Le canal sodique épithélial sensible à l'amiloride (ENaC) est une protéine composée de trois sous unités similaires [alpha][bêta][gamma] codées par trois gènes distincts et associées en un complexe hétérotétramérique [alpha]2[bêta][gamma]. ENaC est localisée au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales à jonctions serrées. C'est une protéine clé de la réabsorption du sodium au niveau du néphron distal, des voies aériennes supérieures et du colon distal. Son rôle dans la régulation du volume extracellulaire et la pression sanguine a été renforcé par la découverte de deux maladies génétiques humaines liées à la fonction du canal : le syndrome de Liddle et le pseudoaldostéronisme de type I (PHA I) due respectivement à un gain et une perte de fonction du canal. L'activité et l'expression de ce dernier sont finement régulées. Sa régulation par les sérines protéases et le sodium extracellulaire (auto-inhibition) a été mis en évidence par Chraïbi et collaborateurs en 1997, mais peu de choses sont connues sur les mécanismes et le rôle fonctionnel de la boucle extracellulaire dans ces différentes voies de régulation. Notre objectif est d'identifier les sites potentiels impliqués dans ces différentes voies de régulation. Pour ce faire, des mutations au niveau de la partie terminale de la boucle extracellulaire des sous unités [alpha], [bêta] et [gamma] du canal ont été réalisées par mutagenèse dirigée et l'effet des sérines protéases et du sodium extracellulaire a été étudié. Nos résultats, obtenus par la technique de voltage-clamp à deux électrodes, montrent que le domaine WPS (un domaine conservé dans les trois sous unités des différentes espèces et situé au niveau de la partie terminale de la boucle extracellulaire du canal) est impliqué dans la régulation d'ENaC par les sérines protéases et le sodium extracellulaire. Nous avons montré plus particulièrement que le tryptophane [alpha]W453 a un rôle fonctionnel majeur dans ces deux voies de régulation. Sa substitution par une arginine au niveau de la sous unité [alpha] rend ENaC résistant à la trypsine et abolit totalement l'inactivation du canal par le sodium extracellulaire. Par contre, la même mutation au niveau de la sous unité [gamma] ne change ni la réponse du canal à la trypsine ni sa sensibilité au sodium extracellulaire, alors que les canaux portant la mutation W/R au niveau de la sous unité [bêta] ont une sensibilité intermédiaire. L'ensemble de ces résultats montre le rôle fonctionnel de la boucle extracellulaire d'ENaC dans la régulation du canal par les sérine-protéases et le sodium extracellulaire.

Clostridium difficile est une bactérie Gram positive anaérobique responsable de plusieurs perturbations intestinales suite à la prise d’antibiotiques et est également reconnue comme une cause majeure de la colite pseudomembraneuse. La pathogenèse des infections à C. difficile est principalement associée aux toxines A et B, qui ont été largement étudiées dans les dernières années. Cependant, plusieurs autres aspects de la virulence de ce pathogène sont encore bien mal compris. Un bon nombre de protéines font partie de l’arsenal de facteurs de virulence qui jouent un rôle au niveau de l’adhésion de la bactérie ou qui dégradent certaines composantes de la paroi intestinale afin de permettre à la bactérie de coloniser son hôte. La régulation de l’expression de telles protéines nous permettrait d’en connaître davantage sur la colonisation de l’hôte par C. difficile. Chez plusieurs espèces bactériennes, le 3’5’ diguanosine monophosphate cyclique (c-di-GMP) est un second messager important qui régule plusieurs phénotypes. La formation de biofilm ainsi que la régulation de la transition de cellules motiles à un mode de persistance sont parmi les fonctions connues du c-di-GMP. Toutefois, la diversité des processus physiologiques bactériens régulés par le c-di-GMP reste encore pour la plupart peu expliquée chez les bactéries à Gram positif. Chez certaines bactéries, le c-di-GMP est impliqué dans le contrôle de la régulation de l’expression de gènes, via la liaison à des récepteurs à ARN, les riborégulateurs. Les riborégulateurs sont des séquences d’ARN non codants localisés dans la partie 5’UTR d’un ARNm et régulant l’expression de gènes par la liaison d’un ligand à son aptamère comme le c-di-GMP. Cette étude s’intéresse à la régulation et à la fonction des gènes CD2831 et CD2830 qui sont regroupés en un seul locus. L’expression de ces gènes est contrôlée par les niveaux de c-di-GMP intracellulaire via deux riborégulateurs en amont de ces gènes. Chez C. difficile, deux classes de riborégulateurs à c-di-GMP, de fonction similaire, mais qui diffèrent structurellement, ont été rapportées; c-di-GMP-I et c-di-GMP-II. L’expression relative du gène CD2830 en aval du riborégulateur à c-di-GMP de type I diminue de 23 à 29 fois lorsque le niveau de c-di-GMP intracellulaire augmente, tandis que pour les mêmes conditions, le gène CD2831 en aval du riborégulateur à c-di-GMP II était de 72 à 96 fois plus exprimé. Des essais β-galactosidase avec des fusions des riborégulateurs et lacZ, ont démontrés que l’expression des gènes CD2830 et CD2831 semble être contrôlée de façon opposée par leurs riborégulateurs transcriptionnels respectifs, selon les concentrations de c-di-GMP intracellulaire. La protéine CD2830 a été décrite comme une métalloprotéase zinc-dépendante ayant une activité sur la fibronectine, le fibrinogène de plasma humain et la protéine CD2831, qui code pour une adhésine putative. La fonction de cette dernière protéine reste encore mal connue. Cette étude n’a pas permis de démontrer que les protéines CD2830 et CD2831 jouent un rôle dans l’agrégation ou dans l’adhésion à la fibronectine et au fibrinogène lorsque la concentration de c-di-GMP intracellulaire varie. Cette étude suggère que chez C. difficile, la zinc-métalloprotéase CD2830 est impliquée dans un mécanisme de clivage de protéines d’adhésion, comme décrit chez plusieurs pathogènes, afin de contrôler l’adhésion cellulaire lors de processus biologique important. Ce mécanisme serait régulé par le c-di-GMP.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation d'inhibiteurs de protéases lors de l'interaction entre la vigne et Botrytis cinerea. Il a été montré que lors de l'infection de la baie de raisin par B. cinerea, des protéases fongiques pourraient être à l'origine de la dégradation d'une des protéines PR majoritaires de la baie mûre, la chitinase VvChi4D (Thèse S. Colas, 2012 ; van Sluyter et al., 2013). L'hypothèse émise lors de notre étude est que des inhibiteurs de protéases de la vigne pourraient empêcher la dégradation de cette protéine de défense par les protéases de B. cinerea.L'expression de deux inhibiteurs de protéases, un Potato Inhibitor I (VvPin) et un Kunitz (VvKun), ainsi que celle de trois protéases fongiques, une protéase aspartique (BcAp8), une protéase glutamique (BcAcp) et une protéase à sérine (BcSer), ont été suivies lors de l'infection de la baie de Pinot noir et de la feuille de vitroplants. Les résultats obtenus montrent que l'expression des deux IP est induite en même temps que celle de la protéase à sérine mais après celle des deux protéases acides du champignon. La production en système hétérologue des deux IP ainsi que l'obtention de protéases acides et de protéases à sérine de B. cinerea a permis de montrer que la protéine VvKun est capable d'inhiber les protéases à sérine du champignon. En revanche, aucun des deux IP n'est capable d'inhiber les protéases acides du champignon, protéases responsables de la dégradation de la chitinase VvChi4D. / Characterization of protease inhibitors in the interaction between Vitis vinifera and Botrytis cinerea.It has been shown that upon infection of the grape berry by B. cinerea, fungal proteases may be responsible for the degradation of a PR protein of the mature berry VvChi4D chitinase (Thesis S. Colas, 2012; van Sluyter et al, 2013). The hypothesis of our study is that protease inhibitors could prevent the degradation of this defense protein by proteases of B. cinerea.The expression of two protease inhibitors, a Potato Inhibitor I (VvPin) and a Kunitz (VvKun), and that of three fungal proteases, an aspartic protease (BcAp8), a glutamic acid protease (BcAcp) and a serine protease (BcSer) were followed during infection of Pinot Noir berry and leaf plantlets. The results obtained show that the expression of IP is induced both in the same time as the serine protease, but after that the two fungal acid proteases. The heterologous production of both IPs and the production of acid and serine proteases from B. cinerea secretoms have shown that VvKun is capable to inhibit serine proteases of the fungus. However, neither IP is capable of inhibiting fungal acid proteases, responsible for the degradation of the chitinase VvChi4D.

Les protéases sont impliquées dans de nombreux processus biologiques et ont des origines très variées (cellules immunitaires, cellules épithéliales...). Leur activité est régulée par des inhibiteurs de protéases. Cette étude s'intéresse a` la balance entre les protéases épithéliales et leurs inhibiteurs dans le contexte de pathologies affectant l'intégrité´ de l'épithélium intestinal. Les conséquences d'un déséquilibre de la balance protéolytique ont été étudiées dans deux maladies chroniques aux composantes différentes, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin (MICI) (cycles de poussées inflammatoires) et le Syndrome du Côlon Irritable (SCI) (cycles de douleur). La muqueuse colique de patients atteints de SCI sécrète une activité de type trypsine dont l'origine et les fonctions sont mal définies. Cette étude s'intéresse à la source de cette activité trypsique dans le côlon des patients atteints de SCI, sa nature et son rôle dans l'activation neuronale. L'activité trypsique chez les patients atteints de SCI est augmentée majoritairement dans les cellules épithéliales (CEI). La stimulation de monocouches de cellules épithéliales avec du LPS ou de l'épinéphrine induit une augmentation de la quantité de trypsine-3 et de sa sécrétion au pôle basal de la cellule épithéliale stimulée, en corrélation avec une augmentation de l'activité trypsique. L'hyperactivité de la trypsine-3 au pôle basal entraine une perte de la fonction barrière de l'épithélium, anomalie retrouvée aussi chez les patients atteints de SCI. De plus, nous avons mis en évidence que la trypsine-3 est capable d'activer les neurones humains myentériques et les neurones sensitifs murins. In vivo, son administration intra-rectale à des souris induit une hypersensibilité viscérale dépendante du récepteur PAR2 (Protease Activated Receptor-2). Ainsi, les cellules épithéliales intestinales des patients atteints de SCI produisent et sécrètent de la trypsine-3 spécifiquement au pôle basal. Cette activité trypsique active des neurones sensitifs, participant à l'hypersensibilité viscérale, symptôme majeur dont souffrent les patients atteints de SCI. Les pathologies inflammatoires peuvent aussi être source d'un dérèglement protéolytique. Les patients atteints de MICI présentent une dérégulation de la balance élastolytique colique. Notre équipe a montré que l'apport d'ELAFINE (un inhibiteur d'élastase) par la bactérie génétiquement modifiée L.lactis au contact de la muqueuse inflammatoire protège les souris traitées en réduisant l'inflammation intestinale. Cependant les mécanismes protecteurs médiés par L'Elafine restent encore à déterminer. L'ELAFINE est un inhibiteur d'élastases mais possède aussi des propriétés antimicrobiennes. Afin de mettre en lumière quelles fonctions de L'Elafine portent les propriétés anti-inflammatoires des mutants de L'Elafine ont été générés et insérés dans la bactérie L.lactis: une mutation pour annuler sa fonction inhibiteur de protéase, un second mutant de son domaine antimicrobien et un dernier mutant ayant perdu ces 2 fonctions. Dans des monocouches de cellules intestinales épithéliales, l'apport d'ELAFINE protège de l'inflammation médiée par un déséquilibre de l'activité élastolytique : on observe une restauration de la fonction barrière de l'épithélium et une diminution des cytokines pro-inflammatoires (CXCL8 et IP10). La mutation du domaine antimicrobien n'affecte pas ces propriétés. Cependant, l'absence de la boucle inhibitrice annihile les propriétés anti-inflammatoires de L'Elafine. Ces travaux ont pu mettre en évidence l'importance de l'équilibre protéolytique au sein de la cellule épithéliale dans les pathologies intestinales. La balance entre les protéases et leurs inhibiteurs joue donc un rôle dans l'homéostasie épithéliale et les pathologies inflammatoires. / Proteases are involved in some biologic processes and their origins are variable (immune cells, epithelial cells...). Their activity is regulated by antiproteases. This study investigates the balance between proteases and their inhibitors in pathologies which modify epithelium integrity. Consequences of an unbalance in proteolytic activity was studied in two chronic pathologies with different components: Inflammatory Bowel Disease (IBD) (cycles of inflammatory boost) and Irritable Bowel Syndrome (IBS) (cycles of pain symptoms). Colonic mucosa from IBS patients releases trypsin activity. The origin and the functions of this activity are not well defined. This study investigated the source of this trypsin activity in the côlon of IBS patients, its nature and its role in neuronal activation. Trypsin activity from IBS patients is increased mostly in epithelial cells. Stimulation of epithelial cell monolayers with LPS or epinephrine induces an increase of trypsin-3 quantity and its secretion specifically in the basal side of epithelial cells. This is in correlation with the increase of trypsin activity. Trypsin-3 hyperactivity at the basal side provokes a loss of epithelium barrier function, which is also found in colons of IBS patients. Then, we have highlighted that trypsin-3 is able to activate human myenteric neurons and murine sensitive neurons. In vivo, its intra-rectal administration to mice induces a visceral hypersensitivity dependent of PAR2 (Protease Activated Receptors 2). Thus, intestinal epithelial cells from IBS patients produce and release trypsin-3 specifically on their basal side. This trypsin activity activates sensitive neurons which participate to visceral hypersensitivity, a major symptom of IBS patients. Inflammatory pathologies could be a source of proteolytic malfunction. IBD patients have a dysregulation of elastolytic balance in the colon. Our team has shown that ELAFIN (an elastase inhibitor) delivered by the bacteria genetically modified L.lactis near the inflamed mucosa, protects mice from intestinal inflammation. However, the protective mechanisms induced by ELAFIN need to be investigate. ELAFIN is an elastase inhibitor but have also antimicrobial properties. With the aim to highlight what function of ELAFIN owns anti-inflammatory properties, mutants of ELAFIN have been generated and were insered into L.lactis: a first mutant lacked its antiprotease function, a second lacked antimicrobial properties and a last mutant lacked both properties. In intestinal epithelial monolayers, ELAFIN delivered by L.lactis protects against inflammation: a restauration of epithelial barrier function and a decrease of pro-inflammatory cytokines (CXCL8 and IP10) are observed. Mutation of antimicrobial domain doesn't affected these properties. Nevertheless, the absence of inhibitory loop annihilates anti-inflammatory functions of ELAFIN. This work highlights the importance of proteolytic balance inside the epithelial cell in intestinal pathologies. The balance between proteases and antiproteases plays an important role in epithelial homeostasis.

La prévalence de l’allergie à l’arachide semble s’élever entre 0.6 et 1.9% de la population générale. Elle se caractérise par des doses déclenchantes particulièrement faibles. Des doses de l’ordre du milligramme sont suffisantes pour déclencher une réaction objectivable. Les valeurs de ED05 et de ED50 sont respectivement estimables à 7.3 mg, et de 100mg jusqu’à 1000 mg. Les réactions cliniques peuvent s’avérer très sévères et mener à des chocs anaphylactiques létaux. Or, l’examen du contenu et des différents allergènes qui ont été décrits ne permettent pas de pointer des caractéristiques qui pourraient expliquer ces éléments. Dix-sept allergènes ont été décrits dans l’arachide (Ara h 1 à 17). Ils appartiennent à des familles largement présentes parmi les protéines alimentaires végétales (Viciline, conglutine, …). Si l’on examine les raisons usuellement invoquées pour expliquer l’allergénicité des protéines (nombres d’épitopes, résistance à la protéolyse et aux traitements physico-chimiques, glycosylation, …) on constate que les allergènes de l’arachide, dans leur ensemble, possèdent ces propriétés sauf l’activité enzymatique qui n’avait pas été décrite jusqu’alors. Dès lors les deux premiers objectifs de ce travail ont consisté d’une part à mettre en évidence la présence d’activité protéolytique dans les graines, et d’autre part de tenter de purifier la protéase par des techniques de chromatographie, de la caractériser par des tests d’inhibition et de l’identifier. Le troisième objectif fut de déterminer si l’activité protéolytique pouvait avoir un rôle dans la sévérité de la réaction allergique. A cette fin nous avons mesuré les productions d’anaphylatoxine C3a et C5a et évalué le rôle de l’activité protéolytique dans l’activation du système du complément par la mesure de la production du complexe d’attaque membranaire SC5b-9. Le quatrième objectif consistait déterminer si l’activité protéolytique avait une influence sur la perméabilité tissulaire via la mesure de la lyse des jonctions serrées à l’aide d’un modèle de culture cellulaires MDCK.Partie Expérimentale-RésultatsLes extractions de protéines et les différentes chromatographies effectuées nous ont fourni une séquence de purification (IEX, Benzamidine et Thiopropyl) qui nous a permis d’isoler, de façon répétable, une protéine active d’un poids de 30-35 kDa dont l’activité est de type thiol-sérine protéase. En effet, l’activité protéolytique n’est pas inhibée par des inhibiteurs d’aspartique protéase (pepstatine) ni de métallo-protéase (EGTA, EDTA, O-phénanthroline), mais elle est totalement inhibée par les inhibiteurs de sérine protéase (PEFABLOC, TLCK, Benzamidine), partiellement par les inhibiteurs de cystéine protéases (MMTS, iodoacétamide, E64) et qu’elle interagit avec le thiopropyl et le PEG. Son séquençage n’a pas permis de l’identifier de façon certaine mais révèle qu’elle présente des homologies avec la conglutine-7 (Ara h 2), et des analogies avec la conglutine-γ du lupin, décrite comme sérine protéase. Concernant la réaction allergique, l’activité protéolytique de l’arachide induit clairement une production d’anaphylatoxines C3a et C5a dans les sérums et plasmas in vitro. De plus, les dosages du SC5b-9 ont démontré la production du complexe d’attaque membranaire. Cette activation du complément se fait de manière totalement indépendante des voies classique, alterne, ou des lectines. En effet, nous n’avons pas décelé de production de C3 convertase (tests d’hémolyse nuls et dosage de Bb) alterne et nous avons extrait et vérifier l’inactivité protéolytique des lectines de l’arahide. Enfin, les tests réalisés sur cultures cellulaires ont montré que l’activité protéolytique de l’arachide induit la lyse de l’occludine au sein des jonctions serrées, induisant de ce fait une augmentation de la perméabilité pouvant favoriser la pénétration des allergènes. Conclusions et PerspectivesNotre travail met en évidence la présence d’une activité protéolytique de type thiol-sérine protéase qui est d’une part responsable de la production d’anaphylatoxine C3a et C5a de façon totalement indépendante des voies d’activation du complément, et qui mène à la formation du MAC et d’autre part, d’affecter la perméabilité cellulaire en lysant l’occludine au sein des jonctions serrées. Nous émettons également l’hypothèse de l’influence de l’activité protéolytique de l’arachide en tant que « facilitateur » de la réaction allergique au vu des quantités d’anaphylatoxine produites et de son influence sur la perméabilité tissulaire, ainsi que de la sensibilisation à l’allergie via la potentialité d’une action sur les CD23, les PARs, et du C3a et C5a produits sur leurs récepteurs en surface des APCs.PublicationIsolation of a thiol-dependent serine protease in peanut and investigation of its role in the complement and the allergic reaction. Cédric Javaux, Patrick Stordeur, Mohamed Azarkan, Françoise Mascart, Danielle Baeyens-Volant. Molecular Immunology 75 (2016) 133–143. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez la drosophile, l’activation du récepteur Toll menant à une réponse antimicrobienne peut se faire par deux voies différentes. Ces deux voies sont activées soit par des récepteurs dédiés, les Pattern Recognition Receptors (PRRs) reconnaissant des motifs moléculaires microbiens, soit par la coupure d’une molécule circulante appelée Perséphone par des protéases microbiennes extrêmement diverses sécrétées pendant une infection. Cependant, le mécanisme par lequel Perséphone est activée demeurait ambigu. Nous avons identifié une région unique dans Perséphone fonctionnant comme un appât pour les protéases exogènes indépendamment de leur origine, type ou spécificité. Une coupure dans cette région constitue la première étape d’une activation séquentielle de Perséphone ; elle permet de recruter la cathepsine circulante 26-29-p, qui va générer la forme active de Perséphone.Ces travaux montrent comment un récepteur de l’immunité innée, Perséphone, peut être activé par un signal de danger, en l’occurrence des enzymes microbiennes, et non par la détection de motifs moléculaires qui peuvent être présents dans la flore microbienne hébergée par les animaux. / In Drosophila, the antimicrobial response against infections can be triggered by two different extracellular mechanisms that both lead to the activation of the Toll receptor. These two mechanisms are activated either by the recognition of specific microbial determinants by Pattern Recognition Receptors (PRRs), or by the cleavage of the circulating serine protease Persephone by a wide range of microbial proteases secreted during infections. However, the molecular mechanism underlying Persephone activation remained ambiguous. We identified a unique region in Persephone pro-domain that functions as a bait for exogenous proteases independently of their origin, type or specificity. Cleavage of Persephone in this bait region constitutes the first step of a sequential activation and licenses the subsequent maturation of Persephone to the endogenous circulating cysteine cathepsin 26-29-p. Our data establish Persephone itself as an immune receptor able to sense a broad spectrum of microbes through the recognition of danger signals rather than molecular patterns.

Les tendons sont des tissus qui réagissent aux stimuli mécaniques externes. Des stimulations mécaniques inadéquates imposées au tendon engendrent des lésions dans le tendon. Plusieurs études ont été réalisées pour comprendre la mécanobiologie des tendons. Celles-ci ne sont malheureusement pas complètes. Le but de ce projet de maîtrise était donc d'approfondir nos connaissances des mécanismes régissant l'évolution du tendon suite à certaines stimulations mécaniques. Précisément, l'objectif de cette maîtrise était de découpler les trois modes d'évolution (l'amélioration, la dégradation mécanique et la dégradation enzymatique de la matrice extracellulaire) pour deux types de chargement: une sous-stimulation et une sur-stimulation mécanique. Pour chacune de ces deux conditions de stimulation, nous avons étudié la variation de l'état du tendon pour trois types de condition de culture du tendon: (1) D-PBS avec inhibiteurs de protéases, (2) milieu de culture avec inhibiteurs de protéases et (3) milieu de culture sans inhibiteurs de protéases. Cela a permis de mettre en lumière les trois modes de d'évolution individuellement. En effet, l'évolution de l'état du tendon peut être approximée par l'équation suivante: évolution = DM - DE + A où DM = dégradation mécanique, DE = dégradation enzymatique et A = amélioration. Avant de pouvoir effectuer ces expériences, nous avons élaboré des protocoles de caractérisation et de stimulation mécanique minutieux. Ces protocoles devaient assurer un contrôle des conditions de culture (ex.: contamination, condition de culture stable,...), des stimulations et des caractérisations mécaniques (ex.: changement du milieu de culture, test de relaxation, test dynamique,...). De cette façon, nous nous assurions que les paramètres de notre expérience n'influençaient pas nos résultats. L'étude, a principalement montré que la contribution relative des trois mécanismes d'évolution diffère selon le type de stimulation imposée.

L'apoptose est le processus principal d'autodestruction d'une cellule en réponse à divers stimuli. Cette forme de mort cellulaire, conservée à travers l'évolution est nécessaire au développement embryonnaire, à l'éducation du système immunitaire et à l'homéostasie des organismes pluricellulaires. Ce processus est débalancé dans plusieurs pathologies prolifératives et dégénératives. Durant l'apoptose, un groupe de protéases à cystéine nommées caspases jouent [joue] un rôle essentiel dans l'exécution du signal de mort cellulaire. Ces enzymes clivent une multitude de substrats dans des cascades d'activation menant au démantèlement de la cellule. Un de ces substrats est le récepteur de l'inositol 1,4,5-trisphosphate de type 1 (IP[indice inférieur 3]R-1). Il s'agit d'un canal calcique intracellulaire situé sur la membrane du réticulum endoplasmique jouant un rôle primordial dans la régulation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire. Le clivage de l'IP[indice inférieur 3]R-1 perturberait ainsi l'homéostasie calcique, essentielle à la survie de la cellule. Afin d'étudier l'importance du clivage de l'IP[indice inférieur 3]R-1 par la caspase-3 dans le processus de l'apoptose, des mutants du récepteur ont été générés et leurs propriétés ont été comparées à celles du récepteur de type sauvage. Le site de reconnaissance par les caspases (DEVD[flèche vers le bas]R) a été aboli dans les mutants IEVA[flèche vers le bas]R et DEVA[flèche vers le bas]R, alors qu'une courte séquence (ENLYFQ[flèche vers le bas]S) reconnue par la protéase TEV du virus de la mosaïque du tabac a été introduite dans un troisième mutant qui ne peut être clivé par les caspases (DEVA[flèche vers le bas]R). Avec ces mutants, nous avons obtenu des résultats qui confirment que l'IP[indice inférieur 3]R-1 est clivable par la caspase-3 (et aussi par la caspase-7), mais sous des conditions extrêmes (en présence de plus de dix fois le niveau physiologique des caspases). Par contre, le clivage de l'IP[indice inférieur 3]R-1 ne se produit pas in cellulo, dans des conditions apoptotiques normales où la caspase 3 est activée. Ces résultats suggèrent que l'IP[indice inférieur 3]R-1 n'est pas un bon substrat de la caspase 3, parce que son clivage n'est pas efficace, et surtout parce qu'il n'a pas lieu à chaque fois que la mort cellulaire par apoptose est induite. Ces résultats montrent que l'IP[indice inférieur 3]R-1 ne possède pas le profil d'un substrat de caspase dont le clivage est fondamental pour le bon déroulement de l'apoptose.

Les transporteurs de peptide sont impliqués chez les bactéries dans différentes fonctions comme la nutrition, la communication intercellulaire et la virulence. Peu de données concernant ces systèmes étaient disponibles chez S. aureus, bactérie pathogène majeure. L'analyse systématique de chacun de ses transporteurs constituait mon projet de thèse. L'analyse des 12 génomes de S. aureus séquencés a mis en évidence la présence de 4 opérons opp putatifs (opp1, opp2, opp3 et opp4), d'un gène opp5A isolé, codant une protéine de fixation des peptides potentielle et d'une protéine de transport des di- et tripeptides, DtpT. A l'exception d'opp4, ces transporteurs sont conservés chez toutes les souches de S. aureus. Les systèmes Opp sont, entre eux, assez différents en terme d'homologie de séquence et d'organisation génétique. Afin de déterminer le rôle de chacun de ces transporteurs, des mutants de délétion, simples ou multiples, ont été construits et l'analyse de leurs phénotypes sur plusieurs cribles a été abordée. Seul Opp3 et DtpT apparaissent comme impliqués dans la nutrition azotée. Ils importent respectivement des peptides de 3 à 8 acides aminés et des di- et tripeptides. Leur présence est nécessaire au développement optimal de la bactérie dans le lait. Dans ce milieu, Opp3 joue également un rôle dans la régulation des protéases extracellulaires Ssp et Aur, par un mécanisme qui n'est pas encore élucidé. Chez certaines bactéries, les Opp participent à la communication cellulaire par l'import de phéromones. Pour tester l'existence d'un tel phénomène chez S. aureus, nous avons analysé par spectrométrie de masse, le contenu peptidique d'un surnageant après culture de la bactérie en milieu chimiquement défini. Nos résultats ont été confrontés à une banque de données adaptée à la détection des petits gènes. Cinq peptides sécrétés par la bactérie ont été ainsi, pour la première fois, mis en évidence expérimentalement chez S. aureus. Leur fonction biologique reste à déterminer. Enfin, dans la mesure où sur la base de leur séquence, il est impossible de distinguer les protéines de fixation des peptides de celles qui fixent le nickel, un rôle éventuel des systèmes Opp de S. aureus dans le transport de ce métal a été testé. Nous avons montré qu'Opp2 et Opp5A assuraient cette fonction. Nos résultats mettent en avant le rôle d'Opp3 et DtpT dans la nutrition. L'association d'Opp2 et Opp5A formant un transporteur de nickel, seuls les rôles d'Opp1 et Opp4 restent à élucider.