O objetivo deste trabalho foi elucidar a interação entre a proantocianidina (PA), um agente natural e não tóxico de ligação cruzada, e o colágeno dentinário tipo I. A hipótese proposta é que o modelamento de uma dentina desmineralizada mais resistente e com melhores propriedades propiciará um substrato mais estável e íntegro para restaurações adesivas. Para isto, o estudo foi dividido em 4 fases: 1) Validação da PA como agente exógeno de ligação cruzada, testando matrizes de dentina desmineralizadas tratadas com extratos a base de PA em teste microflexural para análise do módulo de elasticidade (ME), variando o tempo de exposição (10, 30, 60, 120, 240 min), o tipo de extrato usado (semente de uva-GSE, semente de cacau-CSE, oxicoco-CRE, canela-CNE e açaí-ACE) e a longevidade (imediato, 3, 6 e 12 meses); 2) Estudar parâmetros relacionados às soluções de PA, como solubilidade (água, etanol e acetona), fonte (GSE e CSE) e concentração (0,65%, 3,25%, 6,5%, 15% e 30%), através da mensuração do ME pelo teste micro-flexural de matrizes de dentina desmineralizada; 3) Caracterização da dentina tratada com PA (GSE e CSE), sorção de água, calorimetria e degradação enzimática; 4) Analisar a resistência de união entre a dentina tratada com PA (GSE/CSE) e sistemas de adesivos comerciais (Adapter Single Bond Plus e One Step Plus), variando a concentração (6,5% e 30%), tempo de exposição (1, 10 e 60 min) e longevidade (imediato, 3, 6 e 12 meses). Foram realizadas análises de variâncias e teste de contraste de médias, quando necessário, para todos os ensaios. Os resultados de ME foram influenciados pelo tratamento com PA, dependendo do tipo de extrato usado, exibindo os melhores resultados para o maior tempo de exposição (240 min) para os extratos GSE e CSE. Embora os resultados imediatos com os extratos CRE e CNE não tenham aumentado, estes se mantiveram constantes apos 1 ano de armazenamento, o que não aconteceu para o ACE e os grupos controles. A solubilidade das soluções é influenciada diretamente pelo modo de extração e manufaturação dos extratos, sendo que GSE é solúvel em água destilada e CSE em acetona-água. A efetividade do GSE mostrou ser concentração-dependente, exibindo o maior ME para a concentração de 30%. A dentina tratada com agentes a base de PA foi mais resistente contra a colagenase, obteve uma menor sorção de água e um aumento significativo na temperatura de desnaturação quando comparada ao grupo controle. O GSE foi capaz de aumentar a resistência de união (RU) imediata para ambos os sistemas adesivos, mantendo-se constante para o Adapter Single Bond Plus ao longo do tempo. Para o One Step Plus todos os grupos mostraram diminuição da RU após 1 ano, independente do tempo de exposição. Quando a dentina foi tratada por 1 minuto, os valores de RU para o grupo 30% de GSE foram maiores do que os demais e mantiveram-se constante pelo período de armazenamento. O efeito dos agentes ricos em PA mostrou ser concentração e tempo dependente, porém uma dentina mais resistente e estável ao longo do tempo é possível de ser obtida, levando-se em conta a estrutura química, conteúdo de PA, solubilidade e outros fatores inerentes ao extrato / The aim of this study was to elucidate the interaction between proanthocyanidin based extracts (PA), a natural and non-toxic cross-linker, and type I dentin collagen. The hypothesis is that if a stronger and more stable collagen layer is chemically engineered, the resultant hybrid layer will be stronger and less prone to degradation. So, this research was divided into four phases: 1) PA validation as an exogenous cross-linking agent, testing the elastic modulus (E) of demineralized dentin treated with various PA based extracts (grape seed-GSE, cocoa seed-CSE, cranberry-CRE, cinnamon-CNE, and açai berry-ACE), exposure times (10, 30, 60, 120, 240 min), and long term effectiveness (immediate, 3, 6 and 12 months); 2) Evaluation of different parameters related to PA solutions, like solubility (water, ethanol and acetone), manufacturer (GSE and CSE) and concentration (0.65%, 3.25% 6.5%, 15% and 30%), E was also obtained by micro-flexural strength measurements of demineralized dentin matrix, 3) Characterization of PA treated dentin (GSE and CSE): water sorption, calorimetry and enzymatic degradation and 4) Analyze the bond strength ( BS) of PA treated dentin (GSE / CSE) with commercial adhesives systems (Adapter Single Bond Plus-SB and One Step Plus-OS), varying concentration (6.5% and 30%), exposure time (1, 10 and 60 min) and long-term effectiveness (immediate, 3, 6 and 12 months). Data were statistically analyzed at a 95% confidence interval. GSE and CSE extracts showed a time-dependant effect and were able to improve and stabilize the E of the organic matrix. CRE and CNE extracts were able to maintain the E of collagen matrices constant after 12 months artifical saliva storage. ACE and controls groups showed no effect over dentin organic matrix, did not prevent degradation and consequently reduced the mechanical properties. Herbal extraction process and other pharmacognostic parameters have an important influence on extract solubility as well as constitution, therefore GSE is better dissolved in water and CSE in acetone-water. GSE effect on demineralized dentin is concentration-dependant, with highest E values at 30% GSE concentration. Dentin treated with PA-based agents was more resistant against enzymatic degradation, less susceptible to water sorption and showed a higher denaturation temperature. As compared to the controls, GSE stabilized the dentin-resin bond strength values over a period of one year for both adhesives, however better results were achieved with SB. CSE showed less predictable results depending on the adhesive system used. One minute treatment with 30% GSE was capable of increasing short-term BS and stabilizing it for at least 6 months. Increased mechanical properties and stability of dentin matrix can be achieved by the use of PA-rich collagen crosslinkers regarding inherent characteristics of the natural compounds as chemical structure, solubility and PA content.

O objetivo deste trabalho foi elucidar a interação entre a proantocianidina (PA), um agente natural e não tóxico de ligação cruzada, e o colágeno dentinário tipo I. A hipótese proposta é que o modelamento de uma dentina desmineralizada mais resistente e com melhores propriedades propiciará um substrato mais estável e íntegro para restaurações adesivas. Para isto, o estudo foi dividido em 4 fases: 1) Validação da PA como agente exógeno de ligação cruzada, testando matrizes de dentina desmineralizadas tratadas com extratos a base de PA em teste microflexural para análise do módulo de elasticidade (ME), variando o tempo de exposição (10, 30, 60, 120, 240 min), o tipo de extrato usado (semente de uva-GSE, semente de cacau-CSE, oxicoco-CRE, canela-CNE e açaí-ACE) e a longevidade (imediato, 3, 6 e 12 meses); 2) Estudar parâmetros relacionados às soluções de PA, como solubilidade (água, etanol e acetona), fonte (GSE e CSE) e concentração (0,65%, 3,25%, 6,5%, 15% e 30%), através da mensuração do ME pelo teste micro-flexural de matrizes de dentina desmineralizada; 3) Caracterização da dentina tratada com PA (GSE e CSE), sorção de água, calorimetria e degradação enzimática; 4) Analisar a resistência de união entre a dentina tratada com PA (GSE/CSE) e sistemas de adesivos comerciais (Adapter Single Bond Plus e One Step Plus), variando a concentração (6,5% e 30%), tempo de exposição (1, 10 e 60 min) e longevidade (imediato, 3, 6 e 12 meses). Foram realizadas análises de variâncias e teste de contraste de médias, quando necessário, para todos os ensaios. Os resultados de ME foram influenciados pelo tratamento com PA, dependendo do tipo de extrato usado, exibindo os melhores resultados para o maior tempo de exposição (240 min) para os extratos GSE e CSE. Embora os resultados imediatos com os extratos CRE e CNE não tenham aumentado, estes se mantiveram constantes apos 1 ano de armazenamento, o que não aconteceu para o ACE e os grupos controles. A solubilidade das soluções é influenciada diretamente pelo modo de extração e manufaturação dos extratos, sendo que GSE é solúvel em água destilada e CSE em acetona-água. A efetividade do GSE mostrou ser concentração-dependente, exibindo o maior ME para a concentração de 30%. A dentina tratada com agentes a base de PA foi mais resistente contra a colagenase, obteve uma menor sorção de água e um aumento significativo na temperatura de desnaturação quando comparada ao grupo controle. O GSE foi capaz de aumentar a resistência de união (RU) imediata para ambos os sistemas adesivos, mantendo-se constante para o Adapter Single Bond Plus ao longo do tempo. Para o One Step Plus todos os grupos mostraram diminuição da RU após 1 ano, independente do tempo de exposição. Quando a dentina foi tratada por 1 minuto, os valores de RU para o grupo 30% de GSE foram maiores do que os demais e mantiveram-se constante pelo período de armazenamento. O efeito dos agentes ricos em PA mostrou ser concentração e tempo dependente, porém uma dentina mais resistente e estável ao longo do tempo é possível de ser obtida, levando-se em conta a estrutura química, conteúdo de PA, solubilidade e outros fatores inerentes ao extrato / The aim of this study was to elucidate the interaction between proanthocyanidin based extracts (PA), a natural and non-toxic cross-linker, and type I dentin collagen. The hypothesis is that if a stronger and more stable collagen layer is chemically engineered, the resultant hybrid layer will be stronger and less prone to degradation. So, this research was divided into four phases: 1) PA validation as an exogenous cross-linking agent, testing the elastic modulus (E) of demineralized dentin treated with various PA based extracts (grape seed-GSE, cocoa seed-CSE, cranberry-CRE, cinnamon-CNE, and açai berry-ACE), exposure times (10, 30, 60, 120, 240 min), and long term effectiveness (immediate, 3, 6 and 12 months); 2) Evaluation of different parameters related to PA solutions, like solubility (water, ethanol and acetone), manufacturer (GSE and CSE) and concentration (0.65%, 3.25% 6.5%, 15% and 30%), E was also obtained by micro-flexural strength measurements of demineralized dentin matrix, 3) Characterization of PA treated dentin (GSE and CSE): water sorption, calorimetry and enzymatic degradation and 4) Analyze the bond strength ( BS) of PA treated dentin (GSE / CSE) with commercial adhesives systems (Adapter Single Bond Plus-SB and One Step Plus-OS), varying concentration (6.5% and 30%), exposure time (1, 10 and 60 min) and long-term effectiveness (immediate, 3, 6 and 12 months). Data were statistically analyzed at a 95% confidence interval. GSE and CSE extracts showed a time-dependant effect and were able to improve and stabilize the E of the organic matrix. CRE and CNE extracts were able to maintain the E of collagen matrices constant after 12 months artifical saliva storage. ACE and controls groups showed no effect over dentin organic matrix, did not prevent degradation and consequently reduced the mechanical properties. Herbal extraction process and other pharmacognostic parameters have an important influence on extract solubility as well as constitution, therefore GSE is better dissolved in water and CSE in acetone-water. GSE effect on demineralized dentin is concentration-dependant, with highest E values at 30% GSE concentration. Dentin treated with PA-based agents was more resistant against enzymatic degradation, less susceptible to water sorption and showed a higher denaturation temperature. As compared to the controls, GSE stabilized the dentin-resin bond strength values over a period of one year for both adhesives, however better results were achieved with SB. CSE showed less predictable results depending on the adhesive system used. One minute treatment with 30% GSE was capable of increasing short-term BS and stabilizing it for at least 6 months. Increased mechanical properties and stability of dentin matrix can be achieved by the use of PA-rich collagen crosslinkers regarding inherent characteristics of the natural compounds as chemical structure, solubility and PA content.

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T16:09:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Koolen_HectorHenriqueFerreira_D.pdf: 16550075 bytes, checksum: 0fafb8ced0640f9080c108d7cb303ac4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A espectrometria de massas (MS) consiste no estudo de íons na fase gasosa. O grande salto na utilização da MS devido ao desenvolvimento dos métodos de ionização por eletrospray (ESI), por J. B. Fenn e ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI) por M. Karas e F. Hillenkamp no final da década de 80 abriu espaço para o desenvolvimento de novos equipamentos, desta forma expandindo em muito a capacidade de análise de diversos analitos. Misturas complexas constituem um desafio até hoje, onde diversas técnicas são empregadas com o objetivo de se entender a constituição destas matrizes. Neste contexto a MS vêm sendo utilizada em conjunto com a mobilidade iônica (IM) em estudos com diversos analitos, como por exemplo, em proteômica e petroleômica. Este trabalho é constituído por dois capítulos, onde na primeira parte as técnicas foram utilizadas em experimentos de proteômica estrutural por meio de ligação cruzada. Estudos Fundamentais foram conduzidos de modo a serem exploradas as misturas complexas de peptídeos provenientes de experimentos utilizando-se uma classe pouco explorada de reagentes de ligação cruzada (imidoésteres). Para o segundo capítulo a mesmas técnicas foram utilizadas nas análises da fração pesada (asfaltenos) de petróleos brasileiros. A simplificação das amostras juntamente com a caracterização estrutural destes compostos por meio de suas sessões de choque de colisão (CCS) constituiu a estratégia de análise para este capítulo. Como resultados da primeira parte têm-se o estabelecimento das rotas de fragmentação de peptídeos modificados pelo reagente de ligação cruzada dimetil suberoimidato e a aplicação do mesmo em experimentos com sistemas proteicos reais. A IM foi aplicada de modo a se separar as espécies geradas após os experimentos reacionais dos peptídeos não modificados por meio de seus estados de carga o que possibilitou, uma rápida e simplificação deste tipo de mistura. Como resultados da segunda parte desta tese a IM foi empregada na caracterização das CCS de compostos modelo de asfaltenos e posteriormente em íons representativos da fração pesada. Os resultados foram validados mediante cálculos teóricos e espectrometria de massas de ultra-alta resolução. Os dados obtidos vão de encontro com os modelos de estruturas de arquitetura do tipo ilha previstos no modelo de Yen-Mullins, constituindo desta forma o primeiro estudo estrutural de asfaltenos usando-se estas técnicas combinadas / Abstract: Mass spectrometry (MS) constitutes the study of ions in the gas-phase, being the structural elucidation the main application of MS. With the development of ionization techniques such as electrospray (ESI), by J. B. Fenn and matrix assisted laser desorption by M. Karas and F. Hillenkamp in the later 80¿s allowed the development of new instruments, providing an expansion of the array of analytes suitable for MS analysis. Complex mixtures constitute a challenge nowadays, where diverse techniques are employed with the objective of understanding the chemical composition of such matrixes. In this sense MS have been used along with ion mobility (IM) in the study of different analytes (e.g. in Proteomics and Petroleomics). This works comprises two chapters, where in the first one the techniques were applied in structural proteomics by means of chemical cross-linking experiments. Fundamental studies were carried to explore complex mixtures of tryptic peptides after experiments with imidoesters reagents. For the second chapter the same techniques were applied in the analysis of the polar fraction of Brazilian petroleum¿s (asphaltenes), where beyond separations an structural study was carried out to verify the existing models regarding asphaltene structure. As results of the chapter 1 the behavior at the gas-phase of the peptides upon dissociation techniques was elucidated (fragmentation studies). The validation of imidates as cross-linking reagents was performed to real proteins. IM was applied to separate different charge states created by the modified peptides generated by the imidate reagent. As results from the second chapter IM was successfully applied, were the comparison with model compounds was done employing also other MS techniques such as ultra-high resolution (UHR) MS. The findings of this chapter reinforce the Yen-Mullins model that describes asphaltenes as compounds possessing island structures / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T09:14:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_LuizFernandoArruda_D.pdf: 7340905 bytes, checksum: 51f81b49c01047e52881271fa910fada (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A função de uma proteína está diretamente relacionada com sua estrutura e conhecendo a estrutura de uma proteína é possível verificar onde estão localizados e como agem seus sítios ativos e de interação. Dentre os métodos empregados para análise estrutural de proteínas por espectrometria de massas (MS), experimentos de ligação cruzada vêm recebendo grande destaque. Nestes experimentos, após digestão enzimática três tipos de peptídeos contendo agentes de ligação cruzada (ALCs) podem ser formados: espécies intramoleculares, quando o ALC está ligado entre dois resíduos do mesmo peptídeo; espécies intermoleculares, quando o ALC une dois peptídeos distintos e dead-end, quando o ALC liga-se apenas a um resíduo, sendo que o outro lado de sua cadeia normalmente sofre hidrólise. A etapa crucial em experimento de ligação cruzada consiste na correta atribuição e identificação dos peptídeos modificados por ALC, etapa que pode ser facilitada conhecendo a fragmentação destes peptídeos. Desse modo, o foco principal deste trabalho foi realizar experimentos de fragmentação das diferentes espécies de peptídeos modificados por ALCs utilizando metodologias baseadas na técnica de espectrometria de massas, como dissociação induzida por colisão (CID), dissociação multifotônica por infravermelho (IRMPD) e dissociação por captura de elétrons (ECD). Os estudos realizados proporcionaram a visualização de um padrão de fragmentação de espécies inter e intramoleculares, bem como a presença de íons diagnósticos, capazes de auxiliar na identificação de peptídeos modificados por ACLs. Além disso, a técnica de mobilidade iônica, que consiste na separação de íons baseado em suas seções de choque, acoplada à espectrometria de massas (IMMS), foi emprega para realizar estudos para caracterização de peptídeos modificados por ALCs. Utilizando IMMS foi possível realizar a separação de espécies isoméricas do tipo dead-end, bem como verificar que peptídeos lineares e modificados por ALC, com m/z próximos possuem seções de choque semelhantes / Abstract: There are several advantages associated with the use of mass spectrometry (MS) applied to structural studies of proteins, such as unlimited mass of target protein or protein complex, very low time and sample consumption, ease of manipulation and interpretation of the data obtained. In chemical cross-linking coupled to MS, bifunctional reagents (cross-linkers, XL) are used to generate covalent bonds between the side chains of specific residues (usually lysine) and the distance constraints obtained are then used to model the structure of the protein and reveal interacting regions in the case of protein complexes. After enzymatic digestion, three types of peptides modified by the XL can be generated: intramolecular cross-linked, in which the cross-linker is linked to two residues of the same peptide; intermolecular cross-linked, when the reagent connects two peptides; and ¿dead-end¿, that occurs when the cross-linker is bound to only one residue and the other side is usually hydrolyzed. The critical step in a cross-linking experiment is the correct attribution and identification of the modified peptides, which is in turn based on the fragmentation of such species. So, the main focus of this work is to perform fragmentation studies of cross-linked peptides and rationalize fragmentation models to aid in the correct identification and attribution of modified peptides. In our studies we verified a fragmentation pattern of modified peptides, as well as diagnostic fragment ions, able to help in the identification of cross-linked peptides. Studies of ion mobility (IMS) coupled to mass spectrometry (IMMS) to analyze cross-linked peptides were also performed. It was possible to separate dead-end isomers and it was verified that linear and modified peptides, of similar m/z have similar collision cross-section / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador: Fabio Cesar Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T20:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Figueiredo_AlanadosReis_M.pdf: 3529338 bytes, checksum: 3761ab750ec289d682a00aae3d02ea4b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A espectrometria de massas (MS) desempenha um papel fundamental na proteômica, pois permite a identificação de proteínas, seqüenciamento de peptídeos, determinação de modificações pós-traducionais e análise quantitativa de expressão. Além das análises envolvendo a estrutura primária, há um grande interesse em se aplicar MS para análise de estruturas superiores (terciárias e quaternárias) de proteínas e uma das abordagens promissoras nesta área é a MS acoplada à ligação cruzada. Nesta abordagem, um reagente bifuncional liga covalentemente resíduos de aminoácidos espacialmente próximos e a distância máxima entre esses resíduos é dado pelo tamanho do agente de ligação cruzada (ALC). Nesse trabalho avaliou-se a extensão e exatidão das distâncias interresíduos tanto por simulações de dinâmica molecular quanto por experimentos de MS. As faixas de distâncias calculadas mostram que há sempre uma distância mínima entre resíduos ao qual o ALC pode se ligar, além de determinar o valor máximo para cada um dos ALC estudados (DSG, DSS e DSSeb). Os dados experimentais com proteínas modelo (Ubiquitina, Citocromo C e Mioglobina) mostraram ainda que todos dos peptídeos que apresentavam ligações cruzadas estavam dentro da faixa de alcance determinadas pelas simulações de dinâmica molecular, confirmando a exatidão do método. Os novos valores de tamanho das moléculas de ALC estudados podem agora ser utilizados para a determinação de estruturas superiores de proteínas através da técnica de MS acoplada a ligação cruzada / Abstract: Mass spectrometry (MS) plays a key role in proteomics because it allows the identification of proteins, peptide sequencing, determination of post-translational modifications and quantitative expression analysis. There is a great interest in using MS to perform analysis beyond the primary structure, i. e. tertiary and quaternary structures, and one of the most promising approaches in this filed is MS coupled to cross-linking technique. In this approach, a bifunctional reagent covalently binds amino acid residues that are close in space and the maximum distance between these residues is given by the arm length of the cross-linking agent. In this study we evaluated the extent and accuracy of the inter-residues distances by both molecular dynamics simulations and MS experiments. Simulated distance ranges showed that there is a minimum distance between residues to which the reagent can bind and a maximum value for each of the studied reagents (DSG, DSS and DSSeb). The experimental data from model proteins (Ubiquitin, Cytochrome C and Myoglobin) also showed that all the detected modified peptides were within the ranges determined by the molecular dynamics simulations, confirming the accuracy of the method. The new space arm length values of the reagent molecules can now be used for the determination of proteins higher structures by the MS coupled to cross-linking technique / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Fábio César Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T06:35:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_TatianiBrenellide_M.pdf: 10987476 bytes, checksum: 5ef2abf84b79afba4ad901cc1e46c719 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A espectrometria de massas (MS) tem sido bastante utilizada em analises de amostras biológicas, tornando uma ferramenta indispensável para pesquisas na área de proteômica. A ligação cruzada é um processo de união covalente entre dois átomos espacialmente próximas. A ligação cruzada acoplada a MS permite estudos estruturais de proteínas baseado nas restrições de distância determinadas pelos espécies inter- intra-moleculares ligadas entre as cadeias laterais de resíduos de aminoácidos. Essa técnica vem sendo bastante utilizada na análise de interação entre proteínas, entretanto, um aspecto pouco explorado é a analise estrutural de proteínas. O objetivo desse trabalho foi determinar as estruturas terciárias e quaternárias de proteínas de chaperonas moleculares de cana-de-açúcar ou proteínas de choque térmico (do inglês, sugarcane heat shock protein, SHsp) utilizando a técnica de ligação cruzada acoplada com MS e modelagem molecular. As restrições de distâncias obtidas pela ligação cruzada e o gráfico de Ramanchandran foram utilizados para validar as estruturas tridimensionais da SHsp70 e SHsp90 obtidas por modelagem por homologia. Informações adicionais de dinâmica e flexibilidade da SHsp90 foi obtida pela técnica de troca hidrogênio/deutério. As chaperonas moleculares são proteínas importantes presentes em células para evitar o enovelamento incorreto de outras proteínas e suas agregações. Em plantas, fatores que corroboram com a tolerância ao estresse ainda são pouco compreendidos, mas provavelmente as chaperonas moleculares desempenha um papel importante no controle aos danos desse organismo. Desse modo, caracterizar estruturas de Hsp de cana de açúcar é uma informação essencial para a compreensão do mecanismo deste acompanhante de ação. Os estudos estruturais baseados em ligação cruzada acoplada a MS e modelagem por homologia permitiu propor um modelo estrutural para SHsp90 e SHsp70 / Abstract: Mass spectrometry (MS) has been extensively used to analyze biological samples and has advanced as an indispensable tool for proteomics research. Cross-linking is the process of chemically joining two spatially close atoms by covalent bond. The chemical cross-linking coupled to MS allows structural studies of protein based on distance constrains determined by inter- and intra-molecular cross-link between side chains of amino acids residues. This technique has been normally used to analyze protein-protein interaction but is mostly unexplored for structural analysis of proteins. The aim of this work was to investigate tertiary and quaternary structure of sugarcane molecular chaperone or heat shock protein (SHsp) using chemical cross-linking coupled to MS and homology modeling. The distance constrains obtained by chemical crosslinking and Ramachandran plot were used to validate tridimensional structures of SHsp70 and SHsp90 that was predicted by homology modeling. Additional information about flexibility and dynamics of SHsp90 was obtained using hydrogen/deuterium exchange (HDX) coupled to MS. The molecular chaperones are important proteins present in cell that helps prevent incorrect folding of proteins and their aggregation. The stress tolerance in plants is still poorly understood, but heat shock proteins likely play a large role in the plant damage control machinery. Thereby, characterizing Sugarcane Hsp structures is essential information toward the understanding of this chaperone¿s mechanism of action. The structural study of molecular chaperones by chemical cross-linking coupled to MS and homology modelling allowed the generation of a structural model for SHsp90 and SHsp70 / Mestrado / Quimica Organica / Mestra em Química

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-20T04:44:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fioramonte_Mariana_M.pdf: 6585272 bytes, checksum: 7fcc677288d272f3c92f3e3116d43fa5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Ligação cruzada acoplada à espectrometria de massas (MS) é uma técnica que permite a caracterização estrutural de proteínas e complexos proteicos, especialmente nos casos em que estes não são passíveis de serem analisados por técnicas de alta resolução. O experimento baseia-se na reação de uma proteína ou no complexo proteico com um reagente bifuncional (agente de ligação cruzada, ALC) seguido de análise proteômica shotgun por MS. Isso trás para a técnica todas as vantagens da MS, como alta sensibilidade, rapidez de análise e facilidade de uso. Somente resíduos de aminoácidos espacialmente próximos podem ser ligados covalentemente pelo ALC, de forma que os peptídeos contendo a ligação cruzada, identificadas por MS, servem como restrições de distância entre os aminoácidos na estrutura nativa da proteína ou complexo proteico. O conjunto de peptídeos contendo a ligação cruzada fornece, assim, um conjunto de restrições de distâncias entre os aminoácidos que pode ser utilizado para montar um modelo molecular da proteína ou do complexo. O objetivo principal deste trabalho foi a aplicação da técnica de ligação cruzada acoplada a espectrometria de massas no mapeamento da interação entre as proteínas quinase de adesão focal (FAK), através de seu domínio FERM, e miosina. Esse complexo proteico está envolvido na sinalização molecular para o processo de hipertrofia cardíaca. A hipertrofia cardíaca é considerada um mecanismo de adaptação do miocárdio em resposta a sobrecargas hemodinâmicas e está associada com risco de desenvolvimento de insuficiência cardíaca, arritmias e morte súbita. Estímulos mecânicos são considerados os principais ativadores primários das respostas que conduzem às alterações fenotípicas do miocárdio nas várias doenças cardíacas. A caracterização estrutural do complexo FAK/miosina ao nível molecular permitiu a criação de um modelo molecular deste complexo, que foi validado através de mutações na região de interação entre as proteínas. Esse modelo permite que se entenda o processo de sinalização da hipertrofia ao nível molecular / Abstract: Chemical cross-linking coupled with mass spectrometry (MS) is a technique that allows the structural characterization of proteins and protein complexes, especially when these proteins are not amenable to be analyzed by high resolution techniques. The experiment is based on ther eaction of a protein or protein complex with a bifunctional reagent (cross-linking agent, ALC) followed by shotgun proteome analysis by MS. This brings to the technique all the advantages of MS, such as high sensitivity, short analysis time and ease of use. Only spatially close amino acid residues can be covalently bound by the reagent, so that the cross-linked peptides, identified by MS, serve as distance constraints between amino acids in the native structure of the protein or protein complex. The set of cross-linked peptides thus provides a set distance constraints among amino acids that can be used to build a molecular model of the protein or complex. The main objective of this work was to apply the cross-linking technique coupled to MS to map the interaction between the proteins Focal Adhesion Kinase (FAK), through its FERM domain, and myosin. This protein complex is involved in molecular signaling of the cardiac hypertrophy process. Cardiac hypertrophy is considered an adaptative mechanism of the myocardium in response to hemodynamic overload and it is associated with risk of developing heart failure, arrhythmias and sudden death. Mechamical stimuli are considered the main activator of the primary responses that lead to phenotypic changes of the myocardium in many cardiac diseases. The structural characterization of the complex FAK/myosin at the molecular level has allowed the creation of a molecular model of this complex, which was validated by mutations in the region of interaction between the proteins. This model allows the understanding the signaling processes of hypertrophy at the molecular level / Mestrado / Quimica Organica / Mestra em Química

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T10:34:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferrari_AllanJhonathanRamos_M.pdf: 2074796 bytes, checksum: a9fd65df7da4d527a33e2ef562c91f73 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Stanniocalcina-1 (STC1) é um hormônio glicoproteico que apresenta padrão de expressão diferencial destacado em diversas patologias, notadamente em neoplasias, mas seus aspectos funcionais e estruturais são pouco explorados até o momento. Nesse sentido, a STC1 foi escolhida como alvo para a utilização de uma abordagem integrativa das técnicas que utilizam os reagentes de ligação cruzada, espectrometria de massas e modelagem molecular para a modelagem estrutural. A partir dos experimentos de ligação cruzada, foram obtidas 37 restrições de distância envolvendo espécies ligadas com DSS, sendo 11 destas espécies com N-terminal e uma restrição envolvendo a espécie dimérica, além das cinco ligações de dissulfeto já publicadas. Essas restrições foram utilizadas para a geração de modelos estruturais nas plataformas online I-Tasser e Quark e, localmente, mais de 100.000 modelos pelo protocolo Ab Initio Relax do software Rosetta em quatro diferentes condições iniciais de modelagem. O Rosetta apresentou maior eficiência na geração de modelos quando ausente arquivo de predição de estrutura secundária. As restrições de distância foram ferramenta discriminatória fundamental para a seleção de estruturas candidatas para a STC1. O agrupamento utilizando o parâmetro global distante test (gdt) das 1500 modelos de menor score que respeitavam todas as restrições identificou 22 estruturas representativas estruturalmente distintas. Essas estruturas representativas podem agora ser utilizadas em testes envolvendo substituição molecular nos dados de difração de raios-X / Abstract: The Stanniocalcin-1 (STC1) is a glycoproteic hormone, which shows a differential expression pattern in a variety of pathologies, especially in neoplasia, but its functional and structural aspects have not been explored. Accordingly, the STC1 was chosen as a target to the use of an integrative approach including chemical cross-linking, mass spectrometry and molecular modeling. From cross-linking experiments,37 distance constrains were identified involving the DSS cross-linker, 11 of them in the N-terminus part of the protein and one involving the dimeric specie, in addition to five disulfide bonds already published. These constrains were used to generate structural models by I-Tasser and Quark online platforms and, locally, more than 100,000 models in the Ab Initio Relax protocol package present in the Rosetta software in four different modeling conditions. Rosetta was the most efficient in generating models when secondary structure prediction was absent. The distance constrains were found to be a key discriminatory tool for the selection of candidate structures for the STC1. For the 1,500 lowest score structures that satisfied the distance constrains, the clustering method employing the global distance test parameter (gdt) identified 22 structurally distinct representative structures. These representative structures can be used to in molecular replacement test to solve the X-Ray diffraction data / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_AlexandreFerreira_D.pdf: 12902505 bytes, checksum: 9ee986003caba0a232a59bff99ccc97d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Este trabalho foi dividido em dois capítulos, tendo como temática geral a aplicação de técnicas modernas baseadas em espectrometria de massas (MS) no estudo da biotransformação de fármacos (capítulo I) e em proteômica estrutural por ligação cruzada e mobilidade iônica (capítulo II). No capítulo I, foram estudadas rotas de fragmentação por dissociação induzida por colisão (CID), perfis de metabólitos in vivo em ratos e farmacocinética de derivados de 4-anilinoquinazolina, candidatos a inibidores da enzima adenosina quinase (AK), tendo por essa razão potencial terapêutico no tratamento de doenças como hipertensão, Diabetes mellitus, psoríase e doenças inflamatórias crônicas. O comportamento desses compostos em MS foi inicialmente avaliado com base em suas rotas de fragmentação em fase gasosa por MS sequencial, com auxílio de cálculos teóricos para íons precursores e fragmentos em fase gasosa. Esse conhecimento foi então aplicado na determinação dos perfiis de metabólitos de fases I e II in vivo em ratos e de sua farmacocinética utilizando-se métodos de cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a MS (UPLC-MS). Os resultados permitiram estabelecer as principais vias de fragmentação por CID para essa classe de compostos, bem como os principais metabólitos observados in vivo. No capítulo II, foram realizados estudos fundamentais em proteômica estrutural por MS. Nesse âmbito, o efeito de modificações covalentes advindas de reações de ligação cruzada nas conformações de proteínas-modelo foi investigado empregando-se a técnica de mobilidade iônica acoplada a MS (IM-MS) em duas abordagens instrumentais distintas, que permite determinar as seções de choque de colisão (CCS) de íons em fase gasosa. Os resultados obtidos dos experimentos de IM-MS, aliados a dados provenientes de simulações de dinâmica molecular (MD) dos sistemas em questão, permitiram concluir que as modificações de ligação cruzada aumentam a resistência dos íons de proteína em fase gasosa ao processo de desenovelamento, e geram íons mais compactos em fase gasosa (menor CCS). Um modelo foi proposto para explicar esse fenômeno, correlacionando as conformações observadas com a carga líquida e densidade de carga dos íons de proteínas em fase gasosa / Abstract: This work was divided in two chapters, both grouped under the general theme of application of modern mass spectrometry (MS)-based techniques to the study of drug biotransformation (chapter I) and in structural proteomics by chemical cross-linking and ion mobility (chapter II). In chapter I, collision-induced dissociation (CID) routes, in vivo rat metabolite profiles and pharmacokinetics of a series of 4-anilinoquinazoline derivatives were studied. These derivatives are potential adenosine kinase (AK) inhibitors, having therapeutic potential in treatment of diseases such as hypertension, Diabetes mellitus, psoriasis and chronic inflammatory diseases. The mass spectrometric behavior of such derivatives was initially evaluated in terms of their fragmentation routes by sequential MS, aided by theoretical calculations for gas phase precursor and fragment ions. This knowledge was then applied in the determination of in vivo phase I and II metabolite profiles in rats, as well as pharmacokinetics, using ultra performance liquid chromatography coupled to MS (UPLC-MS). Results allowed the establishment of main CID fragmentation routes for this class of compounds, as well as the main metabolites observed in vivo. The focuses of chapter II were fundamental studies in structural proteomics by a combination of chemical cross-linking, ion mobility and MS. More specifically, the effect of covalent modifications introduced by chemical cross-linking in the conformations of model proteins was investigated by ion mobility-MS (IM-MS) techniques, which allows the determination of collision cross sections (CCS) for gas phase ions. Results from IM-MS experiments, together with data from molecular dynamics (MD) simulations of the studied systems, indicate that the cross-linking modifications increase the resistance of protein ions to gas phase unfolding, also generating more compact ions in the gas phase (smaller CCS). A model was developed to explain this phenomenon, correlating the observed conformations with net charge and charge density of the gas phase protein ion / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador: Josimeri Hebling / Resumo: Objetivo: Avaliar a estabilidade mecânica e a atividade proteolítica de interfaces produzidas pela apliação de um adesivo convencional simplificado sobre a dentina biomodificada e seca. Métodos: Superfícies planas de dentina coronária foram criadas em 64 molares hígidos. Os dentes foram divididos em 4 grupos de acordo com a solução aplicada sobre a dentina condicionada: extrato de semente de uva 5% (GSE), glutaraldeído 5% (GD), Gluma Desensitizer ou água (controle). As soluções foram aplicadas por 60s seguido de lavagem e secagem com papel absorvente. Os dentes foram então subdivididos em dois grupos, nos quais a dentina condicionada foi mantida úmida ou foi seca com ar por 60s. O adesivo Optibond foi aplicado e em seguida foi construído um cilindro de resina. Decorridas 24h, os dentes foram cortados em espécimes (0,81 mm2 ), submetidos ao ensaio de microtração imediatamente ou após 12 meses de envelhecimento. Os mesmos procedimentos adesivos foram realizados em 32 dentes adicionais. Esses dentes foram seccionados em fatias de 0,5 mm de espessura, preparadas para os ensaios de nanoinfiltração e zimografia in situ (EnzChek). Os dados de resistência de união foram submetidos aos testes de ANOVA e Tukey (p<0,05), e os ensaios de nanoinfiltração e zimografia in situ foram apresentados descritivamente. Resultados: Redução significante da resistência de união imediata (ca. 65%) e aumento da atividade proteolítica e nanoilfiltração foi observado em interfaces produzidas sobre a dent... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objective: To evaluate the mechanical stability and the proteolytic activity of bonds created by a one-step, etch-and-rinse adhesive applied to cross-linked and air-dried etched dentin. Methods: Flat coronal dentin surfaces were produced in 64 sound molars. The teeth were divided into 4 groups according to the solution applied on the etched dentin: 5% grape seed extract, 5% glutaraldehyde, Gluma Desensitizer or deionized water (control). Solutions were applied for 60s followed by rinse and blot drying. Then, the teeth were separated into two subgroups: the etched dentin was kept moist or air dried for 60s. Optibond was applied followed by a composite resin buildup. After 24h, the teeth were cut into beams (0.81 mm²) which were microtensile tested immediately or after 12mo of storage. Additional teeth (n=32) were bonded as described and cut into 0.5 mm-thick slabs. The slabs were prepared for nanoleakage and in situ zymography analyses (EnzChek). Bond strength data were submitted to ANOVA and Tukey tests (p<0.05) while nanoleakage and zymography data were descriptively reported. Results: Significant reduction in bond strength (ca. 65%) and increase of the proteolytic activity was seen when the etched dentin was air-dried without previous biomodification. Conversely, bond strengths did not differ from those produced on wet dentin when collagen was cross-linked before air-drying, irrespective of the solution. For both moist and air-dried etched dentin, collagen cross-linking res... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre