Reproduction de : Thèse de doctorat : Physiopathologie : Paris 12 : 2006. / Thèse en texte intégral accessible depuis l'Intranet de Paris 12. Titre provenant de l'écran-titre.

La production de microparticules pendant le processus de cicatrisation par les myofibroblastes provenant de plaies est une nouvelle voie de recherche dans le domaine de la communication intercellulaire. À notre connaissance, l’étude de microparticules produites par les cellules de tissus est une première. Les microparticules sont perçues comme étant des cargos transporteurs de signaux. Afin de déterminer le type d’information que les microparticules produites par les myofibroblastes cicatriciels transportent, leur contenu protéique a été caractérisé. Trois techniques d’extraction des protéines couplées à l’analyse par spectrométrie de masse ont été utilisées : le 2D-DIGE, la méthode du Disc SDS-PAGE améliorée ainsi qu’un lysat total précipité à l’acétone. La liste de protéines obtenue a permis d’identifier l’implication potentielle des microparticules dans plusieurs voies signalétiques. La caractérisation du protéome des microparticules produites par les myofibroblastes cicatriciels permettra une meilleure compréhension de la communication intercellulaire qui se produit pendant le processus de cicatrisation. / Production of microparticles by myofibroblasts during wound healing process is a new finding in the field of cellular communication. To our knowledge, study of microparticles secreted by cell tissue is a premiere. Microparticles are thought to be carriers for signaling. To determine information carried by wound healing myofibroblast microparticles, their protein content has been characterized. Three means of protein extraction followed by mass spectrometry have been used : 2D-DIGE, improved Disc SDS-PAGE and acetone precipitation. The obtained list of proteins allows the identification of potential implication of microparticles in several pathways. Wound healing myofibroblast microparticles proteome characterization will help to better understand intercellular communication during wound healing.

La cicatrisation cutanée est un système complexe qui regroupe différents processus biologiques comme l'hémostase, l'inflammation, Pangiogenèse et la synthèse matricielle. Les myofibroblastes sont au coeur de ce système et bien que plusieurs fonctions aient été associées aux myofibroblastes, on en sait peu sur la relation qu'ils entretiennent avec les autres cellules impliquées dans la formation du tissu de granulation. Nous avons exploré la possibilité que les myofibroblastes influencent le développement angiogénique au cours de la cicatrisation cutanée. Les fibroblastes sont connus pour avoir des propriétés proangiogéniques, mais nous avons observé à l'aide d'un modèle tridimensionnel in vitro à base de fibrine que la différenciation vers un phénotype myofibroblastique permet aux cellules d'accroître leur potentiel proangiogénique. Ce potentiel proangiogénique acquis n'est pas dû à une augmentation de la sécrétion de facteurs de croissance associés à Pangiogenèse comme le VEGF ou le bFGF, mais serait plutôt associé à une augmentation de la sécrétion d'inhibiteurs des métalloprotéinases dont TIMP-1 au cours des premières étapes du développement angiogénique, et plus tardivement par la sécrétion de TIMP-3. TIMP-1 est connu pour son effet proangiogénique alors que TIMP-3, identifié comme un inhibiteur de Pangiogenèse, permet la stabilisation du réseau vasculaire évitant ainsi sa régression. Nous avons également observé que les myofibroblastes produisaient dans le surnageant de culture des microparticules capables d'induire la prolifération des cellules endothéliales et des fibroblastes. Ces microparticules, qui contiennent du VEGF et du bFGF, ne résultent pas d'un processus apoptotique, mais d'une activation suite à l'induction par un ou des médiateur(s) contenu(s) dans les fluides corporels, représentés par le sérum et le plasma sanguin. Ces microparticules sont connues comme étant des médiateurs permettant le transfert direct entre cellules d'un ensemble de molécules bioactives. Leur présence démontre qu'il existe un réseau de communication intercellulaire spécialisé au sein du processus de cicatrisation. En conclusion, nous avons montré que les myofibroblastes, déjà associés à la synthèse de la matrice extracellulaire, sont également favorables au développement angiogénique et à la prolifération cellulaire. Chacune de ces fonctions contribue à la formation du tissu de granulation et par conséquent, elles sont importantes dans le processus de cicatrisation cutanée.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Lors de la revascularisation d'un tissu lésé, les (myo)fibroblastes et les cellules endothéliales sont recrutés concomitamment au site de la lésion. Ce projet étudie les interactions existant entre ces deux types cellulaires lors de la cicatrisation normale et hypertrophique à partir de deux modèles : derme reconstruit par auto-assemblage et gel de fibrine. La détection par immunofluorescence (collagène IV) a démontré un développement plus important du réseau pseudo-angiogénique lorsque les cellules endothéliales microvasculaires étaient en présence de myofibroblastes du tissu de granulation dans le modèle de gel de fibrine, comparé à la présence des myofibroblastes pathologiques ou des fibroblastes. Aussi, le dépôt de protéines matricielles variait en fonction du type et de l'origine des cellules mésenchymateuses ainsi que de la présence des cellules endothéliales. Ceci suggère que les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules fibroblastiques sont importantes dans le processus d'angiogenèse lors de la cicatrisation normale et pathologique.

Le processus de cicatrisation est complexe et hautement régulé par de nombreux facteurs. La différenciation des fibroblastes (Fb) du derme en myofibroblastes (Wmyo) est très importante pour la guérison des plaies. Les Wmyo accélérent la fermeture des plaies par leur contraction, et jouent un rôle central dans la reconstitution de la MEC. Notre équipe a déjà montré que les Wmyo stimulent l’angiogénèse de façon plus importante que les Fb. De plus, les Wmyo produisent des microvésicules (MV) : des vésicules produites par bourgeonnement de la membrane plasmique des cellules qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire. En analysant le protéome de ces MV, l’équipe a démontré que les MV contiennent des protéines impliquées dans l’angiogénèse. Mon hypothèse est que les MV produites par les Wmyo pouvaient influencer l’angiogenèse. Mes objectifs étaient d’évaluer le rôle des MV produites par les Wmyo sur l’angiogenèse en évaluant la réponse des cellules endothéliales (CE) selon les trois mécanismes fondamentaux de la formation des capillaires sanguins : la prolifération et la migration des CE, ainsi que la formation de structures tubulaires. Pour finir, les mécanismes d’interaction et d’action des MV sur les CE cibles ont été étudiés. Mes résultats ont prouvé que la présence de MV isolées à partir de Wmyo induit une augmentation significative et dose-dépendante de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales microvasculaires de peau (CEMV) tout en favorisant la formation de structures tubulaires sur Matrigel®. Finalement, l’internalisation des MV dans les CEMV par la voie de l’endocytose est probable, et l’action des MV sur la migration des CE semble être dépendante d’une traduction protéique. En conclusion, nous avons démontré que les MV produites par les Wmyo sont favorables au développement angiogénique, élargissant le rôle des Wmyo pendant la guérison de plaie. Nous avons également prouvé que les mécanismes d’action des MV sont liés à l’endocytose des MV et de la traduction protéique. / The healing process is complex and highly regulated by many factors. The differentiation of dermal fibroblasts (Fb) into myofibroblasts (Wmyo) is very important for wound healing. The Wmyo accelerates wound closure by their contraction. Also, these cells play a central role in the reconstruction of the extracellular matrix. Our team has already shown that Wmyo strongly stimulate angiogenesis, more than Fb and that Wmyo produce microvesicles (MVs). In literature, MVs produced by budding of the plasma membrane of the cells play a role in intercellular communication. By analyzing the proteome of these MVs, I have demonstrated that MVs contain proteins capable of stimulating angiogenesis. Our hypothesis was that MVs produced by Wmyo could influence angiogenesis. Our objectives were to evaluate the role of MV produced by Wmyo on angiogenesis by evaluating the response of endothelial cells (EC) according to the three fundamental mechanisms of blood capillary formation: proliferation and migration of endothelial cells, as well as the formation of tubular structures. Finally, we have studied their mechanism of interaction and action on the target EC. Our results showed that the presence of MVs isolated from Wmyo induces a significant and dose-dependent increase of the proliferation and migration of microvascular endothelial cells of the skin (MVEC) while promoting the formation of tubular structures on Matrigel ®. Also, the internalization of MVs is through endocytosis, and MVs action on EC migration seems to be dependent on protein translation. In conclusion, we have shown that MVs produced by Wmyo are favorable to an angiogenic development, widening the role of Wmyo during wound healing. We have also shown that the interaction of MVs with EC seems to include the pathway of endocytosis and their role seems to pass via protein translation.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique du tube digestif. Lorsqu'elle affecte l'intestin grêle, elle se caractérise entre autres par l'apparition de foyers d'inflammation où l'on observe un important remodelage de la muqueuse. En effet, on observe une atrophie de la villosité et une hyperplasie des cryptes accompagnées par une importante sécrétion de cytokines pro-inflammatoires dont le TNF[alpha], l'IFN[gamma], l'IL-1[bêta], l'IL-6 de même que le TGF[bêta]. Récemment, notre groupe de recherche a démontré une altération de la distribution des laminines de la membrane basilaire des cryptes des régions inflammées [i.e. enflammées]. Cette observation a soulevé une première hypothèse voulant que cette altération soit le résultat de l'action des cytokines pro-inflammatoires sur la sécrétion des laminines par les cellules épithéliales. Les études menées in vitro à l'aide d'un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines représentant les cellules prolifératives de la cryptes (HIEC) nous ont permis de démontrer que le TNF[alpha] et le TGF[bêta] sont les seules cytokines pouvant augmenter la sécrétion des laminines-5 et -10 par les cellules HIEC. Cependant, lorsque le TNF[alpha] est combiné à l'IFN[gamma], celles-ci agissent en synergie et conduisent à une sécrétion massive des laminines-5 et -10 selon un mécanisme indépendant de la voie du TGF[bêta]. Par ailleurs, la combinaison TNF[alpha]/IFN[gamma] induit l'apoptose des cellules épithéliales dans ~25% de la population cellulaire selon une voie dépendante des caspases. Or, l'utilisation d'inhibiteurs de caspases a permis de démontrer que l'augmentation de la sécrétion des laminines-5 et -10 et de l'apoptose, toutes deux induites par la combinaison TNF[alpha]/IFN[gamma], constituent deux mécanismes concomitants mais indépendants. Puisque les laminines de la membrane basilaire sont d'origines épithéliale mais aussi myofibroblastique, nous avons soulevé une seconde hypothèse voulant que la couche myofibroblastique sous-épithéliale puisse également être une cible des cytokines pro-inflammatoires et que leur altération puisse affecter l'homéostasie épithélio-mésenchymateuse. Encore une fois, des observations faites précédemment in vivo ont montré une altération du marqueur de myofibroblaste, l'[alpha]-actine de muscle lisse ([alpha]-AML), dans les régions péricryptales aux sites d'inflammation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.