Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les smectites possèdent des propriétés qui en font des candidates potentielles pour constituer une des barrières pour le stockage des déchets radioactifs en milieu géologique profond : faible perméabilité, gonflement et rétention de cations. Le cœur de cette thèse est la détermination des liens existant entre les propriétés d'hydratation, de gonflement et de<br />mobilité des cations, c'est-à-dire les propriétés de confinement du matériau.<br />L'objectif est de comprendre et prédire le comportement de l'eau dans les smectites en suivant deux axes de recherche : les aspects mécanistique et énergétique de l'hydratation des smectites. Nous avons travaillé sur la montmorillonite Na-Ca contenue dans la bentonite MX80, sous forme échangée, et monoionique (saturée par des cations alcalins ou des cations Ca).<br />L'approche traverse les différentes échelles (microscopique, mésoscopique et macroscopique)<br />et conduit à étudier les différentes composantes du système (feuillet-cation-eau), en mettant en œuvre des méthodes expérimentales de manière originale (thermoporométrie et conductivité électrique pour différentes humidités relatives (HR)) et des méthodes théoriques (calculs électrostatiques).<br />En premier lieu, l'état sec est défini par ATVC (Analyse Thermique à Vitesse Contrôlée). Ensuite une caractérisation classique de la porosité de la smectite pour l'état sec est réalisée (intrusion de mercure, adsorption d'azote) et nous permet de montrer l'existence d'une mésoporosité dont le rayon évolue entre 2 et 10 nm en fonction du cation compensateur.<br />Les expériences de thermoporométrie et de conductivité pour différents états d'hydratation<br />ont permis de suivre l'augmentation des tailles de pore et de la mobilité des cations en fonction de l'hydratation. Nous mettons notamment en évidence l'existence d'un gonflement osmotique mésoscopique pour de faibles humidités relatives (environ 50-60% HR) pour les cations Li et Na. En combinant les résultats de thermoporométrie, diffraction des Rayons X et conductivité électrique, nous sommes en mesure de proposer une séquence d'hydratation complète pour chaque cation, montrant ainsi le rôle du cation compensateur dans l'hydratation de la smectite : il est responsable de la structure de la porosité à l'état sec et de l'évolution des tailles de pore en fonction de la HR et il modifie la séquence d'hydratation par sa mobilité dans l'espace interfoliaire.<br />La distinction des différents types d'eau présents dans la structure argileuse est réalisée par thermoporométrie à différentes humidités relatives : eau liée aux cations et aux surfaces, eau structurée par la porosité et eau libre. Cette distinction est importante pour comprendre le comportement de l'argile et notamment les propriétés de diffusion. <br />L'importance de la nature du cation est également mise en évidence par le modèle énergétique. Les calculs électrostatiques utilisant le formalisme PACHA (Méthode d'Egalisation des Electronégativités) montrent que, pour les petits cations, l'énergie<br />d'hydratation du cation dans la structure argileuse est prépondérante, alors que pour les gros cations, c'est l'énergie d'hydratation des feuillets qui est prépondérante. Pour obtenir ces résultats, nous avons déterminé les enthalpies de surface pour l'état sec, qui montrent une évolution cohérente, en fonction de la charge partielle du cation, avec l'augmentation de taille de pores et donc de taille de particules. Ensuite, au moyen d'un modèle théorique, nous avons<br />calculé les énergies de gonflement, les énergies d'hydratation des surfaces et des cations se trouvant dans l'espace interfoliaire.<br />Le comportement de l'argile purifiée mixte (Na/Ca) est analysé à partir des résultats obtenus pour les composés homoioniques : l'argile mixte a un comportement plus proche de celui d'une argile calcique pour les expériences réalisées, alors que le cation Na est majoritaire. Cette observation implique des résultats sur les propriétés de l'argile différents de ceux escomptés pour les propriétés d'hydratation, de gonflement et de mobilité des cations interfoliaires dans le cadre des déchets radioactifs.

Une fois ingérées par un insecte sensible, les toxines insecticides du bacille de Thuringe doivent être activées par les protéases intestinales de cet insecte. Leur premier domaine, un ensemble de sept hélices-α amphipathiques, est responsable de leur insertion dans la membrane luminale de certaines cellules de l’intestin médian, ce qui crée des pores peu sélectifs. La toxicité et la capacité à former des pores d’une telle toxine, la Cry9Ca, de ses mutants simples R164A et R164K et d’un fragment de 55 kDa résultant d’un clivage protéolytique au niveau de son résidu 164 ont été étudiées à l’aide d’une combinaison de modélisation par homologie, de bioessais, d’expériences de gonflement osmotique avec des vésicules de membrane en bordure en brosse de larves de sphinx du tabac et de mesures électrophysiologiques sur des intestins isolés. Ni les mutations simples ni le clivage protéolytique n’ont altéré la toxicité de la Cry9Ca. Dans une solution à faible force ionique, toutefois, la formation des pores dépend fortement du pH : une augmentation de celui-ci de 6,5 à 10,5 a entraîné une baisse irrégulière et par étapes successives de la perméabilité membranaire. Les quatre préparations de toxine ont néanmoins dépolarisé la membrane apicale d’intestins médians fraîchement isolés baignant dans une solution contenant 122 mM de KCl à pH 10,5. L’activité de la Cry9Ca, et des mutants R164A et R164K, a été grandement stimulée lorsque les expériences ont été effectuées en présence de suc intestinal, de lipides extraits d’un volume équivalent de suc intestinal ou d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases solubles dans l’eau. De plus, le rôle des boucles inter-hélicales du Domaine I lors de l’insertion dans la membrane a été étudié avec des mutants doubles de la Cry9Ca dont les mutations introduisaient, neutralisaient ou renversaient une charge électrique. À l’exception de trois d’entres eux, tous ces mutants ont conservé une toxicité et une capacité à former des pores comparables à celles de la toxine parentale. L’ensemble de ces résultats suggère que le micro-environnement de l’intestin médian contribue à minimiser l’influence des charges de surface portées par les résidus des boucles inter-hélicales du Domaine I sur la capacité des toxines du bacille de Thuringe à former des pores. Il indique aussi que, d’une part, selon le site de clivage et les conditions expérimentales utilisées, des protéolyses supplémentaires de la toxine Cry9Ca activée peuvent soit stimuler, soit nuire à son activité et que, d’autre part, le suc intestinal du sphinx du tabac contient probablement un inhibiteur de protéases qui pourrait jouer un rôle important dans l’activité des toxines du bacille de Thuringe. / Once ingested by susceptible insects, Bacillus thuringiensis insecticidal toxins must be activated by the insect’s intestinal proteases. Their first domain, a bundle of seven amphipathic -helices, is responsible for their insertion into the luminal membrane of midgut cells, thereby creating poorly selective pores. The toxicity and pore-forming ability of one such toxin, Cry9Ca, its single-site mutants, R164A and R164K, and of the 55-kDa fragment resulting from its proteolytic cleavage at residue 164 were investigated using a combination of homology modeling, bioassays, osmotic swelling experiments with Manduca sexta larval midgut brush border membrane vesicles and electrophysiological measurements on isolated midguts. Neither the single mutations nor the proteolytic cleavage altered Cry9Ca toxicity. In low ionic strength solutions however, pore formation was highly dependent on pH: increasing pH from 6.5 to 10.5 resulted in an irregular step-wise decrease in membrane permeabilization. All four toxin preparations nevertheless depolarized the apical membrane of freshly isolated midguts bathing in a solution containing 122 mM KCl at pH 10.5. The activity of Cry9Ca, R164A and R164K was greatly enhanced when the experiments were conducted in the presence of midgut juice, the lipids extracted from an equivalent volume of midgut juice or a cocktail of water-soluble protease inhibitors. Additionally, the role of the interhelical loops of Domain I in membrane insertion was investigated with Cry9Ca double mutants with mutations that either introduced, neutralized or reversed an electrical charge. All but three mutants retained a toxicity and a pore-forming ability that were comparable to those of their parental toxin. Overall, the results suggest that the midgut microenvironment contributes to minimizing the influence of surface charges carried by Domain I interhelical loop residues on B. thuringiensis toxins pore-forming ability. They also indicate that, depending on the cleavage site and on the experimental conditions used, further proteolysis of the activated Cry9Ca toxin can either stimulate or be detrimental to its activity and that M. sexta midgut juice probably contains protease inhibitors that could play a major role in the activity of B. thuringiensis toxins in the insect midgut.

Une fois ingérées par un insecte sensible, les toxines insecticides du bacille de Thuringe doivent être activées par les protéases intestinales de cet insecte. Leur premier domaine, un ensemble de sept hélices-α amphipathiques, est responsable de leur insertion dans la membrane luminale de certaines cellules de l’intestin médian, ce qui crée des pores peu sélectifs. La toxicité et la capacité à former des pores d’une telle toxine, la Cry9Ca, de ses mutants simples R164A et R164K et d’un fragment de 55 kDa résultant d’un clivage protéolytique au niveau de son résidu 164 ont été étudiées à l’aide d’une combinaison de modélisation par homologie, de bioessais, d’expériences de gonflement osmotique avec des vésicules de membrane en bordure en brosse de larves de sphinx du tabac et de mesures électrophysiologiques sur des intestins isolés. Ni les mutations simples ni le clivage protéolytique n’ont altéré la toxicité de la Cry9Ca. Dans une solution à faible force ionique, toutefois, la formation des pores dépend fortement du pH : une augmentation de celui-ci de 6,5 à 10,5 a entraîné une baisse irrégulière et par étapes successives de la perméabilité membranaire. Les quatre préparations de toxine ont néanmoins dépolarisé la membrane apicale d’intestins médians fraîchement isolés baignant dans une solution contenant 122 mM de KCl à pH 10,5. L’activité de la Cry9Ca, et des mutants R164A et R164K, a été grandement stimulée lorsque les expériences ont été effectuées en présence de suc intestinal, de lipides extraits d’un volume équivalent de suc intestinal ou d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases solubles dans l’eau. De plus, le rôle des boucles inter-hélicales du Domaine I lors de l’insertion dans la membrane a été étudié avec des mutants doubles de la Cry9Ca dont les mutations introduisaient, neutralisaient ou renversaient une charge électrique. À l’exception de trois d’entres eux, tous ces mutants ont conservé une toxicité et une capacité à former des pores comparables à celles de la toxine parentale. L’ensemble de ces résultats suggère que le micro-environnement de l’intestin médian contribue à minimiser l’influence des charges de surface portées par les résidus des boucles inter-hélicales du Domaine I sur la capacité des toxines du bacille de Thuringe à former des pores. Il indique aussi que, d’une part, selon le site de clivage et les conditions expérimentales utilisées, des protéolyses supplémentaires de la toxine Cry9Ca activée peuvent soit stimuler, soit nuire à son activité et que, d’autre part, le suc intestinal du sphinx du tabac contient probablement un inhibiteur de protéases qui pourrait jouer un rôle important dans l’activité des toxines du bacille de Thuringe. / Once ingested by susceptible insects, Bacillus thuringiensis insecticidal toxins must be activated by the insect’s intestinal proteases. Their first domain, a bundle of seven amphipathic -helices, is responsible for their insertion into the luminal membrane of midgut cells, thereby creating poorly selective pores. The toxicity and pore-forming ability of one such toxin, Cry9Ca, its single-site mutants, R164A and R164K, and of the 55-kDa fragment resulting from its proteolytic cleavage at residue 164 were investigated using a combination of homology modeling, bioassays, osmotic swelling experiments with Manduca sexta larval midgut brush border membrane vesicles and electrophysiological measurements on isolated midguts. Neither the single mutations nor the proteolytic cleavage altered Cry9Ca toxicity. In low ionic strength solutions however, pore formation was highly dependent on pH: increasing pH from 6.5 to 10.5 resulted in an irregular step-wise decrease in membrane permeabilization. All four toxin preparations nevertheless depolarized the apical membrane of freshly isolated midguts bathing in a solution containing 122 mM KCl at pH 10.5. The activity of Cry9Ca, R164A and R164K was greatly enhanced when the experiments were conducted in the presence of midgut juice, the lipids extracted from an equivalent volume of midgut juice or a cocktail of water-soluble protease inhibitors. Additionally, the role of the interhelical loops of Domain I in membrane insertion was investigated with Cry9Ca double mutants with mutations that either introduced, neutralized or reversed an electrical charge. All but three mutants retained a toxicity and a pore-forming ability that were comparable to those of their parental toxin. Overall, the results suggest that the midgut microenvironment contributes to minimizing the influence of surface charges carried by Domain I interhelical loop residues on B. thuringiensis toxins pore-forming ability. They also indicate that, depending on the cleavage site and on the experimental conditions used, further proteolysis of the activated Cry9Ca toxin can either stimulate or be detrimental to its activity and that M. sexta midgut juice probably contains protease inhibitors that could play a major role in the activity of B. thuringiensis toxins in the insect midgut.