Caractérisation d'inhibiteurs de protéases lors de l'interaction entre la vigne et Botrytis cinerea. Il a été montré que lors de l'infection de la baie de raisin par B. cinerea, des protéases fongiques pourraient être à l'origine de la dégradation d'une des protéines PR majoritaires de la baie mûre, la chitinase VvChi4D (Thèse S. Colas, 2012 ; van Sluyter et al., 2013). L'hypothèse émise lors de notre étude est que des inhibiteurs de protéases de la vigne pourraient empêcher la dégradation de cette protéine de défense par les protéases de B. cinerea.L'expression de deux inhibiteurs de protéases, un Potato Inhibitor I (VvPin) et un Kunitz (VvKun), ainsi que celle de trois protéases fongiques, une protéase aspartique (BcAp8), une protéase glutamique (BcAcp) et une protéase à sérine (BcSer), ont été suivies lors de l'infection de la baie de Pinot noir et de la feuille de vitroplants. Les résultats obtenus montrent que l'expression des deux IP est induite en même temps que celle de la protéase à sérine mais après celle des deux protéases acides du champignon. La production en système hétérologue des deux IP ainsi que l'obtention de protéases acides et de protéases à sérine de B. cinerea a permis de montrer que la protéine VvKun est capable d'inhiber les protéases à sérine du champignon. En revanche, aucun des deux IP n'est capable d'inhiber les protéases acides du champignon, protéases responsables de la dégradation de la chitinase VvChi4D. / Characterization of protease inhibitors in the interaction between Vitis vinifera and Botrytis cinerea.It has been shown that upon infection of the grape berry by B. cinerea, fungal proteases may be responsible for the degradation of a PR protein of the mature berry VvChi4D chitinase (Thesis S. Colas, 2012; van Sluyter et al, 2013). The hypothesis of our study is that protease inhibitors could prevent the degradation of this defense protein by proteases of B. cinerea.The expression of two protease inhibitors, a Potato Inhibitor I (VvPin) and a Kunitz (VvKun), and that of three fungal proteases, an aspartic protease (BcAp8), a glutamic acid protease (BcAcp) and a serine protease (BcSer) were followed during infection of Pinot Noir berry and leaf plantlets. The results obtained show that the expression of IP is induced both in the same time as the serine protease, but after that the two fungal acid proteases. The heterologous production of both IPs and the production of acid and serine proteases from B. cinerea secretoms have shown that VvKun is capable to inhibit serine proteases of the fungus. However, neither IP is capable of inhibiting fungal acid proteases, responsible for the degradation of the chitinase VvChi4D.

Les tendons sont des tissus qui réagissent aux stimuli mécaniques externes. Des stimulations mécaniques inadéquates imposées au tendon engendrent des lésions dans le tendon. Plusieurs études ont été réalisées pour comprendre la mécanobiologie des tendons. Celles-ci ne sont malheureusement pas complètes. Le but de ce projet de maîtrise était donc d'approfondir nos connaissances des mécanismes régissant l'évolution du tendon suite à certaines stimulations mécaniques. Précisément, l'objectif de cette maîtrise était de découpler les trois modes d'évolution (l'amélioration, la dégradation mécanique et la dégradation enzymatique de la matrice extracellulaire) pour deux types de chargement: une sous-stimulation et une sur-stimulation mécanique. Pour chacune de ces deux conditions de stimulation, nous avons étudié la variation de l'état du tendon pour trois types de condition de culture du tendon: (1) D-PBS avec inhibiteurs de protéases, (2) milieu de culture avec inhibiteurs de protéases et (3) milieu de culture sans inhibiteurs de protéases. Cela a permis de mettre en lumière les trois modes de d'évolution individuellement. En effet, l'évolution de l'état du tendon peut être approximée par l'équation suivante: évolution = DM - DE + A où DM = dégradation mécanique, DE = dégradation enzymatique et A = amélioration. Avant de pouvoir effectuer ces expériences, nous avons élaboré des protocoles de caractérisation et de stimulation mécanique minutieux. Ces protocoles devaient assurer un contrôle des conditions de culture (ex.: contamination, condition de culture stable,...), des stimulations et des caractérisations mécaniques (ex.: changement du milieu de culture, test de relaxation, test dynamique,...). De cette façon, nous nous assurions que les paramètres de notre expérience n'influençaient pas nos résultats. L'étude, a principalement montré que la contribution relative des trois mécanismes d'évolution diffère selon le type de stimulation imposée.

Lors de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), la différenciation fibroblastique s’accompagne d’une accumulation excessive des composants de la matrice extracellulaire ainsi qu’à un dérèglement de la balance protéases / antiprotéases. Nous avons étudié le rôle des cathepsines à cystéine dans la myofibrogenèse et leur contribution potentielle à la physiopathologie de la fibrose pulmonaire chez l’Homme. Pour cela, le profil d’expression des cathepsines ainsi que de leurs inhibiteurs naturels a été évalué dans un modèle cellulaire expérimental, puis dans des myofibroblastes primaires et enfin dans des liquides de lavage broncho-Alvéolaires (LBA) de patients atteints de FPI. Nos résultats montrent que lors de la FPI la cystatine C (inhibiteur naturel des protéases à cystéine) régule les activités protéolytiques des cathepsines extracellulaires et pourrait ainsi contribuer à l’accumulation de collagènes. Elle serait un biomarqueur potentiel de la FPI. D’autre part la cathepsine B participe à la différentiation fibroblastique et son inhibition retarde la myofibrogenèse. / During idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), fibroblast differentiation is accompanied by an excessive accumulation of extracellular matrix components as well as an imbalance between proteases and theirs inhibitors. We evaluated the role of human cysteine cathepsins in myofibrogenesis and their potential contribution to the pathogenesis of IPF. Expression of cathepsins and their natural inhibitors have been studied in an experimental cell model, but also in primary myofibroblasts and in bronchoalveolar lavage fluids (BALF) of patients suffering from IPF. Our results show that cystatin C (a natural inhibitor of cysteine proteases) regulates the extracellular proteolytic activities of cathepsins and could contribute to the accumulation of collagens. Cystatin C could also be a potential biomarker of IPF. On the other hand, cathepsin B participates in fibroblast differentiation and its inhibition delays myofibrogenesis.

La voie de signalisation Notch est conservée au cours de l'évolution. Elle joue un rôle clé dans le développement, et elle est impliquée dans de nombreuses décisions de destin cellulaire, dans le maintien des cellules souches, et dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Une dérégulation de la signalisation Notch est impliquée dans diverses maladies et cancers, y compris les tumeurs solides, comme les cancers du sein et du col de l'utérus, et les leucémies, comme la Leucémie Aiguë Lymphoblastique des cellules T (LAL-T). Notch est un récepteur transmembranaire activé par des ligands transmembranaires de la famille DSL (Delta/Serrate/Lag-2). Bien que plusieurs mutations oncogéniques ont été identifiées au niveau du récepteur Notch, de nombreux cancers modulés par Notch demeurent ligand-dépendants. Étonnamment, les mécanismes moléculaires régulant l'activation du ligand sont encore relativement peu caractérisés par rapport à ceux qui régissent le récepteur Notch lui-même. Utilisant un essai de co-culture avec un rapporteur luciférase de Notch, nous avons effectué le premier crible d'ARNi pan-génomique visant spécifiquement à identifier des régulateurs des ligands de Notch dans la cellule émettrice du signal. Nous avons ainsi pu découvrir de nouvelles classes de régulateurs communs pour les ligands Delta-like1 et 4. Ces régulateurs comprennent des inhibiteurs de protéases, des facteurs de transcription, et des gènes divers à fonction inconnue, tels que Tmem128 « Transmembrane protein 128 », ou à fonction préalablement caractérisée tels que la co-chaperonne moléculaire Cdc37 « Cell division cycle 37 homolog ». Par la suite, nous avons développé des cribles secondaires fonctionnels où nous avons démontré l'importance de ces régulateurs pour des événements Notch-dépendants, comme la différenciation des cellules T normales, et la survie des cellules souches pré-leucémiques isolées à partir d'un modèle murin de LAL-T. En outre, nous avons prouvé que les régulateurs les plus forts du crible de survie sont également nécessaires pour l'activité d'auto-renouvellement des cellules souches pré-leucémiques. Finalement, nous avons entamé une caractérisation moléculaire préliminaire de deux régulateurs nouvellement identifiés; Tmem128 et Cdc37 afin d'étudier leur mécanisme d'action sur les ligands. En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier de nouveaux régulateurs de la voie Notch qui pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles dans les cancers; tel qu'illustré par le modèle LAL-T. La compréhension des détails moléculaires sous-jacents aux fonctions de ces régulateurs sera essentielle afin de développer des inhibiteurs pharmacologiques pour bloquer leur action et entraver la signalisation Notch dans le cancer. / The Notch signalling pathway is evolutionarily conserved. It plays a key role in development and it is involved in multiple cell fate decisions, in the maintenance of stem cells, and in the regulation of cell proliferation and differentiation. Misregulation of Notch signalling is implicated in various diseases and cancers including solid tumours, such as breast and cervical cancers, and leukemias, such as T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL). Notch is a transmembrane receptor activated by transmembrane ligands of the DSL family (Delta/Serrate/Lag-2). Whereas oncogenic mutations have been identified in the Notch receptor, many Notch-mediated cancers remain ligand-dependent. Strikingly, the molecular mechanisms that regulate ligand activation are still poorly characterized as compared to those regulating the Notch receptor itself. Using a co-culture assay with a luciferase Notch reporter, we performed the first genome-wide RNAi screen aiming specifically at identifying regulators of Notch ligands in the signal-sending cell. We thereby unraveled new classes of common regulators for both Delta-like1 and 4 ligands. These regulators include protease inhibitors, transcription factors and various genes of unknown function such as Tmem128 (Transmembrane protein 128), or of previously characterized function such as the molecular co-chaperone Cdc37 (Cell division cycle 37 homolog). We next developed functional secondary screens where we demonstrated that our hits are important for Notch-mediated events, such as normal T-cell differentiation, and survival of pre-leukemic stem cells (pre-LSCs) isolated from a mouse model of T-ALL. Moreover, we showed that top hits from the pre-LSC survival screen are also required for the self-renewal activity of pre-LSCs. Finally, we performed a preliminary molecular characterization of two newly identified regulators; Tmem128 and Cdc37 in order to investigate their mechanism of action on Delta-like ligands. Altogether, this study led to the identification of novel Notch pathway regulators that could serve as potential therapeutic targets in Notch cancers, as exemplified by the T-ALL model. Elucidating the finer details that underlie the molecular functions of these regulators will be critical to develop pharmacological inhibitors to counteract their action and impede Notch signalling in cancer.

Le tissu adipeux (TA) est réparti dans tout le corps en différents dépôts. Il existe deux types distincts aux fonctions biens spécifiques : le tissu adipeux blanc sert de réservoir énergétique et stocke les lipides et le tissu adipeux brun permet la thermogénèse. Par ses fonctionnalités et son pouvoir endocrine, le TA assure le maintien de l’homéostasie énergétique. De graves désordres métaboliques résultent d’une surabondance retrouvée au cours de l’obésité ou lors d’un remodelage dans les lipodystrophies. Certaines ont une origine génétique, d’autres sont induites par des médicaments comme les inhibiteurs de la protéase (IP) du VIH administrés dans la thérapie antirétrovirale. Le pool de progéniteur adipeux (PA) présent dans chaque dépôt est essentiel au maintien de ce tissu car il permet de renouveler le stock d’adipocytes. Nous avons caractérisé et identifié de nouveaux gènes impliqués dans la boucle autocrine/paracrine de l’activineA qui est responsable de l’auto-renouvellement du pool de PA dont IER3. Son expression augmente chez les patients obèses et diminue sous traitement par les IP. La modélisation des différents dépôts montre que les IP inhibent préférentiellement l’auto-renouvellement ou la différenciation adipocytaire des PA en fonction de leur localisation. Les lipodystrophies induites par la thérapie antirétrovirale auraient des causes multifactorielles. Enfin, nos résultats révèlent que les IP diminuent drastiquement et sélectivement la production d’adipocytes bruns. Ces effets doivent être considérés dans un contexte de développement inopportun du tissu adipeux brun afin de corriger des désordres métaboliques associés à certaines pathologies. / The adipose tissue (AT) is distributed throughout the body in different depots. There are two distinct types with specific functions: the white adipose tissue is used as an energetic reservoir and stores the lipids whereas the brown adipose tissue allows the thermogenesis. By its functionalities and its endocrinal capacity, the AT ensures the energetic homeostasis maintenance. Severe metabolic disorders result from an excess found during obesity or a remodelling in the lipodystrophies. Some of them have a genetic origin, the others are induced by drugs such as the HIV-protease inhibitors (PI) administered in the antiretroviral therapy against HIV. The adipose progenitor (AP) pool present in each depot is necessary for the maintenance of this tissue because it allows to renew the adipocyte stock. We characterized and identified new genes involved in the autocrine/paracrine Activin A loop which is responsible for AP pool self-renewal of whom is IER3. Its expression increases in obese patients and decreases under PI treatment. The modelling of the different depots shows that PI inhibit preferentially PA self-renewal or adipose differentiation depending on their localisation. Thus, lipodystrophies induced by antiretroviral therapy would have multifactorial causes. Finally, our results reveal PI dramatically and selectively reduce the brown adipocyte production. These effects should be considered in the context of inappropriate brown adipose tissue development in order to correct metabolic disorders associated to some pathologies.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.