O câncer de mama é a doença maligna que mais acomete as mulheres no mundo. Apesar dos inúmeros tratamentos, o óbito se deve principalmente à doença metastática que pode se desenvolver a partir do tumor primário. Esta progressão tumoral decorre da dificuldade de se estabelecer um prognóstico mais preciso. Atualmente, a teoria de células iniciadoras de tumor vem sendo estudada para tentar explicar a biologia do câncer e descrever novos alvos para prognósticos e terapias. O carcinoma mamário foi o primeiro tumor sólido para o qual foi identificada uma subpopulação celular, definida como CD44+/CD24-, apresentando as características de células iniciadoras tumorais. Embora este fenótipo venha sendo muito utilizado para descrever as células iniciadoras tumorais de mama, muitos trabalhos tem questionado a relevância clínica desses marcadores, enfatizando que outros marcadores devem ser identificados. Assim, o objetivo deste trabalho é analisar e caracterizar marcadores de células-tronco que possam estar relacionados com o grau de malignidade no modelo de câncer de mama. Inicialmente, analisou-se a expressão de 10 marcadores de células-tronco em diferentes linhagens de câncer de mama que apresentam graus crescentes de malignidade. O CD90 foi selecionado devido à alta expressão desse marcador na linhagem mais agressiva Hs578T. Para a caracterização deste marcador, realizou-se ensaios funcionais, através do silenciamento do CD90 na linhagem tumorigênica Hs579T e sua superexpressão na linhagem não-tumorigênica MCF10A. As linhagens celulares geradas foram caracterizadas quanto ao crescimento celular, potencial invasivo e metastático. Foi possível observar que houve uma alteração da morfologia nas linhagens transformadas com o CD90 e, também, um maior tempo de dobramento na linhagem Hs578T-CD90- e um menor na MCF10A-CD90+. Além disso, a linhagem MCF10-CD90+ foi capaz de crescer independentemente de EGF. Através da análise da via EGF, foi possível observar que houve um aumento da expressão da forma fosforilada do receptor e dos fatores Erk, c-Jun, e Jnk na linhagem MCF10A-CD90+ e uma diminuição dos mesmos na linhagem Hs578T-CD90-. A análise da atividade do elemento responsivo do fator de transcrição AP1 comprovou que a via de EGF é funcional na linhagem MCF10-CD90+. Também foram analisados os marcadores de transição epitélio-mesenquimal, verificando-se aumento da expressão dos marcadores mesenquimais na linhagem MCF10A-CD90+ e diminuição na linhagem Hs578T-CD90-. Os ensaios in vitro de invasão mostraram que as células MCF10-CD90+ são capazes de migrar e invadir e as células Hs578T-CD90- apresentam diminuição significativa da habilidade de migração e invasão. Além disso, os ensaios de metástase in vitro e in vivo, mostraram que a superexpressão de CD90 levou à malignização das células MCF10A. Por outro lado, a linhagem Hs578T-CD90- apresentou menor potencial metastático in vitro. Portanto, neste trabalho, pela primeira vez, o CD 90 foi caracterizado funcionalmente como um marcador envolvido na transformação maligna do carcinoma mamário, contribuindo, assim, para melhor entendimento da biologia do câncer de mama e para que se possa desenvolver novas ferramentas de diagnóstico/prognóstico e novos protocolos clínicos e terapêuticos. / Breast cancer is the malignant disease which affects the highest number of women in the world. In spite of the numerous treatments available, death is primarily due to the metastatic disease that may develop from the primary tumor. This tumor progression occurs because of the difficulty in establishing an accurate diagnosis/prognosis. Currently, the tumor initiating cells theory is being applied in an attempt to explain cancer biology and to unveil new diagnostic and therapeutic targets. Mammary carcinoma was the first solid tumor in which a cellular subpopulation, defined as CD44+/CD24-, was associated with tumor initiating cells. Although this phenotype has been widely used to describe breast tumor initiating cells, several studies have questioned the clinical relevance of these markers, emphasizing that additional markers should be identified. The objective of the present study is to analyze and characterize stem cell markers that may be related to malignancy stages in the breast cancer model. Initially, the expression of 10 stem cell markers was analyzed in different breast cancer cell lines displaying different malignancy grades. CD90 was selected due to its high expression levels in the most aggressive cell line, namely: Hs578T. In order to further characterize this marker, a functional study was performed in which CD90 was silenced in the Hs578T tumorigenic cell line and overexpressed in the non-tumorigenic MCF10A cell line. The resulting cell lines were characterized relative to growth rate and invasive and metastatic potential. A change in morphology readily was observed in the cell lines overexpressing CD90. In addition, the Hs578T-CD90-cell line presented an increased doubling time (DT), while the MCF10A-CD90+ cell line displayed a lower DT.. Furthermore, MC10-CD90+ cells were able to grow in the absence of EGF. Analysis of components of the EGF pathwayrevealed increased expression levels of the phosphorylated form of Erk, c-Jun and Jnk receptors in the MCF10-CD90+ cell line, while Hs578T-CD90- cells presented decreased expression of the same factors and receptors. Analysis of the activity of the AP1 responsive element allowed confirmation that the EGF pathway is functional in the MCF10-CD90+. . Epithelial-mesenquimal transition markers presented increased expression levels in the MCF10A-CD90+ cell line, accompanied by decreased expression levels in Hs578T-CD90- cells. In vitro invasion assays showed that MCF10A-CD90+ cells are capable of migrating and invading, while Hs578T-CD90- cells presented a significant decrease in their ability to migrate and invade. Additionally, in vitro and in vivo metastasis assays showed that malignization ensued upon overexpression of CD90 in MCF10A cells and a lower tendency to form metastasis in vitro was observed for the Hs578T-CD90- cell line. Therefore, the present study presents, for the first time in the literature, the functional characterization of CD90 as a genetic marker involved in the malignant transformation of mammary carcinoma, leading to a better understanding of the breast cancer biology, which may, in turn, lead to the development of new clinical and therapeutic protocols.

Das humane CD90 (Thy-1), ein membrangebundenes Glykoprotein, wird auf der Oberfläche von aktivierten mikrovaskulären Endothelzellen (EC), Fibroblasten, Nervenzellen und einer Subpopulation von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen exprimiert. CD90 fungiert als Adhäsionsmolekül auf aktivierten mikrovaskulären EC, indem es die Bindung von Leukozyten über die Interaktion mit dem Integrin alfambeta2 (Mac-1, CD11b/CD18) oder dem Adhäsions-GPCR CD97 an das Endothel vermittelt. Die Expression von CD90 auf mikrovaskulären EC wurde sowohl in-vitro als auch in-vivo nachgewiesen. Zur Expression von CD90 auf makrovaskulären EC gibt es nur wenige und sich zum Teil widersprechende in-vitro Daten. In-situ konnte die Expression von CD90 auf diesen Zellen bisher nicht gezeigt werden. Die Atherosklerose ist ein stufenweise verlaufendes chronisch-entzündliches Geschehen in den arteriellen Gefäßen. In der vorliegenden Arbeit wurde in atherosklerotisch-veränderten Gefäßen die Expression von CD90 auf humanen makrovaskulären EC in-situ demonstriert. Dabei wurden neben Operationspräparaten von Patienten mit einer Stenose der A. carotis interna, die entsprechend der American Heart Association Klassifikation die höchsten Atherosklerosestadien zeigen, auch Gefäßtransplantate von Organspendern, die meist nur eine geringe Ausprägung der Atherosklerose aufwiesen, untersucht. CD90 wurde in jedem Atherosklerosestadium auf EC nachgewiesen. Eine signifikante Zunahme der CD90 Expression in höheren Atherosklerosestadien konnte gezeigt werden. Die histologischen Merkmale der Plaque, wie Verkalkung, Blutung, Plaqueruptur oder Thrombusformation korrelieren nicht mit der CD90 Expression. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen symptomatischer und asymptomatischer A.carotis interna-Stenose konnte bezüglich der CD90 Expression auf makrovaskulären EC ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Weiterhin sollte mittels Stimulationsversuchen in-vitro geklärt werden, wie die CD90 Expression auf makrovaskulären EC im Rahmen der Atherosklerose auf den makrovaskulären EC reguliert wird. Denkbar ist, dass Zytokine, die eine Rolle im atherosklerotischen Prozess spielen, einen Einfluss auf die CD90 Expression ausüben. Deshalb wurde die Expression von CD90 auf makrovaskulären EC nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen untersucht. Die Expression von CD90 konnte in-vitro durch pro-inflammatorische Zytokine tendenziell erhöht werden. Die Stimulation mit CXCL12, einem bedeutsamen Trigger der Mobilisation der endothelialen Vorläuferzellen, der in atherosklerotischen, aber nicht in gesunden Gefäßen nachweisbar ist, bewirkte einen signifikanten Anstieg der CD90 Expression. Durch die Stimulation mit den lipid-beladenen Schaumzellen, die zahlreich in atherosklerotischen Läsionen vorhanden sind, konnte die CD90 Expression eher reduziert werden. Da Diabetes mellitus mit einem früheren Auftreten einer Atherosklerose assoziiert ist, wurden die makrovaskulären EC auch mit D-Glukose inkubiert. Dies führte ebenfalls zur tendenziellen Reduktion der CD90 Expression. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit die CD90-Expression auf den makrovaskulären EC in-situ eindeutig demonstriert werden. Im Rahmen der Atherosklerose nimmt CD90-Expression auf den makrovaskulären EC in den höheren Atherosklerosestadien zu. Eine tendenzielle Zunahme der CD90 Expression nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen, die an der Atheroskleroseentwicklung beteiligt sind, sowie eine signifikante Hochregulation der CD90 Expression nach Stimulation mit einem Trigger der EPC-Migration, dem CXCL12, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden. Die Ergebnisse deuten auf eine wichtige Rolle des CD90 auf makrovaskulären EC in dem atherosklerotischen Prozess hin. Die publizierten Daten zeigen, dass CD90 in die Leukozytenmigration durch das aktivierte mikrovaskuläre Endothel involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch nicht eindeutig nachgewiesen werden, welche Funktion das CD90 auf makrovaskulären EC besitzt. Hierbei ergaben sich zusammenfassend zwei an sich unterschiedliche Hypothesen. Zum einen zeigt die tendenzielle Zunahme der CD90-Expression nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen, dass CD90 an der Migration der neutrophilen Granulozyten und somit z.B. durch die Freisetzung von MMP-9 an der Destruktion der Plaque beteiligt sein kann. Zum anderen könnte man behaupten, dass die signifikante Hochregulation der CD90-Expression nach Stimulation mit dem CXCL12 auf die Beteiligung des CD90 an der EPC-Migration hindeutet. Somit könnte CD90 durch die EPC-Migration sowie z.B. zusätzlich durch die eingewanderten neutrophilen Granulozyten, welche den Zelldebris phagozytieren, in die Neointimaformation involviert sein. Um eine sichere Aussage diesbezüglich treffen zu können sind weitere Untersuchungen notwendig.

O câncer de mama é a doença maligna que mais acomete as mulheres no mundo. Apesar dos inúmeros tratamentos, o óbito se deve principalmente à doença metastática que pode se desenvolver a partir do tumor primário. Esta progressão tumoral decorre da dificuldade de se estabelecer um prognóstico mais preciso. Atualmente, a teoria de células iniciadoras de tumor vem sendo estudada para tentar explicar a biologia do câncer e descrever novos alvos para prognósticos e terapias. O carcinoma mamário foi o primeiro tumor sólido para o qual foi identificada uma subpopulação celular, definida como CD44+/CD24-, apresentando as características de células iniciadoras tumorais. Embora este fenótipo venha sendo muito utilizado para descrever as células iniciadoras tumorais de mama, muitos trabalhos tem questionado a relevância clínica desses marcadores, enfatizando que outros marcadores devem ser identificados. Assim, o objetivo deste trabalho é analisar e caracterizar marcadores de células-tronco que possam estar relacionados com o grau de malignidade no modelo de câncer de mama. Inicialmente, analisou-se a expressão de 10 marcadores de células-tronco em diferentes linhagens de câncer de mama que apresentam graus crescentes de malignidade. O CD90 foi selecionado devido à alta expressão desse marcador na linhagem mais agressiva Hs578T. Para a caracterização deste marcador, realizou-se ensaios funcionais, através do silenciamento do CD90 na linhagem tumorigênica Hs579T e sua superexpressão na linhagem não-tumorigênica MCF10A. As linhagens celulares geradas foram caracterizadas quanto ao crescimento celular, potencial invasivo e metastático. Foi possível observar que houve uma alteração da morfologia nas linhagens transformadas com o CD90 e, também, um maior tempo de dobramento na linhagem Hs578T-CD90- e um menor na MCF10A-CD90+. Além disso, a linhagem MCF10-CD90+ foi capaz de crescer independentemente de EGF. Através da análise da via EGF, foi possível observar que houve um aumento da expressão da forma fosforilada do receptor e dos fatores Erk, c-Jun, e Jnk na linhagem MCF10A-CD90+ e uma diminuição dos mesmos na linhagem Hs578T-CD90-. A análise da atividade do elemento responsivo do fator de transcrição AP1 comprovou que a via de EGF é funcional na linhagem MCF10-CD90+. Também foram analisados os marcadores de transição epitélio-mesenquimal, verificando-se aumento da expressão dos marcadores mesenquimais na linhagem MCF10A-CD90+ e diminuição na linhagem Hs578T-CD90-. Os ensaios in vitro de invasão mostraram que as células MCF10-CD90+ são capazes de migrar e invadir e as células Hs578T-CD90- apresentam diminuição significativa da habilidade de migração e invasão. Além disso, os ensaios de metástase in vitro e in vivo, mostraram que a superexpressão de CD90 levou à malignização das células MCF10A. Por outro lado, a linhagem Hs578T-CD90- apresentou menor potencial metastático in vitro. Portanto, neste trabalho, pela primeira vez, o CD 90 foi caracterizado funcionalmente como um marcador envolvido na transformação maligna do carcinoma mamário, contribuindo, assim, para melhor entendimento da biologia do câncer de mama e para que se possa desenvolver novas ferramentas de diagnóstico/prognóstico e novos protocolos clínicos e terapêuticos. / Breast cancer is the malignant disease which affects the highest number of women in the world. In spite of the numerous treatments available, death is primarily due to the metastatic disease that may develop from the primary tumor. This tumor progression occurs because of the difficulty in establishing an accurate diagnosis/prognosis. Currently, the tumor initiating cells theory is being applied in an attempt to explain cancer biology and to unveil new diagnostic and therapeutic targets. Mammary carcinoma was the first solid tumor in which a cellular subpopulation, defined as CD44+/CD24-, was associated with tumor initiating cells. Although this phenotype has been widely used to describe breast tumor initiating cells, several studies have questioned the clinical relevance of these markers, emphasizing that additional markers should be identified. The objective of the present study is to analyze and characterize stem cell markers that may be related to malignancy stages in the breast cancer model. Initially, the expression of 10 stem cell markers was analyzed in different breast cancer cell lines displaying different malignancy grades. CD90 was selected due to its high expression levels in the most aggressive cell line, namely: Hs578T. In order to further characterize this marker, a functional study was performed in which CD90 was silenced in the Hs578T tumorigenic cell line and overexpressed in the non-tumorigenic MCF10A cell line. The resulting cell lines were characterized relative to growth rate and invasive and metastatic potential. A change in morphology readily was observed in the cell lines overexpressing CD90. In addition, the Hs578T-CD90-cell line presented an increased doubling time (DT), while the MCF10A-CD90+ cell line displayed a lower DT.. Furthermore, MC10-CD90+ cells were able to grow in the absence of EGF. Analysis of components of the EGF pathwayrevealed increased expression levels of the phosphorylated form of Erk, c-Jun and Jnk receptors in the MCF10-CD90+ cell line, while Hs578T-CD90- cells presented decreased expression of the same factors and receptors. Analysis of the activity of the AP1 responsive element allowed confirmation that the EGF pathway is functional in the MCF10-CD90+. . Epithelial-mesenquimal transition markers presented increased expression levels in the MCF10A-CD90+ cell line, accompanied by decreased expression levels in Hs578T-CD90- cells. In vitro invasion assays showed that MCF10A-CD90+ cells are capable of migrating and invading, while Hs578T-CD90- cells presented a significant decrease in their ability to migrate and invade. Additionally, in vitro and in vivo metastasis assays showed that malignization ensued upon overexpression of CD90 in MCF10A cells and a lower tendency to form metastasis in vitro was observed for the Hs578T-CD90- cell line. Therefore, the present study presents, for the first time in the literature, the functional characterization of CD90 as a genetic marker involved in the malignant transformation of mammary carcinoma, leading to a better understanding of the breast cancer biology, which may, in turn, lead to the development of new clinical and therapeutic protocols.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Das humane CD90 (Thy-1), ein membrangebundenes Glykoprotein, wird auf der Oberfläche von aktivierten mikrovaskulären Endothelzellen (EC), Fibroblasten, Nervenzellen und einer Subpopulation von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen exprimiert. CD90 fungiert als Adhäsionsmolekül auf aktivierten mikrovaskulären EC, indem es die Bindung von Leukozyten über die Interaktion mit dem Integrin alfambeta2 (Mac-1, CD11b/CD18) oder dem Adhäsions-GPCR CD97 an das Endothel vermittelt. Die Expression von CD90 auf mikrovaskulären EC wurde sowohl in-vitro als auch in-vivo nachgewiesen. Zur Expression von CD90 auf makrovaskulären EC gibt es nur wenige und sich zum Teil widersprechende in-vitro Daten. In-situ konnte die Expression von CD90 auf diesen Zellen bisher nicht gezeigt werden. Die Atherosklerose ist ein stufenweise verlaufendes chronisch-entzündliches Geschehen in den arteriellen Gefäßen. In der vorliegenden Arbeit wurde in atherosklerotisch-veränderten Gefäßen die Expression von CD90 auf humanen makrovaskulären EC in-situ demonstriert. Dabei wurden neben Operationspräparaten von Patienten mit einer Stenose der A. carotis interna, die entsprechend der American Heart Association Klassifikation die höchsten Atherosklerosestadien zeigen, auch Gefäßtransplantate von Organspendern, die meist nur eine geringe Ausprägung der Atherosklerose aufwiesen, untersucht. CD90 wurde in jedem Atherosklerosestadium auf EC nachgewiesen. Eine signifikante Zunahme der CD90 Expression in höheren Atherosklerosestadien konnte gezeigt werden. Die histologischen Merkmale der Plaque, wie Verkalkung, Blutung, Plaqueruptur oder Thrombusformation korrelieren nicht mit der CD90 Expression. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen symptomatischer und asymptomatischer A.carotis interna-Stenose konnte bezüglich der CD90 Expression auf makrovaskulären EC ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Weiterhin sollte mittels Stimulationsversuchen in-vitro geklärt werden, wie die CD90 Expression auf makrovaskulären EC im Rahmen der Atherosklerose auf den makrovaskulären EC reguliert wird. Denkbar ist, dass Zytokine, die eine Rolle im atherosklerotischen Prozess spielen, einen Einfluss auf die CD90 Expression ausüben. Deshalb wurde die Expression von CD90 auf makrovaskulären EC nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen untersucht. Die Expression von CD90 konnte in-vitro durch pro-inflammatorische Zytokine tendenziell erhöht werden. Die Stimulation mit CXCL12, einem bedeutsamen Trigger der Mobilisation der endothelialen Vorläuferzellen, der in atherosklerotischen, aber nicht in gesunden Gefäßen nachweisbar ist, bewirkte einen signifikanten Anstieg der CD90 Expression. Durch die Stimulation mit den lipid-beladenen Schaumzellen, die zahlreich in atherosklerotischen Läsionen vorhanden sind, konnte die CD90 Expression eher reduziert werden. Da Diabetes mellitus mit einem früheren Auftreten einer Atherosklerose assoziiert ist, wurden die makrovaskulären EC auch mit D-Glukose inkubiert. Dies führte ebenfalls zur tendenziellen Reduktion der CD90 Expression. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit die CD90-Expression auf den makrovaskulären EC in-situ eindeutig demonstriert werden. Im Rahmen der Atherosklerose nimmt CD90-Expression auf den makrovaskulären EC in den höheren Atherosklerosestadien zu. Eine tendenzielle Zunahme der CD90 Expression nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen, die an der Atheroskleroseentwicklung beteiligt sind, sowie eine signifikante Hochregulation der CD90 Expression nach Stimulation mit einem Trigger der EPC-Migration, dem CXCL12, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden. Die Ergebnisse deuten auf eine wichtige Rolle des CD90 auf makrovaskulären EC in dem atherosklerotischen Prozess hin. Die publizierten Daten zeigen, dass CD90 in die Leukozytenmigration durch das aktivierte mikrovaskuläre Endothel involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch nicht eindeutig nachgewiesen werden, welche Funktion das CD90 auf makrovaskulären EC besitzt. Hierbei ergaben sich zusammenfassend zwei an sich unterschiedliche Hypothesen. Zum einen zeigt die tendenzielle Zunahme der CD90-Expression nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen, dass CD90 an der Migration der neutrophilen Granulozyten und somit z.B. durch die Freisetzung von MMP-9 an der Destruktion der Plaque beteiligt sein kann. Zum anderen könnte man behaupten, dass die signifikante Hochregulation der CD90-Expression nach Stimulation mit dem CXCL12 auf die Beteiligung des CD90 an der EPC-Migration hindeutet. Somit könnte CD90 durch die EPC-Migration sowie z.B. zusätzlich durch die eingewanderten neutrophilen Granulozyten, welche den Zelldebris phagozytieren, in die Neointimaformation involviert sein. Um eine sichere Aussage diesbezüglich treffen zu können sind weitere Untersuchungen notwendig.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-09T12:38:26Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maisa Ribeiro - 2015.pdf: 1621645 bytes, checksum: 2b3a1e65f1e53b4a1264cf3febb2c630 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-09T12:41:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maisa Ribeiro - 2015.pdf: 1621645 bytes, checksum: 2b3a1e65f1e53b4a1264cf3febb2c630 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-09T12:41:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maisa Ribeiro - 2015.pdf: 1621645 bytes, checksum: 2b3a1e65f1e53b4a1264cf3febb2c630 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-02-19 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / In the lesions carcinomatous, low oxygen tension plays a crucial step in the self-renewal, metastatic potential, and therapy resistance of cancers. To adapt to the hypoxic microenvironment, neoplastic cells activate hypoxia-induced factor-1 alpha (HIF-1 alpha), which may mediates invasion and metastasis. In addition, the human THY-1 (CD90) cell surface protein mediates cell adhesion expressed in stem cells, and seens to drive tumor development in some malignant tumors. The present study investigates HIF-1 alpha (n=98) and CD90 (n=97) expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and metastatic lymph nodes (n=24), the intratumoral region and the invasive front, by immunohistochemistry. Furthermore, clinicopathological data revised from the medical records. In superficial OSCCs, most tumor cells overexpressed HIF-1 alpha, whereas was restricted in the intratumoral region in invasive conventional SCCs. Interestingly, metastatic lymph nodes (91.7%, p=0.001), and intratumoral regions of its corresponding primary tumors (83.3%, p<0.001) were invaded by HIF-1 alpha-positive neoplastic cells. Overall survival was poor in patients with nodal involvement. CD90 was expressed mostly in microvessels and granulocyte cells similar to mast cells. These cells expressed CD90 mostly in the peritumoral region of invasive SCC (p<0.001). Microvessels CD90 positive were higher in the intratumoral region (p=0.032). Interesting, mast cell and microvessels positively correlated in OSCC (p=0.006; r²=0.077). In conclusion, hypoxic environment may facilitate regional metastasis and serve as a potential diagnostic and prognostic marker in OSCC primary tumors. Microvessels CD90 positive seems to promote tumor growth except in BSCC. Mast cell may occur via CD90 for tumor progression. / Nas lesões carcinomatosas a baixa tensão de oxigênio desempenha um passo crucial para a auto-renovação, potencial metastático, e resistência à terapia no câncer. Para se adaptar ao ambiente hipóxico, células neoplásicas ativam o fator induzido por hipóxia-1 alfa (HIF-1 alfa), que pode facilitar a invasão e metástase. Além disso, o THY-1 (CD90) humano, uma proteína de superfície celular expressa em células estaminais, medeia a adesão celular, e parece promover o desenvolvimento em alguns tumores malignos. O presente estudo analisou a expressão das proteínas HIF-1 alfa (n = 98) e CD90 (n = 97) no carcinoma espinocelular de boca (CEC de boca) e linfonodos metastáticos (n=24), na região intratumoral e no fronte de invasão, por meio de imunoistoquímica. Além disso os dados clinicopatológicos foram revisados a partir dos prontuários médicos e a sobrevida foi analisada. No CEC microinvasivo, a maioria das células tumorais apresentaram superexpressão do HIF-1 alfa, enquanto que no CEC invasivo a superexpressão foi restrita na região intratumoral. Verificou-se que em linfonodos metastáticos (91,7%, p = 0,001), e regiões intratumorais dos seus tumores primários correspondentes (83,3%, p <0,001) houve forte expressão do HIF-1 alfa em células neoplásicas. A sobrevida global foi pior em pacientes com metástase regional. A proteína CD90 foi expressa principalmente em microvasos e células de granulócitos semelhantes aos mastócitos. Estas células expressaram CD90 principalmente na região fronte de invasão do CEC invasivo (p<0,001). A média de microvasos CD90 positivo foi maior na região intratumoral (p=0,032). Interessantemente, mastócitos e microvasos foram positivamente correlacionados no CEC de boca (p=0,006; r²=0,077). Em conclusão, o ambiente hipóxico pode facilitar metástases regionais e funcionar como um potencial marcador de diagnóstico e prognóstico em tumores primários do CEC de boca. Os microvasos CD90 positivo parecem promover o crescimento do tumor, exceto no carcinoma escamoso basalóide (CEB). Os mastócitos ativados via CD90 podem contribuir com a progressão do tumor.

Thy-1 (CD90) ist ein Oberflächenrezeptor, der bereits 1963 entdeckt wurde. Bis heute ist seine Expression auf zahlreichen Zellen nachgewiesen, in welchen Thy-1 verschiedenste intrazelluläre Signalkaskaden beeinflusst und in seiner Funktionalität folglich große Diversität zeigt. Auch auf Fibroblasten wird Thy-1 konstitutiv exprimiert. Fibroblasten kommen ubiquitär im Körper vor, sind Hauptproduzenten der extrazellulären Matrix und von essentieller Bedeutung für die Gewebshomöstase. Darüber hinaus sind sie auch Modulatoren des Immunsystems. Thy-1 kann auf die verschiedenen Funktionen der Fibroblasten Einfluss nehmen. Dabei kann sich das Ergebnis der Interaktion von Thy-1 mit den Zellfunktionen, in Abhängigkeit der Lokalisation der Fibroblasten, unterscheiden. In Lungen- und dermalen Fibroblasten hemmt Thy-1 die Proliferation und Apoptose dieser Zellen und limitiert so fibrotische Prozesse. Des Weiteren hemmt Thy-1 die Differenzierung von Lungenfibroblasten und wirkt so der Lungenfibrose entgegen. In dermalen Fibroblasten hingegen unterstützt Thy-1 die Differenzierung der Zellen und scheint dadurch eine profibrotische Wirkung in der Pathogenese der Sklerodermie zu besitzen. Darüber hinaus ist nachgewiesen, dass Thy-1 die Wirkung des proinflammatorischen Zytokins TNF-α in Lungenfibroblasten und murinen embryonalen Fibroblasten abschwächt und folglich eine antiinflammatorische Wirkung zeigt. Im Vergleich dazu zeigen Thy-1+ Synovialfibroblasten im Vergleich zu der Subpopulation ohne Expression von Thy-1 ein proinflammatorisches Expressionsprofil in einem Mausmodell der rheumatoiden Arthritis. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung von Thy-1 auf die Genexpression von dermalen Fibroblasten im Hinblick auf immunmodulatorische und fibrotische Prozesse untersucht. Hierfür wurden Fibroblasten aus Wildtyp-Mäusen und Thy-1 defizienten KO-Mäusen isoliert und anschließend kultiviert. Es fand ein Vergleich der WT Fibroblasten mit den KO Fibroblasten stimuliert, wie auch unstimuliert statt. Stimuliert wurden die Zellen nach einer 24-stündigen Hungerperiode mit TNF-α und IL-1β. Der Vergleich wurde anhand von Daten eines Microarray und Ergebnissen aus quantitativen real-time PCRs vollzogen. Die Ergebnisse des Microarray zeigten eine Assoziation von Thy-1 mit der Expression von Genen, die im Zusammenhang mit inflammatorischen Prozessen und Autoimmunerkrankungen wie der Psoriasis, der rheumatoiden Arthritis und dem systemischen Lupus erythematodes stehen. Dabei bewirkt Thy-1 eine gesenkte Expression entsprechender Gene, was einen antiinflammatorischen Effekt von Thy-1 vermuten lässt. In den Ergebnissen aus dem Microarray und den PCRs zeigte sich bei Abwesenheit von Thy-1 eine erhöhte Expression der Chemokine CCL6, CCL7, CCL8 und CXCL9, der Zytokine IL-18 und IL-33, des Zytokinrezeptors IL-23R und des Proliferations-assoziierten Gens Grem1. Die Ergebnisse der Chemokine CCL6, CCL7, CCL8 und CXCL9 weisen darauf hin, dass Thy-1 die chemotaktische Wirkung dermaler Fibroblasten auf Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, natürlichen Killerzellen und T-Lymphozyten hemmt. Die Chemokine stehen dabei im Zusammenhang mit entzündlichen Prozessen der atopischen Dermatitis, der Psoriasis, der systemischen Sklerose und der rheumatoiden Arthritis, auf deren Pathogenese Thy-1 also einen suppressiven Effekt haben könnte. Dass die Expression von Thy-1 auf dermalen Fibroblasten einen immunmodulatorischen Effekt besitzt, unterstützen auch die Ergebnisse für IL-18, IL-33 und IL-23R. IL-18 ist ein proinflammatorisches Zytokin, das eine Entzündungreaktion in Fibroblasten hervorrufen kann. IL-33 ist ein Aktivator der Mastzellen, T-Zellen, basophilen und eosinophilen Granulozyten. Seine Wirkung auf entsprechende Immunzellen ist Teil der Pathogenese der atopischen Dermatitis. IL-23R und sein Bindungspartner IL-23 sind assoziiert mit der rheumatoiden Arthritis und führen zu einer gesteigerten Expression von IL-8, welches wiederum die Migration neutrophiler Granulozyten stimuliert. Da Thy-1 die Expression dieser Gene senkt, lässt sich auch hier eine antiinflammtorische Wirkung vermuten. Darüber hinaus offenbarten die Ergebnisse aus Microarray und PCRs eine gehemmte Expression von Grem1 in Anwesenheit von Thy-1. Für Grem1, sowie IL18 und IL-33 sind Proliferations-unterstützende Wirkungen auf Fibroblasten nachgewiesen. Es ist bereits gezeigt worden, dass Fibroblastenkulturen mit Expression von Thy-1 ein niedrigeres Wachstum zeigen. Die Thy-1-vermittelte Hemmung der Genexpression besagter Gene könnte die antiproliferative Wirkung auf dermale Fibroblasten erklären. Auch ein Zusammenhang zwischen Thy-1 und fibrotischen Prozessen ist zu diskutieren. Für die Gene CCL7, Grem1 und IL-33 ist eine profibrotische Wirkung in der Pathogenese der systemischen Sklerose nachgewiesen. Ebenso stehen CCL6, CCL8 und IL-18 in Zusammenhang mit einer Fibrose-fördernden Wirkung. Da Thy-1 die Expression dieser Gene senkt, ist ein antifibrotischer Effekt denkbar. Es existieren allerdings auch Untersuchungen, die für eine Fibrose-fördernde Wirkung von Thy-1 im Kontext der systemischen Sklerose sprechen. Die genaue Rolle von Thy-1 in Bezug zur Fibrose bleibt folglich unklar. Weiterführend sollten die Ergebnisse der Genexpression aus PCRs und Microarray auch auf Proteinebene untersucht, sowie mögliche intrazelluläre Signalwege über die Thy-1 seine Wirkung entfaltet, exploriert werden. Um die genaue Funktion von Thy-1 in fibrotischen Prozessen der Haut zu ergründen, wäre ein Mausmodell mit Bleomycin-induzierter kutaner Fibrose möglich. Zusammenfassend kann aus den Ergebnissen abgleitet werden, dass die Expression von Thy-1 auf dermalen Fibroblasten in eine antiinflammatorische, die Chemotaxis von Immunzellen hemmende, sowie antiproliferative und antifibrotische Wirkung resultiert. Der Zusammenhang von Thy-1 mit Hauterkrankungen wie der systemischen Sklerose und weiterer Erkrankungen, die auf Autoimmunprozessen beruhen, machen den Zellrezeptor weiterhin zu einem interessanten Forschungsobjekt.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Aufbau und Funktion der Haut 1.1.1 Epidermis 1.1.2 Dermis und Subcutis 1.2 Vorkommen und Funktion von Fibroblasten 1.3 Thy-1 1.3.1 Das Thy-1 Gen 1.3.2 Das Thy-1 Protein 1.3.3 Lösliches Thy-1 1.3.4 Durch Thy-1 vermittelte Signalwege 1.3.5 Expression von Thy-1 1.3.6 Funktion von Thy-1 auf Fibroblasten 2. Aufgabenstellung 3. Material 3.1 Geräte und Hilfsmittel 3.2 Verbrauchsmaterialien 3.3 Chemikalien und Antibiotika 3.4 Zusammensetzung von Puffern und Medien 3.5 Murine Fibroblasten 3.6 Primer 3.7 Kits 3.8 Software 4. Methoden 4.1 Zellbiologische Methoden 4.1.1 Arbeit mit der Zellkultur 4.1.2 Isolation dermaler Fibroblasten aus Mäusen 4.1.3 Bestimmung der Zellzahl 4.1.4 Stimulation der Zellen 4.2 Molekularbiologische Methoden 4.2.1 RNA-Isolation 4.2.2 Reverse Transkription 4.2.3 Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) 4.2.4 Herstellung der Standard-Plasmide für die qRT-PCR 4.2.5 Genexpressionsanalyse durch mRNA-Microarray 4.3 Statistische Auswertung 5. Ergebnisse 5.1 Funktionelle Rolle von Thy-1 für die Immunreaktion 5.1.1 Einfluss von Thy-1 auf die Expression von ausgewählten Chemokinen und MMP-13 in dF 5.1.2 Auswirkungen von Thy-1 auf die Expression von IL-6 in dF 5.2 Analyse der Genexpression 5.3 Einfluss von Thy-1 auf Proliferations-assoziierte Gene 6. Diskussion 6.1 Die Bedeutung von Thy-1 für die Modulation der Genexpression inflammatorischer, und immunregulatorischer Gene 6.1.1 Rolle von Thy-1 in der Kontrolle der Expression von Chemokinen 6.1.2 Rolle von Thy-1 in der Kontrolle der IL-6 Expression 6.1.3 Rolle von Thy-1 in der Kontrolle der MMP-13 Expression 6.1.4 Rolle von Thy-1 in der Kontrolle von immunregulatorischen Mediatoren 6.2 Einfluss von Thy-1 auf die Proliferation von dF 6.3 Mögliche Auswirkungen von Thy-1 auf Erkrankungen der Haut 7. Zusammenfassung Literaturverzeichnis Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit Danksagung

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21642号 / 医博第4448号 / 新制||医||1034(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妹尾 浩, 教授 小川 誠司, 教授 坂井 義治 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM