Une approche de métagénomique fonctionnelle a été mise en œuvre afin d’étudier les arsenaux enzymatiques produits par les microbiotes intestinaux de termites phytophages et d’identifier de nouvelles enzymes impliquées dans l’hydrolyse des polysaccharides végétaux, notamment des hétéroxylanes. Le criblage à haut débit des banques métagénomiques constituées à partir de trois espèces de termites sur une gamme de substrats chromogéniques a permis d’identifier plusieurs centaines de clones à activité dépolymérisante (glucanase, xylanase, mannanase, arabinanase), ainsi que des clones exprimant des activités auxiliaires (α-L-arabinofuranosidases, β-D-xylosidases, cellobiose hydrolases). Un total de 42 clones métagénomiques a été séquencé, générant 1,5 Mpb d’ADN assemblé en 58 séquences contigües d’une taille moyenne de 37,8 Kbp. 63 nouvelles Glycoside Hydrolases (GH) ont été identifiées. Ces dernières représentent 19 familles de la classification CAZy, dont les familles GH3, GH8, GH10, GH11, GH43 et GH51. Enfin, huit nouvelles enzymes des familles GH43 et GH51 ont été produites chez E. coli et leurs propriétés biochimiques ont été étudiées. Ces enzymes présentent des activités α-L-arabinofuranosidase, β-D-xylosidase ou L-arabinanase / A functional metagenomics approach was used to reveal the enzymatic diversity present in the guts of biomass-feeding termites and to identify enzymes involved in the degradation of biomass components, notably heteroxylans. High-throughput screening of metagenomic libraries, created using three different termite species, was performed using a variety of chromogenic substrates. This allowed the discovery of hundreds of clones expressing targeted biomass-degrading activities (e.g. depolymerases such as glucanase, xylanase, mannanase arabinanase and auxiliary activities such as α-L-arabinofuranosidases, β-D-xylosidases and cellobiohydrolases). A total of 42 clones were selected for a DNA sequence analysis, thus generating 1.5 Mbp that were assembled into 58 contiguous sequences. 63 new Glycoside Hydrolases (GH) belonging to 19 different families of the CAZy classification were identified, including ones from families GH3, GH8, GH10, GH11, GH43 and GH51. Finally, eight new enzymes, from families GH43 and GH51, were produced in E. coli and their biochemical properties were studied. These enzymes display α-L-arabinofuranosidase, β-D-xylosidase or arabinanase activities

La paroi végétale est une structure complexe composée principalement de polysaccharides (cellulose, hémicellulose et pectine), de lignine et de protéines. Elle est impliquée dans de nombreuses fonctions essentielles à la vie de la cellule végétale. De plus, les constituants de cette paroi, que sont les polysaccharides et la lignine, représentent la plus grande source de carbone renouvelable de la planète. Ceci en fait des cibles de choix notamment pour la production d'énergies « vertes ». Toutefois, l'utilisation des polysaccharides tels que les hémicelluloses constituant la paroi végétale reste, à l'heure actuelle, limitée du fait de la difficulté à les dégrader. Ces dernières années, un effort important a été mis en œuvre pour identifier et caractériser de nouvelles enzymes, telles que les glycosides hydrolases, permettant de dégrader efficacement la biomasse végétale. Dans le but de découvrir de nouvelles enzymes impliquées dans la dégradation de la biomasse végétale, des chercheurs de l'équipe « Catalyse et Ingénierie Moléculaire Enzymatiques » du LISBP ont décidé d'explorer le métagénome d'organismes connus pour dégrader la biomasse végétale. Deux espèces animales ont fait l'objet d'analyses : tout d'abord les termites qui sont considérés comme les champions de la dégradation de la biomasse végétales et souvent comparés à des bioréacteurs, et le ver de terre. Des banques métagénomiques de trois espèces différentes de termites ainsi qu'une banque métagénomique de ver de terre ont ainsi été créées. Dans ces travaux de thèse deux des banques métagénomiques de termites, celle de Nasutitermes corniger et celle de Termes hispaniolae, ont fait l'objet d'une étude afin de comparer le potentiel hémicellulolytique de ces deux espèces. Après sélection de nombreux clones positifs sur substrats chromogéniques de chacune des deux banques, séquençage puis annotation taxonomique et fonctionnelle, un grand nombre d'enzymes et principalement des glycosides hydrolases, a pu être identifié. Les résultats montrent que le métagénome de Nasutitermes corniger présente majoritairement des enzymes à activité endoglycosidase alors que le métagenome de Termes hispaniolae possède plutôt des enzymes à activité exoglycosidase. Toutes les activités trouvées dans chacune des espèces de termite sont en bonne corrélation avec l'alimentation du termite. De plus, nous avons observé que le microbiote intestinal des deux termites ne possèdent pas les mêmes embranchements bactériens majoritaires et nous avons pu voir que le microbiote de Termes hispaniolae est plus diversifié ce qui corrèle aussi avec l'alimentation des deux termites. D'autre part, dans la banque métagénomique du ver de terre, l'annotation fonctionnelle a révélé une enzyme intéressante. Il s'agit d'une enzyme annotée par B. Henrissat (responsable de la base de données CAZy) comme étant une glycoside hydrolase putative mais n'appartenant à aucune des 135 familles de glycosides hydrolases existantes. Cette enzyme putative, appelée GH* présente des similitudes avec les GH de la famille 5 sans pour autant appartenir à cette famille du fait notamment de l'absence du résidu catalytique nucléophile conservé. Une étude structurale et fonctionnelle de GH* a donc été menée. Les expériences ont permis de prouver que GH* est une endo-xylanase ayant une préférence pour les arabinoxylanes et les xylooligosaccharides de degré de polymérisation d'au moins 5 ou 6. La structure tridimensionnelle de GH* à 1,6Å de résolution a été obtenue par cristallographie des rayons X par remplacement moléculaire à l'aide d'une GH5. Cette structure a permis de confirmer l'identité du résidu acide/base identifié par alignement de séquences et d'émettre une hypothèse sur l'identité du résidu nucléophile. Enfin des mutants de GH* pour ces deux résidus ont été obtenus et ont confirmé leur implication dans l'activité de l'enzyme. / Plant cell wall is a complex structure surrounding plant cells mainly composed by polysaccharides (cellulose, hemicellulose and pectin), lignin and proteins. The plant wall maintains and imposes the size and shape of cells. It is also important for exchanges between cells and extra cellular medium. The polysaccharides of this cell wall are the largest renewable carbon source on the earth, which makes them good targets to produce green energies. Because plant cell wall is difficult to degrade, its use for biofuels for is still limited. However, some organisms are able to efficiently degrade this biomass. Exploring the diversity of the living word to discover new effective biocatalysts has grown considerably last years, because of the emergence of metagenomics. In this context and to discover new enzymes involved in the degradation of plant biomass, the team « Catalyse et Ingénierie Moléculaire Enzymatiques » of LISBP decided to explore metagenome of organisms known to degrade plant biomass. Two animal families were chosen for metagenomics analysis, the termite and earthworm. Metagenomics banks of three different species of termite and one metagenomics bank of an earthworm were created. In this thesis project, two of the three metagenomics banks of termites, the one from Nasutitermes corniger and the other one from Termes hispaniolae, were studied to compare the hemicellulolytic potential of these two species. After selection of many positive clones on chromogenic substrates of both banks, sequencing, taxonomic and functional annotations, a large number of enzymes and mainly glycoside hydrolases, could be identified. The results obtained shown that the trends observed during functional screens were maintained. Indeed, it appears that Nasutitermes corniger has a majority of endoglycosidases while Termes hispaniolae has mainly exoglycosidases. Thereby, families of enzymes highlighted allowed correlating their hydrolytic activities with the diet of these species. Furthermore, we observed that the intestinal microbiota of each termite is different. Indeed, both termites do not have the same majority bacterial phyla and the microbiota of Termes hispaniolae is more diverse than the one of Nasutitermes corniger. On the other hand, functional annotation of the metagenomics bank of the earthworm revealed an enzyme annotated as a glycoside hydrolase no belonging to any of the 135 glycoside hydrolase existing families. This enzyme, named GH*, seems to be close to GH5 but does not shown the nucleophilic catalyst residue perfectly conserved in this glycoside hydrolase family. A functional and structural study of GH* was then done. We have shown that GH* is an endo-xylanase which prefers arabinoxylans and xylooligosaccharides having a polymerization degree greater than 5. In addition, we determined the crystal structure of GH* at 1.6Å resolution. This 3D structure has confirmed the presence of the acid/base residue identified by sequence alignment and allowed us to hypothesize about the identity of the nucleophilic residue. Finally, mutants of GH* for these two residues were obtained and confirmed their involvement in the activity of the enzyme. We were able to progress in the understanding of structure/function relationships of this protein.

Les inhibiteurs des protéases à sérine (Serpins) constituent une classe d'enzymes très peu étudiée chez les bactéries. Dans ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à l'étude des serpins provenant du microbiote intestinal et l'investigation de leur potentiel anti-inflammatoire pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) chez l'homme. Pour cela nous avons identifié les serpins provenant du microbiote intestinal humain et analysé leur diversité ainsi que leur distribution entre les individus malades et sains. Ces données nous ont permis d'isoler les serpins significativement associées aux MICI. La purification de quarte d'entre elles nous a amené à démontrer qu'elles inhibent les protéases humaines impliquées dans les MICI. L'analyse biochimique et cinétique approfondie de ces protéines a montré qu'elles possèdent des propriétés originales notamment leur efficacité d'inhibition élevée. L'étude de l'effet protecteur de trois serpins chez un modèle animal de colite a démontré pour la première fois l'efficacité des serpins in vivo démontrant ainsi leur potentiel thérapeutique. / Serine protease inhibitors (Serpins) are a class of proteins that reamin poorly studied in bacteria. In this thesis we are interested in the study of serpins originating from the intestinal microbiota and the investigation of their anti-inflammatory potential for the treatment of inflammatory bowel diseases (IBD) in humans. For this we have identified serpins from the human gut microbiota and analyzed their diversity as well as their distribution between healthy and IBD patients. These data allowed isolating serpins significantly associated with IBD. The purification of four of them led us to demonstrate that they inhibit human proteases involved in IBD. Biochemical and kinetic analysis of these proteins showed that they exhibit original properties, in particular their high inhibition efficiency. The study of the protective effect of three serpins in an animal model of colitis demonstrated for the first time the efficacy of serpins in vivo demonstrating thus their therapeutic potential.