La Fibrose Pulmonaire Idiopathique (FPI) est une pathologie pulmonaire chronique, progressive, irréversible et mortelle, dont les thérapeutiques sont insuffisantes à ce jour. L'activation de la cascade de la coagulation et des protéases à sérine, délétère dans la progression des maladies pulmonaires chroniques, est une caractéristique de la pathologie. Récemment, un lien a été démontré entre Protease-Activated Receptor-2 (PAR-2), un récepteur cellulaire ubiquitaire, et la progression de la fibrose pulmonaire chez l'homme et la souris. Outre certains facteurs de la coagulation, PAR-2 semble aussi pouvoir être activé par des protéases appartenant à la famille récemment identifiée des Type II Transmembrane Serine Proteases (TTSPs), dont la matriptase et la Human Airway Trypsin-like protease (HAT). Leur rôle dans la fibrogénèse pulmonaire humaine et expérimentale est cependant encore inconnu.Nos travaux montrent pour la première fois qu'il existe une dérégulation de l'expression et de l'activité de ces protéases de la famille des TTSPs chez le patient FPI. In vitro, la matriptase induit des réponses pro-fibrosantes dans les fibroblastes pulmonaires primaires humains via l'activation de PAR-2, tandis que la HAT induit des réponses anti-fibrosantes dans ces cellules et une activation de la voie de la prostaglandine E2. Ces deux TTSPs sont ainsi différemment impliquées dans la fibrogénèse pulmonaire : in vivo, l'inhibition génétique et pharmacologique de la matriptase atténue la fibrose dans le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, et des résultats similaires sont observés suite à la surexpression de la HAT médiée par adénovirus dans ce modèle animal. L'ensemble des résultats obtenus dans ce travail de thèse permet de documenter l'implication de deux protéases à sérine, la matriptase et la HAT, dans la pathogénèse de la FPI et de définir des axes de recherche thérapeutique potentiels / Idiopathie Pulmonary Fibrosis (IPF) is a chronic, progressive, irreversible and mortal disease. Therapeutics options that improve the clinical outcome of IPF are limited. Coagulation proteinases and coagulation signaling deregulation, which influences several key inflammatory and fibroproliferative responses, is essential in IPF. Recently, Protease-Activated Receptor-2 (PAR-2) was shown to be involved in pulmonary fibrogenesis, both in Human and in mice. In addition to coagulation factors, PAR-2 can be activated by serine proteases of the emerging Type II Transmembrane Serine Proteases (TTSPs) family, including matriptase and the Human Airway Trypsin-like protease (HAT). Herein we explored the role of matriptase and HAT in the progression of human and experimental pulmonary fibrosis.Our data show that TTSPs matriptase and HAT pulmonary expression and activity are deregulated in patients with IPF. In vitro, matriptase induces PAR-2 dependent pro-fibrotic responses in primary human lung fibroblasts, whereas HAT induces anti-fibrotic effects in these cells, through the activation of prostaglandin E2 pathway. These TTSPs are differently involved in pulmonary fibrogenesis: in vivo, genetic and pharmacological inhibition of matriptase reduces fibrosis in the bleomycin induced lung fibrosis model, while an adenovirus-mediated HAT overexpression in the murine model leads also to a limited lung fibrosis. Here, we highlight the involvement of matriptase and HAT in the pathogenesis of IPF and explore potential therapeutics for lung fibrosis

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29 / O Aedes aegypti é o vetor mais importante de arboviroses humana sendo responsável pelas transmissões de dengue e febre amarela urbana. As enzimas tipo tripsina apresentam um importante papel na digestão de estádios de vida larval e adulto de Ae. aegypti. No presente trabalho, nós identificamos as duas enzimas tipo tripsina majoritárias do intestino médio larval através da construção de uma biblioteca de fragmentos de cDNA de tripsina. Elas são AAEL005607 e AAEL006371, com frequências de expressão de 29,3% e 20%, respectivamente. Análises por PCR semi-quantitativo mostraram que a tripsina AAEL005607 foi transcrita em todos os instars larval, mas a tripsina AAEL006371 apareceu somente nos 3º e 4º instar larvais. A fim de confirmar os dados de transcrição, enzimas tipo tripsina do intestino médio de larvas de 4º instar foram purificadas por cromatografias de afinidade, troca iônica e fase reversa. A tripsina purificada apresentou massa molecular de 28 kDa por SDS-PAGE. Sua sequência de aminoácidos parcial nos permitiu sugerir que a atividade de tripsina é codificada pela sequência AAEL005607. A tripsina purificada (AAEL005607) exibiu um valor de Km de 36,4 μM para o substrato Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa e foi fortemente inibida por AaTI e HiTI, ambos inibidores de tripsina, com valores de Ki de 0,94 pM e 160 pM, respectivamente. Em conclusão, pela primeira vez, a enzima digestiva majoritária de 4º instar larval de Ae. aegypti foi purificada e caracterizada. / Aedes aegypti is the most important vector of human arboviral diseases and it is responsible for dengue and urban yellow fever transmissions. Trypsin-like enzymes plays an important role in the Ae. aegypti adult and larval life stages digestion. In the present work, we identified the two major trypsin-like enzymes of Ae. aegypti larval midgut through the trypsin cDNA fragments library construction. They are AAEL005607 and AAEL006371, with expression frequencies of 29.3% and 20%, respectively. Semi quantitative PCR analysis showed that the AAEL005607 was transcripted in all larval instars, but AAEL006371 appeared only in 3rd and 4th larval instars. In order to confirm the transcription data, trypsin-like enzymes from 4th instar larvae of Ae. aegypti midgut were purified by affinity, ionic exchange and reversedphase chromatographies. Purified trypsin presented molecular mass of 28 kDa by SDS-PAGE. Its partial amino acid sequence allowed us to suggest that the trypsin activity is encoding by AAEL005607 sequence. The purified trypsin (AAEL005607) showed Km value of 36.4 μM for Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa substrate and was strongly inhibited by AaTI and HiTI, both trypsin inhibitors, with Ki of 0.94 pM and 160 pM, respectively. In conclusion, for the first time, the major digestive enzyme of 4th larval instar of Ae. aegypti was identified and characterized. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

La fibrose kystique (FK) est caractérisée par une inflammation pulmonaire chronique. Cette dernière est définie entre autres par une augmentation importante de la production de mucus. Celui-ci s'accumule dans les bronches empêchant ainsi l'éventuel passage de l'air. De plus, le mucus forme une barrière protectrice pour les bactéries qui va causer l'inflammation des poumons. La protéase human airway trypsin-like (HAT) a été retrouvée dans les expectorations de patients atteints d'asthme et bronchite chronique, pathologies similaires à la FK. Elle semble jouer un rôle dans l'inflammation car elle augmente entre autres la production de MUC5AC, protéine composant majoritairement le mucus. Le but de cette étude était de synthétiser la HAT dans une conformation active dans un système eucaryote pour étudier ses propriétés biochimiques, enzymatiques ainsi que son potentiel pro-inflammatoire dans la lignée cellulaire pulmonaire Calu-3. L'ADNc codant pour la partie soluble de la HAT a été inséré dans le vecteur pMT-BiP V5-His. Cet ADN recombinant fut ensuite transfecté dans les cellules de Drosophile Schneider 2 (S2). La HAT recombinante a par la suite été purifiée et son activité protéolytique testée avec un substrat fluorogénique. Ses propriétés biochimiques et enzymatiques ont été étudiées ainsi que son effet sur la production d'IL-8 et sa détection dans les expectorations de patients. La HAT purifiée était «enzymatiquement» pure, donc l'effet protéolytique observé avec le substrat fluorogénique est dû à la protéase. Les analyses de ses propriétés biochimiques montrent que l'activité protéolytique de la HAT est inhibée par un pH acide (<6.5), certains inhibiteurs synthétiques (l'aprotinine, la leupeptine et le PEFABLOC) et endogène (i.e: alpha-2 anti-plasmine (a2-AP)) de protéases à sérine. D'un autre côté, les essais enzymatiques révèlent que la HAT a une préférence pour les substrats ayant une arginine en P4, P3 et Pl plutôt que ceux ayant un glutamate en P4, P2 et P1'. Finalement, l'étude sur l'implication physiologique de l'enzyme démontre que la protéase ne semble pas avoir d'effet ou au plus peu d'effet sur la production d' IL-8. [Symboles non conformes]

Golgi apparatus protein 1 (GLG1) est une protéine transmembranaire de 160 kDa qui interagit avec l’apolipoprotéine B100 (apoB100), le récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR) et la proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). Cependant, son mécanisme d’action et sa régulation post-traductionnelle sont inconnus. Des études ont montré que GLG1 subit deux clivages résultant en fragments solubles secrétés de 150 kDa et 55 kDa. Dans cette étude, notre premier objectif est d’identifier les enzymes responsables de la protéolyse de GLG1 ainsi que l’effet du clivage sur sa fonction dans le métabolisme des lipides. De plus, les résultats de nos collaborateurs montrent que les souris adultes déficientes en GLG1 ont un plus grand nombre d’adipocytes mais de taille plus petite que les souris de type sauvage. Notre deuxième objectif est de mesurer la variation de l’expression ainsi qu’identifier l’effet de GLG1 lors de la différentiation des fibroblastes en adipocytes. Pour le premier objectif, les cellules HEK293T surexprimant GLG1 ont été soit transfectées avec des convertases de proprotéines (PCSK) soit incubées avec différents inhibiteurs d’enzymes. Les milieux et les lysats cellulaires ont été analysés par immunobuvardage à la Western. Il n’y a pas eu de nouveaux fragments générés en présence des PCSK. Cependant, en présence d’inhibiteurs des sérines protéases apparentées à la trypsine soit AEBSF et Gabexate mesylate, il y a eu une réduction de la formation du fragment de 55 kDa. Pour identifier la métalloprotéase responsable du clivage de l’ectodomaine générant le fragment de 150 kDa, GLG1 a été transfectée avec les Tissue Inhibitor of Metalloproteinase (TIMP 1-4). Nos résultats ont montré que TIMP3 empêche la relâche de l’ectodomaine de GLG1 dans le milieu de culture. Finalement, nos analyses de plasma de souris par immunobuvardage à la Western ont montré la présence des fragments de 150 kDa et 55 kDa de GLG1 in vivo. Pour le deuxième objectif de l’étude, les fibroblastes préadipocytaires de souris 3T3-L1 ont été différenciés en adipocytes. Des lysats cellulaires et l’isolation d’ARN ont été effectués aux jours 0, 2, 4, 6, 8 et 10 de la différenciation. Des immunobuvardages à la Western ainsi que des RT-qPCR ont été réalisés pour analyser l’expression de GLG1 au cours de la différenciation. Nos résultats ont montré que l’expression de GLG1 augmente durant la différenciation. Bref, nos résultats démontrent que des enzymes trypsin-like clivent GLG1 et génèrent le fragment de 55 kDa. L’inhibition du clivage de l’ectodomaine de GLG1 par TIMP3 suggère que les ADAMs sont impliquées dans la relâche du fragment de 150 kDa. De plus, nous avons montré que l’expression de GLG1 augmente au cours de la différenciation adipocytaire. / Golgi apparatus protein 1 (GLG1) is a 160 kDa transmembrane protein interacting with apolipoprotein B100 (apoB100), low-density lipoprotein receptor (LDLR) and proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). However, the protein’s posttranslational regulation and mechanism of action are poorly understood. Previous studies showed that GLG1 is cleaved resulting in two fragments of 150 kDa and 55 kDa secreted at the cell surface and in the extracellular matrix. The first objective of this study is to identify enzymes responsible for GLG1 proteolysis and the effect of cleavage on its function in lipid metabolism. Furthermore, our collaborators showed that mice with GLG1 knockout have a higher number of adipocytes, but those cells are smaller in size compared to those in wild type mice. Therefore, the second objective of the study is to measure the variation of GLG1 expression during adipocytes differentiation and to identify the effects of GLG1 knockout on adipocytes differentiation. For the first objective, HEK293T cells overexpressing GLG1 were either transfected with basic amino acid-specific proprotein convertases (PCSK) or treated with enzyme inhibitors. Media and cell lysates were analyzed by Western blot. No new fragments were detected in media of PCSK-transfected cells. Cell treatment with trypsin-like serine proteases inhibitors, AEBSF and Gabexate mesylate, reduced the secretion of the 55 kDa fragment. To identify the metalloproteinase responsible for GLG1 shedding, GLG1 was co-transfected with Tissue Inhibitors of Metalloproteinase (TIMP1-4). Our results showed that TIMP3 inhibits shedding of the 150 kDa fragment. Finally, wild-type mouse plasma was analyzed by Western blot and showed the presence of both fragments in vivo. For the second objective of the study, fibroblasts 3T3-L1 cells were differentiated into adipocytes and GLG1 mRNA and protein expression were measured at day 0, 2, 4, 6, 8 and 10 by qPCR and Western Blot. Our results showed that GLG1 expression increased during differentiation and a peak was observed at day 4. To conclude, in the first objective of our study, our results showed that trypsin-like enzymes cleave GLG1 and produce a 55 kDa fragment. Shedding of GLG1 is inhibited by TIMP3, which suggests that ADAM10 or ADAM17 are involved in the release of the 150 kDa fragment. In addition, both 55 kDa and 150 kDa fragments were found in normal mouse plasma supporting the relevance of our findings in vivo. In the second objective of our study, GLG1 expression increased during adipocyte differentiation suggesting a role in adipose tissue development and/or morphology. In conclusion, our study will help elucidate how proteolysis of GLG1 impacts its role in the regulation of apoB and PCSK9 secretion and lipid metabolism and how can GLG1 expression affect adipocytes differentiation.