco explorados até o momento. Nesse sentido, a STC1 foi escolhida como alvo para a utilização de uma abordagem integrativa das técnicas que utilizam os reagentes de ligação cruzada, espectrometria de massas e modelagem molecular para a modelagem estrutural. A partir dos experimentos de ligação cruzada, foram obtidas 37 restrições de distância envolvendo espécies ligadas com DSS, sendo 11 destas espécies com N-terminal e uma restrição envolvendo a espécie dimérica, além das cinco ligações de dissulfeto já publicadas. Essas restrições foram utilizadas para a geração de modelos estruturais nas plataformas online I-Tasser e Quark e, localmente, mais de 100.000 modelos pelo protocolo Ab Initio Relax do software Rosetta em quatro diferentes condições iniciais de modelagem. O Rosetta apresentou maior eficiência na geração de modelos quando ausente arquivo de predição de estrutura secundária. As restrições de distância foram ferramenta discriminatória fundamental para a seleção de estruturas candidatas para a STC1. O agrupamento utilizando o parâmetro global distante test (gdt) das 1500 modelos de menor score que respeitavam todas as restrições identificou 22 estruturas representativas estruturalmente distintas. Essas estruturas representativas podem agora ser utilizadas em testes envolvendo substituição molecular nos dados de difração de raios-X / Abstract: The Stanniocalcin-1 (STC1) is a glycoproteic hormone, which shows a differential expression pattern in a variety of pathologies, especially in neoplasia, but its functional and structural aspects have not been explored. Accordingly, the STC1 was chosen as a target to the use of an integrative approach including chemical cross-linking, mass spectrometry and molecular modeling. From cross-linking experiments,37 distance constrains were identified involving the DSS cross-linker, 11 of them in the N-terminus part of the protein and one involving the dimeric specie, in addition to five disulfide bonds already published. These constrains were used to generate structural models by I-Tasser and Quark online platforms and, locally, more than 100,000 models in the Ab Initio Relax protocol package present in the Rosetta software in four different modeling conditions. Rosetta was the most efficient in generating models when secondary structure prediction was absent. The distance constrains were found to be a key discriminatory tool for the selection of candidate structures for the STC1. For the 1,500 lowest score structures that satisfied the distance constrains, the clustering method employing the global distance test parameter (gdt) identified 22 structurally distinct representative structures. These representative structures can be used to in molecular replacement test to solve the X-Ray diffraction data / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) é uma bactéria fitopatógênica que causa de cancro cítrico em plantações no mundo inteiro. Trinta e cinco proteínas alvo foram selecionadas para estudos de proteômica estrutural a partir do genoma de Xac. As proteínas foram clonadas, expressas e testadas usando uma nova metodologia de triagem de proteínas que permite que espectros de RMN 2D 15N-HSQC sejam coletados antes da purificação da proteína em estudo. Esta abordagem possibilitou determinar quais proteínas alvo melhor se adequavam para estudos estruturais futuros por RMN e/ou cristalografia de raios X de forma rápida e eficaz. A proteína ClpS de Xac, descrita como moduladora da atividade da protease bacteriana ClpAP, foi uma das proteínas selecionadas para estudos estruturais por RMN usando esta metodologia. O assinalamento das ressonâncias da cadeia principal e das cadeias laterais desta proteína usando experimentos de tripla ressonância e dados de dinâmica e de troca H/D forneceram informações sobre a sua estrutura secundária. Um modelo tridimensional foi gerado por modelagem por homologia a partir de um homólogo de E. coli e foi validado por acoplamentos dipolares residuais (DHN ) obtidos experimentalmente. Todos os dados RMN sugerem que a região N-terminal de ClpS se apresenta desestruturada. O mapeamento por RMN da interação de ClpS com a sua parceira ClpA é também apresentado. / Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is a phytopathogenic bacterium that causes citrus canker around the world. Thirty-five target proteins for structural proteomics studies have been selected from the Xac genome. The target proteins were cloned, expressed and tested using a novel screening methodology that allows for 2D 15N-HSQC NMR spectra to be collected prior to the purification of the target protein. This approach allowed us to determine which target proteins were amenable for future structural studies by NMR and/or X-ray crystallography in a fast and efficient manner. The ClpS protein, which has been described as a modulator of substrate specificity of the bacterial protease ClpAP, was one of the proteins selected structural studies by NMR using this methodology. Backbone and side-chain assignment derived from 3D triple resonance NMR experiments and dynamic data from hydrogen-deuterium exchange NMR experiments have provided information on the secondary structure elements of this protein. A model for Xac ClpS was generated by homology modeling from an E. coli homogue and validated using experimentally obtained DHN residual dipolar couplings. All NMR data suggest that the N-terminal region of the protein ClpS is highly unstructured. NMR mapping of the interaction of ClpS with its partner protein ClpA is also presented.

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_AlexandreFerreira_D.pdf: 12902505 bytes, checksum: 9ee986003caba0a232a59bff99ccc97d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Este trabalho foi dividido em dois capítulos, tendo como temática geral a aplicação de técnicas modernas baseadas em espectrometria de massas (MS) no estudo da biotransformação de fármacos (capítulo I) e em proteômica estrutural por ligação cruzada e mobilidade iônica (capítulo II). No capítulo I, foram estudadas rotas de fragmentação por dissociação induzida por colisão (CID), perfis de metabólitos in vivo em ratos e farmacocinética de derivados de 4-anilinoquinazolina, candidatos a inibidores da enzima adenosina quinase (AK), tendo por essa razão potencial terapêutico no tratamento de doenças como hipertensão, Diabetes mellitus, psoríase e doenças inflamatórias crônicas. O comportamento desses compostos em MS foi inicialmente avaliado com base em suas rotas de fragmentação em fase gasosa por MS sequencial, com auxílio de cálculos teóricos para íons precursores e fragmentos em fase gasosa. Esse conhecimento foi então aplicado na determinação dos perfiis de metabólitos de fases I e II in vivo em ratos e de sua farmacocinética utilizando-se métodos de cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a MS (UPLC-MS). Os resultados permitiram estabelecer as principais vias de fragmentação por CID para essa classe de compostos, bem como os principais metabólitos observados in vivo. No capítulo II, foram realizados estudos fundamentais em proteômica estrutural por MS. Nesse âmbito, o efeito de modificações covalentes advindas de reações de ligação cruzada nas conformações de proteínas-modelo foi investigado empregando-se a técnica de mobilidade iônica acoplada a MS (IM-MS) em duas abordagens instrumentais distintas, que permite determinar as seções de choque de colisão (CCS) de íons em fase gasosa. Os resultados obtidos dos experimentos de IM-MS, aliados a dados provenientes de simulações de dinâmica molecular (MD) dos sistemas em questão, permitiram concluir que as modificações de ligação cruzada aumentam a resistência dos íons de proteína em fase gasosa ao processo de desenovelamento, e geram íons mais compactos em fase gasosa (menor CCS). Um modelo foi proposto para explicar esse fenômeno, correlacionando as conformações observadas com a carga líquida e densidade de carga dos íons de proteínas em fase gasosa / Abstract: This work was divided in two chapters, both grouped under the general theme of application of modern mass spectrometry (MS)-based techniques to the study of drug biotransformation (chapter I) and in structural proteomics by chemical cross-linking and ion mobility (chapter II). In chapter I, collision-induced dissociation (CID) routes, in vivo rat metabolite profiles and pharmacokinetics of a series of 4-anilinoquinazoline derivatives were studied. These derivatives are potential adenosine kinase (AK) inhibitors, having therapeutic potential in treatment of diseases such as hypertension, Diabetes mellitus, psoriasis and chronic inflammatory diseases. The mass spectrometric behavior of such derivatives was initially evaluated in terms of their fragmentation routes by sequential MS, aided by theoretical calculations for gas phase precursor and fragment ions. This knowledge was then applied in the determination of in vivo phase I and II metabolite profiles in rats, as well as pharmacokinetics, using ultra performance liquid chromatography coupled to MS (UPLC-MS). Results allowed the establishment of main CID fragmentation routes for this class of compounds, as well as the main metabolites observed in vivo. The focuses of chapter II were fundamental studies in structural proteomics by a combination of chemical cross-linking, ion mobility and MS. More specifically, the effect of covalent modifications introduced by chemical cross-linking in the conformations of model proteins was investigated by ion mobility-MS (IM-MS) techniques, which allows the determination of collision cross sections (CCS) for gas phase ions. Results from IM-MS experiments, together with data from molecular dynamics (MD) simulations of the studied systems, indicate that the cross-linking modifications increase the resistance of protein ions to gas phase unfolding, also generating more compact ions in the gas phase (smaller CCS). A model was developed to explain this phenomenon, correlating the observed conformations with net charge and charge density of the gas phase protein ion / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) é uma bactéria fitopatógênica que causa de cancro cítrico em plantações no mundo inteiro. Trinta e cinco proteínas alvo foram selecionadas para estudos de proteômica estrutural a partir do genoma de Xac. As proteínas foram clonadas, expressas e testadas usando uma nova metodologia de triagem de proteínas que permite que espectros de RMN 2D 15N-HSQC sejam coletados antes da purificação da proteína em estudo. Esta abordagem possibilitou determinar quais proteínas alvo melhor se adequavam para estudos estruturais futuros por RMN e/ou cristalografia de raios X de forma rápida e eficaz. A proteína ClpS de Xac, descrita como moduladora da atividade da protease bacteriana ClpAP, foi uma das proteínas selecionadas para estudos estruturais por RMN usando esta metodologia. O assinalamento das ressonâncias da cadeia principal e das cadeias laterais desta proteína usando experimentos de tripla ressonância e dados de dinâmica e de troca H/D forneceram informações sobre a sua estrutura secundária. Um modelo tridimensional foi gerado por modelagem por homologia a partir de um homólogo de E. coli e foi validado por acoplamentos dipolares residuais (DHN ) obtidos experimentalmente. Todos os dados RMN sugerem que a região N-terminal de ClpS se apresenta desestruturada. O mapeamento por RMN da interação de ClpS com a sua parceira ClpA é também apresentado. / Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is a phytopathogenic bacterium that causes citrus canker around the world. Thirty-five target proteins for structural proteomics studies have been selected from the Xac genome. The target proteins were cloned, expressed and tested using a novel screening methodology that allows for 2D 15N-HSQC NMR spectra to be collected prior to the purification of the target protein. This approach allowed us to determine which target proteins were amenable for future structural studies by NMR and/or X-ray crystallography in a fast and efficient manner. The ClpS protein, which has been described as a modulator of substrate specificity of the bacterial protease ClpAP, was one of the proteins selected structural studies by NMR using this methodology. Backbone and side-chain assignment derived from 3D triple resonance NMR experiments and dynamic data from hydrogen-deuterium exchange NMR experiments have provided information on the secondary structure elements of this protein. A model for Xac ClpS was generated by homology modeling from an E. coli homogue and validated using experimentally obtained DHN residual dipolar couplings. All NMR data suggest that the N-terminal region of the protein ClpS is highly unstructured. NMR mapping of the interaction of ClpS with its partner protein ClpA is also presented.

No description available.

Les dépôts intracellulaires de la protéine Tau agrégée sont la caractéristique commune des tauopathies, une famille de maladies neurodégénératives dont fait partie la maladie d’Alzheimer. Alors que les isoformes de Tau contenant trois (3R) ou quatre (4R) domaines de liaison aux microtubules sont retrouvées à des niveaux similaires dans le cerveau des individus sains, elles diffèrent au sein des inclusions intracellulaires en fonction des tauopathies. Notre étude repose sur l’identification de déterminants structuraux communs et distincts de fibres de Tau 3R et 4R. Pour cela deux approches de protéomique structurale complémentaires ont été mises au point à partir de fibres de Tau 1N3R et 1N4R produites in vitro. La première stratégie, reposant sur l’utilisation de protéolyses ménagées, nous a permis d’identifier les fragments protéolytiques qui composent un « code-barre » moléculaire propre à chaque assemblage. La seconde stratégie a utilisé un marquage chimique covalent des lysines accessibles suivi de l’analyse qualitative et quantitative des acides aminés marqués par spectrométrie de masse. Nous avons ainsi pu montrer que la partie N-terminale de la protéine était accessible au sein des fibres 1N3R et 1N4R tandis que la région C-terminale de la protéine est protégée pour Tau 1N3R et accessible au solvant pour Tau 1N4R. Nos résultats ouvrent la voie à de nouveaux outils moléculaires pour discriminer les tauopathies. / Intracellular deposits of Tau protein aggregates are the common hallmark of tauopathies, a range of neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease. Levels of tau with three (3R) or four (4R) microtubule binding repeats are found similar in the normal adult brain, whereas they differ in neuropathological intracellular Tau inclusions, according to the type of tauopathy. Our study consists of the identification of common and different structural molecular determinants of 3R and 4R Tau fibrils. To this end, two proteomic approaches were optimized using 1N3R and 1N4R recombinant fibrils. The first strategy, using limited proteolysis, allowed us to identify the proteolytic fragments composing the molecular “bar-code” for each type of fibril. The second strategy we optimized used chemical covalent surface labelling of accessible lysines, and qualitative and quantitative analysis of the biotinylated residues using mass spectrometry. We show that, while the N-terminal part of the protein remains accessible within 1N3R and 1N4R fibrils, the C-terminal region is protected within 1N3R yet solvent accessible for 1N4R assemblies. Our results pave the way to new molecular tools to discriminate tauopathies.

The conversion of the native monomeric cellular prion protein (PrPC) into an aggregated pathological β-oligomeric (PrPβ) and an infectious form (PrPSc) is the central element in the development of prion diseases. The structure of the aggregates and the molecular mechanisms of the conformational change involved in this conversion are still unknown. My research hypothesis was that a specific structural rearrangement of normal PrPC monomers leads to the formation of new inter-subunit interaction interfaces in the prion aggregates, leading to aggregation. My approach was to use constraints obtained by structural proteomic methods to create a 3D model of urea-acid induced recombinant prion oligomers (PrPβ). My hypothesis was that this model would explain the mechanism of the conformational change involved in the conversion, the early formation of the β-structure nucleation site, and would describe the mode of assembly of the subunits within the oligomer. I applied a combination of limited proteolysis, surface modification, chemical crosslinking and hydrogen/deuterium exchange (HDX) with mass spectrometry for the differential characterization of the native and the urea-acid converted prion β-oligomer structures to get an insight into the mechanism of the conversion and aggregation. Using HDX, I detected a region of the protein in which backbone amides become more protected from exchange in PrPβ compared to PrPC. In order to obtain the inter-residue distance constraints to guide the assembly of the oligomer model, I then applied zero-length and short-range crosslinking to an equimolar mixture of 14N/15N-metabolically labeled β-oligomer thereby enabling the classification of the crosslinks as either intra-protein or inter-protein. Working with the Dokholyan group at the University of North Carolina at Chapel Hill, I was able to assemble a structure of the β-oligomer based on the combination of constraints obtained from all methods. By comparing the structures before and after the conversion, I was able to deduce the conformational change, that occurs during the conversion as the rearrangement and disassembly of the beta sheet 1– helix 1 – beta sheet 2 (β1-H1-β2) region from the helix 2 – helix 3 (H2-H3) core, forming new β-sheet nucleation site and resulting in the exposure of hydrophobic residues patches leading to formation of inter-protein contacts within aggregates. / Graduate / 2018-06-14

Proteins and their intricate network of interactions are fundamental to many molecular processes that govern life. Mass spectrometry-based structural proteomics represents a powerful set of techniques for characterizing protein structures and interactions. The last decade has witnessed a large-scale adoption in the application of these techniques toward solving a variety of biological questions. Addressing these questions has often been coincident with the further development of these techniques. Insight into the structures of individual proteins and their interactions with other proteins in a proteome-wide context has been made possible by recent developments in the relatively new field of chemical crosslinking combined with mass spectrometry. In these experiments crosslinking reagents are used to capture protein-protein interactions by forming covalent linkages between proximal amino acid residues. The crosslinked proteins are then enzymatically digested into peptides, and the covalently-coupled crosslinked peptides are identified by mass spectrometry. These identified crosslinked peptides thus provide evidence of interacting regions within or between proteins. In this dissertation the development of tools and methods that facilitate this powerful technique are described. The primary arc of this work follows the development and application of mass spectrometry-based approaches for the identification of protein crosslinks ranging from those which exist endogenously to those which are introduced synthetically. Firstly, the development of a novel strategy for comprehensive determination of naturally occurring protein crosslinks in the form of disulfide bonds is described. Secondly, the application of crosslinking reagents to create synthetic crosslinks in proteins coupled with molecular dynamics simulations is explored in order to structurally characterize the intrinsically disordered tau protein. Thirdly, improvements to a crosslinking-mass spectrometry method for defining a protein-protein interactome in a complex sample is developed. Altogether, these described approaches represent a toolset to allow researchers to access information about protein structure and interactions. / Graduate