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Effets d'un ingrédient à base de germe de soja (Glycine max (L.) Merrill) fermenté sur l'intégrité de la barrière intestinale et la sensibilité viscérale : mécanismes d'action impliqués / Effects of a fermented soy germ ingredient(Glycine max (L.) Merrill) on intestinal barrier integrity and visceral sensitivity : mechanisms of action involvedMoussa, Lara 06 November 2012 (has links)
La barrière intestinale est la plus grande surface de contact entre le milieu extérieur et le milieu intérieur. Outre ses fonctions d'absorption des nutriments, elle exerce un rôle important de défense contre les agents indésirables (toxines, bactéries) contenus dans la lumière intestinale. Une augmentation de la perméabilité intestinale a été observée chez les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable (SII) ou des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Cette hyperperméabilité intestinale est contemporaine d'une hypersensibilité viscérale à la distension de la paroi intestinale. Des travaux récents rapportent également une augmentation de l'activité protéolytique du contenu intestinal dans le cadre de ces deux pathologies. Les estrogènes, par leurs propriétés anti-inflammatoires et leur capacité à moduler la perméabilité intestinale par activation de leurs récepteurs (REs) peuvent contribuer à l'amélioration des symptômes associés à ces pathologies digestives. Une variété de traitements médicaux a été utilisée pour la prise en charge thérapeutique du SII et de MICI. Cependant, les patients questionnent les cliniciens sur des conseils diététiques susceptibles d'améliorer leur qualité de vie. Ainsi, l'objectif de ce travail était d'évaluer les effets et les mécanismes d'action impliqués, d'un traitement par du germe de soja fermenté (SG) sur l'hyperalgésie viscérale et l'hyperperméabilité intestinale dans des modèles animaux mimant le SII et les MICI afin de proposer des futures allégations santé à ce produit. Le rationnel de l'évaluation de cet ingrédient était basé sur sa composition intéressante, à savoir, sa teneur en composés à propriétés estrogéniques (isoflavones) et sa capacité à inhiber les protéases (BBI). Dans un premier temps, nous avons montré qu'un traitement oral de 15 jours par le SG diminue de façon significative l'hypersensibilité viscérale, l'hyperperméabilité intestinale ainsi que l'augmentation de l'activité protéolytique induites par un stress de contrainte chez le rat. La diminution de la perméabilité intestinale implique une surexpression de l'occludine, protéine des jonctions serrées. De même, le traitement par du SG réduit la densité des mastocytes au niveau du côlon. Tous les effets préventifs du SG sauf ceux sur l'activité protéolytique sont estrogéno-dépendants car bloqués par l'antagoniste des REs. Dans un second temps, nous avons montré qu'un traitement préventif par le SG pendant 15 jours présente des effets protecteurs vis-à-vis d'une inflammation intestinale induite par du TNBS. Le SG atténue la sévérité de l'inflammation, l'hyperperméabilité, l'hypersensibilité et l'augmentation de l'activité protéolytique induites par la colite. Les effets anti-inflammatoires du SG sont à la fois dépendants des phytoestrogènes et du contenu de l'ingrédient en BBI. En conclusion, ces données sont prometteuses pour une future utilisation du SG dans la gestion thérapeutique du SII et des MICI comme traitement adjuvant / The intestinal barrier is the largest area of contact between the external environment and internal environment. In addition to its function of nutrient absorption, the intestinal barrier plays a key role of defense against noxious agents (toxins, bacteria) contained in the intestinal lumen. An increase in intestinal permeability was observed in patients with irritable bowel syndrome (IBS) or inflammatory bowel disease (IBD). This intestinal hyperpermeability was often associated with visceral hypersensitivity to colorectal distension. Recent studies also report an increase in the proteolytic activity in patients with IBS or IBD. Estrogens, through their anti-inflammatory properties and their ability to modulate intestinal permeability by activating estrogen receptors (ERs), can play an important role in these digestive diseases. A variety of medical therapies have been used for treatment of IBS and IBD. However, patients question clinicians about dietary suggestions to improve their symptoms and quality of life. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects and mechanisms of action involved of a treatment with fermented soy germ (SG) on visceral hyperalgesia, intestinal hyperpermeability in animal models mimicking the IBS and IBD. The evaluation of this ingredient was based on its interesting composition, i.e its content of isoflavones and a family of serine protease inhibitors known as BBI. Initially, we demonstrated that an oral treatment of 15 days by SG significantly reduces visceral hypersensitivity, intestinal hyperpermeability and increased proteolytic activity induced by acute stress in the rat. Decreased intestinal permeability is due to overexpression of occludin, a transmembrane tight junction protein. Similarly, treatment with SG reduces the density of colonic mast cells. All preventive effects of SG except those on the proteolytic activity are estrogen-dependent because blocked by the antagonist of ERs. In a second step, we demonstrated that a treatment for 15 days with SG induces protective effects against intestinal inflammation induced by TNBS. SG reduces the severity of colitis, decreases TNBS-induced hyperpermeability, hypersensitivity and increased proteolytic activity. The anti-inflammatory effects of SG are estrogen and/or BBI dependent. In conclusion, these data are promising for future use of the SG as adjuvant therapy in IBS and IBD management
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Implication des protéases à sérine de la famille des Type II Transmembrane Serine Proteases dans la Fibrose Pulmonaire Idiopathique / Serine proteases of the Type II Transmembrane Serine Proteases family involvement in Idiopathic Pulmonary FibrosisMenou, Awen 06 March 2017 (has links)
La Fibrose Pulmonaire Idiopathique (FPI) est une pathologie pulmonaire chronique, progressive, irréversible et mortelle, dont les thérapeutiques sont insuffisantes à ce jour. L'activation de la cascade de la coagulation et des protéases à sérine, délétère dans la progression des maladies pulmonaires chroniques, est une caractéristique de la pathologie. Récemment, un lien a été démontré entre Protease-Activated Receptor-2 (PAR-2), un récepteur cellulaire ubiquitaire, et la progression de la fibrose pulmonaire chez l'homme et la souris. Outre certains facteurs de la coagulation, PAR-2 semble aussi pouvoir être activé par des protéases appartenant à la famille récemment identifiée des Type II Transmembrane Serine Proteases (TTSPs), dont la matriptase et la Human Airway Trypsin-like protease (HAT). Leur rôle dans la fibrogénèse pulmonaire humaine et expérimentale est cependant encore inconnu.Nos travaux montrent pour la première fois qu'il existe une dérégulation de l'expression et de l'activité de ces protéases de la famille des TTSPs chez le patient FPI. In vitro, la matriptase induit des réponses pro-fibrosantes dans les fibroblastes pulmonaires primaires humains via l'activation de PAR-2, tandis que la HAT induit des réponses anti-fibrosantes dans ces cellules et une activation de la voie de la prostaglandine E2. Ces deux TTSPs sont ainsi différemment impliquées dans la fibrogénèse pulmonaire : in vivo, l'inhibition génétique et pharmacologique de la matriptase atténue la fibrose dans le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, et des résultats similaires sont observés suite à la surexpression de la HAT médiée par adénovirus dans ce modèle animal. L'ensemble des résultats obtenus dans ce travail de thèse permet de documenter l'implication de deux protéases à sérine, la matriptase et la HAT, dans la pathogénèse de la FPI et de définir des axes de recherche thérapeutique potentiels / Idiopathie Pulmonary Fibrosis (IPF) is a chronic, progressive, irreversible and mortal disease. Therapeutics options that improve the clinical outcome of IPF are limited. Coagulation proteinases and coagulation signaling deregulation, which influences several key inflammatory and fibroproliferative responses, is essential in IPF. Recently, Protease-Activated Receptor-2 (PAR-2) was shown to be involved in pulmonary fibrogenesis, both in Human and in mice. In addition to coagulation factors, PAR-2 can be activated by serine proteases of the emerging Type II Transmembrane Serine Proteases (TTSPs) family, including matriptase and the Human Airway Trypsin-like protease (HAT). Herein we explored the role of matriptase and HAT in the progression of human and experimental pulmonary fibrosis.Our data show that TTSPs matriptase and HAT pulmonary expression and activity are deregulated in patients with IPF. In vitro, matriptase induces PAR-2 dependent pro-fibrotic responses in primary human lung fibroblasts, whereas HAT induces anti-fibrotic effects in these cells, through the activation of prostaglandin E2 pathway. These TTSPs are differently involved in pulmonary fibrogenesis: in vivo, genetic and pharmacological inhibition of matriptase reduces fibrosis in the bleomycin induced lung fibrosis model, while an adenovirus-mediated HAT overexpression in the murine model leads also to a limited lung fibrosis. Here, we highlight the involvement of matriptase and HAT in the pathogenesis of IPF and explore potential therapeutics for lung fibrosis
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Génomique et post-génomique du parasite intestinal Blastocystis sp. sous-type 7. Evaluation de son pouvoir pathogèneWawrzyniak, Ivan, Wawrzyniak, Ivan 03 February 2012 (has links) (PDF)
Blastocystis spp. est un Straménopile parasite anaérobie fréquemment rencontré dans le tractus gastro-intestinal de l'homme et de divers animaux. Ce parasite est associé à des troubles gastro‐intestinaux aspécifiques, et semble impliqué dans des désordres fonctionnels tels que le syndrome de l'intestin irritable (IBS). Ce travail de thèse s'appuie sur le séquençage du génome de Blastocystis sp. ST7 réalisé en collaboration avec le Génoscope d'Evry, l'Université Nationale de Singapour, l'Institut Pasteur de Lille et l'Université de Provence. Ce génome est constitué d'un génome nucléaire de 18,8 Mpb pour 6020 gènes, et d'un génome mitochondrial de 29 kpb localisé dans des organites apparentés aux mitochondries. L'analyse de ce génome apporte des informations au niveau de l'évolution de ce microorganisme, de son adaptation à l'environnement intestinal et de ces facteurs de virulence potentiels. En effet, les analyses in silico de ce génome ont montré que Blastocystis sp. ST7 possède plusieurs gènes codant des protéines pouvant agir à l'interface entre l'hôte et le parasite et connues chez d'autres protozoaires pour être impliquées dans des phénomènes de pathogénie. Ce sont en particulier des PKS, des NRPS, et des hydrolases dont des protéases. D'autre part, des activités protéolytiques ont été mises en évidence expérimentalement dans les surnageants de culture du parasite. Deux protéases à cystéines (une cathepsine B et une légumaïne) pouvant être impliquées dans la physiopathologie du parasite, ont été identifiées et caractérisées dans les surnageants, confirmant ainsi nos analyses in silico. Ce travail ouvre de nombreuses pistes intéressantes à explorer pour évaluer l'impact de ce parasite en santé humaine.
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Développement d'une sonde fluorescente bioactivable pour l'étude du rôle in vitro et in vivo des protéases dégradant l’apolipoprotéine A-IMaafi, Foued 04 1900 (has links)
No description available.
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In vivo and in vitro directed evolution of enzymes using droplet-based microfluidics / Evolution dirigée d'enzymes in vivo et in vitro par microfluidique de gouttelettesGodina, Alexei 01 February 2013 (has links)
L’ingénierie des protéines fonctionnelles est un processus d’amélioration des propriétés physiques ou catalytiques d’enzyme au travers d’approches rationnelles et d'évolution dirigée, aussi bien que la combinaison des deux méthodes. Malgré le progrès de la modélisation moléculaire des protéines, les méthodes de prédiction restent aléatoires et un grand nombre de variantes restent à tester. De ce fait, le développement et l’utilisation d’un système de criblage d’activité de protéines à très haut débit, comme la microfluidique en gouttes, est indispensable. Cette thèse de doctorat présente trois projets d’évolution dirigée de protéines en trois approches différentes avec expression d’enzyme in vitro et in vivo. Les plateformes microfluidiques ont été développées et validées pour chaque projet. De plus, plusieurs banques de variants ont été criblées avec, dans certains cas, isolement de molécules 5-10 fois que le clone parental. / This work describes the development of high-throughput droplet microfluidic platforms fine-tuned for protein of interest and their employment in directed evolution experiments. When not available, fluorogenic assay for monitoring desired enzyme activity (-ies) in droplets was developed. Moreover, the in vivo expression allowed the successive integration of microfluidic modules on the same chip. After a couple of evolution rounds the initial retro-aldolase variant was significantly improved. In other project, to meet industrial requirements a high-throughput screening platform for protease evolution in detergent has been assembled and validated. Two evolution rounds showed the accumulation of a certain pool of beneficial mutations over the selection rounds. The research described in this work highlighted that in vitro expression systems are sensitive to the amount of supplied DNA and reaction conditions. This observation led to the development of a multistep completely in vitro microfluidic platform.
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Rôle des serpines, inhibiteurs de protéases à serine, du microbiote digestif humain dans les maladies inflammatoires de l'intestin / Involvement of the serpins, serine-protease inhibitors, from the human gut microbiota in inflammatory bowel diseasesMkaouar, Héla 25 June 2019 (has links)
Les inhibiteurs des protéases à sérine (Serpins) constituent une classe d'enzymes très peu étudiée chez les bactéries. Dans ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à l'étude des serpins provenant du microbiote intestinal et l'investigation de leur potentiel anti-inflammatoire pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) chez l'homme. Pour cela nous avons identifié les serpins provenant du microbiote intestinal humain et analysé leur diversité ainsi que leur distribution entre les individus malades et sains. Ces données nous ont permis d'isoler les serpins significativement associées aux MICI. La purification de quarte d'entre elles nous a amené à démontrer qu'elles inhibent les protéases humaines impliquées dans les MICI. L'analyse biochimique et cinétique approfondie de ces protéines a montré qu'elles possèdent des propriétés originales notamment leur efficacité d'inhibition élevée. L'étude de l'effet protecteur de trois serpins chez un modèle animal de colite a démontré pour la première fois l'efficacité des serpins in vivo démontrant ainsi leur potentiel thérapeutique. / Serine protease inhibitors (Serpins) are a class of proteins that reamin poorly studied in bacteria. In this thesis we are interested in the study of serpins originating from the intestinal microbiota and the investigation of their anti-inflammatory potential for the treatment of inflammatory bowel diseases (IBD) in humans. For this we have identified serpins from the human gut microbiota and analyzed their diversity as well as their distribution between healthy and IBD patients. These data allowed isolating serpins significantly associated with IBD. The purification of four of them led us to demonstrate that they inhibit human proteases involved in IBD. Biochemical and kinetic analysis of these proteins showed that they exhibit original properties, in particular their high inhibition efficiency. The study of the protective effect of three serpins in an animal model of colitis demonstrated for the first time the efficacy of serpins in vivo demonstrating thus their therapeutic potential.
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Fonction de la glycoprotéine Golgi apparatus protein 1 (GLG1) dans la différenciation des adipocytes et l'effet de la forme de type sauvage et la forme tronquée de GLG1 sur le métabolisme des lipidesKatbe, Alisar 08 1900 (has links)
Golgi apparatus protein 1 (GLG1) est une protéine transmembranaire de 160 kDa
qui interagit avec l’apolipoprotéine B100 (apoB100), le récepteur des lipoprotéines de
basse densité (LDLR) et la proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9).
Cependant, son mécanisme d’action et sa régulation post-traductionnelle sont inconnus.
Des études ont montré que GLG1 subit deux clivages résultant en fragments solubles
secrétés de 150 kDa et 55 kDa. Dans cette étude, notre premier objectif est d’identifier les
enzymes responsables de la protéolyse de GLG1 ainsi que l’effet du clivage sur sa fonction
dans le métabolisme des lipides. De plus, les résultats de nos collaborateurs montrent que
les souris adultes déficientes en GLG1 ont un plus grand nombre d’adipocytes mais de
taille plus petite que les souris de type sauvage. Notre deuxième objectif est de mesurer la
variation de l’expression ainsi qu’identifier l’effet de GLG1 lors de la différentiation des
fibroblastes en adipocytes. Pour le premier objectif, les cellules HEK293T surexprimant
GLG1 ont été soit transfectées avec des convertases de proprotéines (PCSK) soit incubées
avec différents inhibiteurs d’enzymes. Les milieux et les lysats cellulaires ont été analysés
par immunobuvardage à la Western. Il n’y a pas eu de nouveaux fragments générés en
présence des PCSK. Cependant, en présence d’inhibiteurs des sérines protéases
apparentées à la trypsine soit AEBSF et Gabexate mesylate, il y a eu une réduction de la
formation du fragment de 55 kDa. Pour identifier la métalloprotéase responsable du clivage
de l’ectodomaine générant le fragment de 150 kDa, GLG1 a été transfectée avec les Tissue
Inhibitor of Metalloproteinase (TIMP 1-4). Nos résultats ont montré que TIMP3 empêche
la relâche de l’ectodomaine de GLG1 dans le milieu de culture. Finalement, nos analyses
de plasma de souris par immunobuvardage à la Western ont montré la présence des
fragments de 150 kDa et 55 kDa de GLG1 in vivo. Pour le deuxième objectif de l’étude,
les fibroblastes préadipocytaires de souris 3T3-L1 ont été différenciés en adipocytes. Des
lysats cellulaires et l’isolation d’ARN ont été effectués aux jours 0, 2, 4, 6, 8 et 10 de la
différenciation. Des immunobuvardages à la Western ainsi que des RT-qPCR ont été
réalisés pour analyser l’expression de GLG1 au cours de la différenciation. Nos résultats
ont montré que l’expression de GLG1 augmente durant la différenciation. Bref, nos
résultats démontrent que des enzymes trypsin-like clivent GLG1 et génèrent le fragment
de 55 kDa. L’inhibition du clivage de l’ectodomaine de GLG1 par TIMP3 suggère que les
ADAMs sont impliquées dans la relâche du fragment de 150 kDa. De plus, nous avons
montré que l’expression de GLG1 augmente au cours de la différenciation adipocytaire. / Golgi apparatus protein 1 (GLG1) is a 160 kDa transmembrane protein interacting
with apolipoprotein B100 (apoB100), low-density lipoprotein receptor (LDLR) and
proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). However, the protein’s posttranslational
regulation and mechanism of action are poorly understood. Previous studies
showed that GLG1 is cleaved resulting in two fragments of 150 kDa and 55 kDa secreted
at the cell surface and in the extracellular matrix. The first objective of this study is to
identify enzymes responsible for GLG1 proteolysis and the effect of cleavage on its
function in lipid metabolism. Furthermore, our collaborators showed that mice with GLG1
knockout have a higher number of adipocytes, but those cells are smaller in size compared
to those in wild type mice. Therefore, the second objective of the study is to measure the
variation of GLG1 expression during adipocytes differentiation and to identify the effects
of GLG1 knockout on adipocytes differentiation. For the first objective, HEK293T cells
overexpressing GLG1 were either transfected with basic amino acid-specific proprotein
convertases (PCSK) or treated with enzyme inhibitors. Media and cell lysates were
analyzed by Western blot. No new fragments were detected in media of PCSK-transfected
cells. Cell treatment with trypsin-like serine proteases inhibitors, AEBSF and Gabexate
mesylate, reduced the secretion of the 55 kDa fragment. To identify the metalloproteinase
responsible for GLG1 shedding, GLG1 was co-transfected with Tissue Inhibitors of
Metalloproteinase (TIMP1-4). Our results showed that TIMP3 inhibits shedding of the 150
kDa fragment. Finally, wild-type mouse plasma was analyzed by Western blot and showed
the presence of both fragments in vivo. For the second objective of the study, fibroblasts
3T3-L1 cells were differentiated into adipocytes and GLG1 mRNA and protein expression
were measured at day 0, 2, 4, 6, 8 and 10 by qPCR and Western Blot. Our results showed
that GLG1 expression increased during differentiation and a peak was observed at day 4.
To conclude, in the first objective of our study, our results showed that trypsin-like
enzymes cleave GLG1 and produce a 55 kDa fragment. Shedding of GLG1 is inhibited by
TIMP3, which suggests that ADAM10 or ADAM17 are involved in the release of the 150
kDa fragment. In addition, both 55 kDa and 150 kDa fragments were found in normal
mouse plasma supporting the relevance of our findings in vivo. In the second objective of
our study, GLG1 expression increased during adipocyte differentiation suggesting a role
in adipose tissue development and/or morphology. In conclusion, our study will help
elucidate how proteolysis of GLG1 impacts its role in the regulation of apoB and PCSK9
secretion and lipid metabolism and how can GLG1 expression affect adipocytes
differentiation.
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