L'hypercholestérolémie familiale autosomique dominante (ADH) est un trouble génétique caractérisé par des taux élevés de lipoprotéine de basse densité (LDL) plasmatique. Un niveau élevé de LDL plasmatique est connu pour contribuer au développement de l’athérosclérose, une cause majeure des crises cardiaques et des accidents vasculaires cérébraux. Le récepteur des LDL (LDLR) est la principale voie d’élimination des particules de LDL. En revanche, la proprotéine convertase subtilisine/kexine de type 9 (PCSK9), une glycoprotéine sécrétée par le foie, se lie au LDLR et augmente sa dégradation dans les lysosomes, ce qui entraîne une augmentation de LDL plasmatique et un risque plus élevé de maladie cardiovasculaire. En outre, des mutations de-perte-de fonction de PCSK9 peuvent considérablement réduire les niveaux de LDL plasmatiques et réduire le risque de maladie coronarienne jusqu'à ~ 88%. Toutes ces découvertes ont fait de PCSK9 une cible importante pour le traitement de l'hypercholestérolémie. Des anomalies génétiques du LDLR, de PCSK9 ou de l’apolipoprotéine B (apoB), le ligand du LDLR, peuvent provoquer l'ADH, mais dans certaines familles ADH il n'a pas été possible d'identifier de mutation de ces gènes, suggérant que d'autres anomalies génétiques pourraient également être impliquées dans la maladie. Dans la présente thèse, qui repose sur deux études (articles), nous avons étudié les protéines d’interaction de PCSK9 (premier article, chapitre 2) et l'effet de PCSK9 sur l'athérosclérose (deuxième article, chapitre 3). Dans notre première étude, l'analyse par spectrométrie de masse des protéines interagissant avec PCSK9 a révélé que la Golgi glycoprotéine 1 (GLG1) est une nouvelle protéine d’interaction de PCSK9. Leur co-immunoprécipitation révélée par immunobuvardage et leur co-localisation par microscopie confocale par immunofluorescence ont confirmé que GLG1 est un partenaire de PCSK9. De plus, nos résultats ont montré que GLG1 interagit aussi avec le LDLR et l'apoB. En utilisant un modèle murin, nous avons montré des taux sanguins plus faibles de PCSK9, de cholestérol et de triglycérides chez les souris knockdown GLG1. De plus, le déficit en GLG1 a réduit l'activité de la protéine de transfert des triglycérides microsomales (MTP) et induit l'agrégation périnucléaire de l'apoB, réduisant ainsi la sécrétion d'apoB. Dans notre deuxième étude, nous avons développé un modèle d'athérosclérose chez la souris pour étudier l'effet de l'absence de PCSK9 sur les plaques d’athérosclérose. Nous avons montré que la surexpression d'un mutant gain-de-fonction de PCSK9 dans le foie de souris a accéléré le développement de plaques d'athérosclérose dans la racine aortique et que celles-ci ont ensuite été réduites en induisant la régulation négative de PCSK9 en utilisant le système Tet-on. En conclusion, nous avons contribué à l'identification d'une nouvelle protéine interagissant avec PCSK9, GLG1, qui régule le taux plasmatique de cholestérol et représente une cible potentielle pour le traitement de l'hypercholestérolémie. Nous avons également démontré que la modulation du gène PCSK9 régule directement le niveau de plaques d'athérosclérose dans la racine de l'aorte. Ces études aideront à développer des thérapies efficaces pour réduire l'hypercholestérolémie et le risque de maladie cardiovasculaire / Autosomal dominant hypercholesterolemia (ADH) is a genetic disorder characterized by high plasma low-density lipoprotein (LDL) cholesterol levels. Elevated plasma LDL level is known to contribute to the development of atherosclerosis, a leading cause of heart attack and stroke. Liver LDL receptor (LDLR) acts as a primary pathway for endocytosis and clearance of LDL particles. In contrast, PCSK9, a liver-secreted glycoprotein, binds to LDLR and enhances its lysosomal degradation, resulting in increased plasma LDL concentrations and a higher risk of cardiovascular disease. Genetic defects in LDLR, PCSK9, and apolipoprotein B (apoB), the ligand of LDLR, can cause ADH, but in some ADH-families no mutations can be found in these genes, suggesting that other gene defects may also be involved in ADH. Furthermore, loss-of-function mutations in PCSK9 can greatly reduce plasma LDL levels and lower risk of coronary heart disease by up to ~88%. All these findings have made PCSK9 an attractive target for the treatment of hypercholesterolemia. In the present thesis, which is based on two studies (articles), we investigated protein interactors of PCSK9 (first article, chapter 2) and the effect of PCSK9 on atherosclerosis (Second article, chapter 3). In our first study, mass spectrometry analysis of PCSK9 interacting proteins revealed that Golgi glycoprotein 1 (GLG1) is a novel PCSK9 interactor. Co-immunoprecipitation, Western blotting, and colocalization by confocal immunofluorescence microscopy confirmed that GLG1 is an endogenous PCSK9 binding partner. We also demonstrated that LDLR and apoB interact with GLG1. Using a mouse model, we found lower levels of circulating PCSK9, cholesterol, and triglycerides in Glg1 knockdown mice. Moreover, GLG1 deficiency reduced microsomal triglyceride transfer protein (MTP) activity and induced perinuclear aggregation of apoB, thereby, reducing apoB secretion. In our second study, we developed a mouse model of atherosclerosis to investigate the effect of PCSK9 modulation on the regression of atherosclerotic plaques. We showed that overexpression of a PCSK9 gain-of-function in mouse liver accelerated the development of atherosclerotic lesions in the aortic root, which were then reduced by inducing PCSK9 downregulation using a Tet-on system. In conclusion, we have contributed to the identification of a novel PCSK9 interacting protein, GLG1, which regulates plasma level of cholesterol and represents a potential target for hypercholesterolemia treatment. We also demonstrated that PCSK9 gene modulation directly regulates the level of atherosclerotic plaques in the aortic root. We showed in our study that the wild-type mice, overexpressing PCSK9-D377Y in an inducible manner, is a useful mouse model for understanding the molecular role of PCSK9 on atherosclerotic plaques development. These studies will help to develop effective therapies to reduce hypercholesterolemia and the risk of cardiovascular disease.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) constituent la première cause de mortalité dans le monde. Des efforts significatifs ont été menés pour améliorer la prévention des MCV et ont abouti à une réduction du taux de mortalité. Cependant, un ralentissement considérable du taux de réduction des MCV a été observé à partir de 2011 malgré les nouvelles avancées thérapeutiques. Ces taux alarmants justifient le besoin de découvrir de nouvelles thérapies afin d’améliorer la prévention des MCV dans la population générale. Des taux élevés de cholestérol total et transporté par les lipoprotéines de basse densité (LDL) sont fortement liés aux MCV athérosclérotiques. Ainsi, les thérapies hypolipémiantes sont les thérapies les plus utilisées pour prévenir les MCV. Nos résultats antérieurs ont identifié Golgi glycoprotein 1 (GLG1) comme étant une nouvelle protéine impliquée dans le métabolisme lipidique. Par conséquent, notre étude actuelle vise à démontrer l'effet de GLG1 sur le développement de l'athérosclérose. Pour étudier cet effet, nous avons réduit l'expression de GLG1 (silençage génique ou knockdown) dans le foie de souris hypercholestérolémiques Apoe-/- en utilisant un virus adéno-associé de type 8 (AAV8) véhiculant un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) ciblant GLG1. Deux semaines post-injection, les souris ont été nourries par un régime occidental pendant 12 semaines. L'étude a révélé que le knockdown de GLG1 réduit significativement les taux plasmatiques de cholestérol total, de lipoprotéines de très basse densité (VLDL), de LDL et diminue les lésions athérosclérotiques au niveau du sinus aortique. Cependant, nos résultats ont démontré que le knockdown de GLG1 à l’aide du système AAV8 n'était pas stable pendant toute l'étude, le rendant inefficace au-delà de 2 mois. En résumé, nos résultats montrent que le knockdown de GLG1 réduit les taux de cholestérol plasmatique ainsi que la progression de l'athérosclérose chez les souris Apoe-/-. Cette réduction s'est produite en dépit de la perte progressive du knockdown de GLG1 et est probablement liée à la réduction de la sécrétion d'apolipoprotéines B100. Ces résultats montrent que GLG1 est une cible thérapeutique prometteuse pour abaisser les taux de cholestérol plasmatique, en particulier les VLDL et LDL, et prévenir le développement de l'athérosclérose. / Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide. Significant efforts have been made to prevent CVD and have resulted in a reduced mortality rate. However, a considerable slowdown in the reduction rate of CVD has been observed starting in 2011 despite new therapeutic advances. These alarming rates justify the need to discover new therapies to improve the prevention of CVD in the general population. High levels of total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) are strongly linked to atherosclerotic cardiovascular diseases. Thus, lipid-lowering therapies are the most used therapies to prevent CVDs. Our previous study identified Golgi glycoprotein 1 (GLG1) as a new protein involved in lipid metabolism. Therefore, our current study aims to demonstrate the effect of GLG1 on the development of atherosclerosis. To study the effect of GLG1 on atherosclerosis, we reduced GLG1 expression in hypercholesterolemic Apoe-/- mice livers using an adeno-associated virus coding for a short hairpin RNA (shRNA) targeting GLG1 then 2 weeks post-injection mice were fed a Western diet for 12 weeks. The study revealed that GLG1 knockdown significantly reduced plasma total cholesterol levels, especially very low-density lipoprotein (VLDL)- and LDL-C, and atherosclerotic lesions in the aortic root. However, our results showed that AAV-mediated GLG1 knockdown was not stable during the entire study, making it ineffective in lowering plasma cholesterol levels beyond 2 months. In summary, our results show that lowering GLG1 expression reduces plasma cholesterol levels as well as atherosclerosis progression in Apoe-/- mice. Remarkably, the reduction in atherosclerosis occurred in spite of the gradual loss of GLG1 AAV-mediated knockdown and is likely related to the reduced apolipoptotein B100 secretion. These findings demonstrate that GLG1 is a promising therapeutic target for lowering plasma cholesterol levels, particularly VLDL- and LDL-C, and preventing atherosclerosis development.

Golgi apparatus protein 1 (GLG1) est une protéine transmembranaire de 160 kDa qui interagit avec l’apolipoprotéine B100 (apoB100), le récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR) et la proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). Cependant, son mécanisme d’action et sa régulation post-traductionnelle sont inconnus. Des études ont montré que GLG1 subit deux clivages résultant en fragments solubles secrétés de 150 kDa et 55 kDa. Dans cette étude, notre premier objectif est d’identifier les enzymes responsables de la protéolyse de GLG1 ainsi que l’effet du clivage sur sa fonction dans le métabolisme des lipides. De plus, les résultats de nos collaborateurs montrent que les souris adultes déficientes en GLG1 ont un plus grand nombre d’adipocytes mais de taille plus petite que les souris de type sauvage. Notre deuxième objectif est de mesurer la variation de l’expression ainsi qu’identifier l’effet de GLG1 lors de la différentiation des fibroblastes en adipocytes. Pour le premier objectif, les cellules HEK293T surexprimant GLG1 ont été soit transfectées avec des convertases de proprotéines (PCSK) soit incubées avec différents inhibiteurs d’enzymes. Les milieux et les lysats cellulaires ont été analysés par immunobuvardage à la Western. Il n’y a pas eu de nouveaux fragments générés en présence des PCSK. Cependant, en présence d’inhibiteurs des sérines protéases apparentées à la trypsine soit AEBSF et Gabexate mesylate, il y a eu une réduction de la formation du fragment de 55 kDa. Pour identifier la métalloprotéase responsable du clivage de l’ectodomaine générant le fragment de 150 kDa, GLG1 a été transfectée avec les Tissue Inhibitor of Metalloproteinase (TIMP 1-4). Nos résultats ont montré que TIMP3 empêche la relâche de l’ectodomaine de GLG1 dans le milieu de culture. Finalement, nos analyses de plasma de souris par immunobuvardage à la Western ont montré la présence des fragments de 150 kDa et 55 kDa de GLG1 in vivo. Pour le deuxième objectif de l’étude, les fibroblastes préadipocytaires de souris 3T3-L1 ont été différenciés en adipocytes. Des lysats cellulaires et l’isolation d’ARN ont été effectués aux jours 0, 2, 4, 6, 8 et 10 de la différenciation. Des immunobuvardages à la Western ainsi que des RT-qPCR ont été réalisés pour analyser l’expression de GLG1 au cours de la différenciation. Nos résultats ont montré que l’expression de GLG1 augmente durant la différenciation. Bref, nos résultats démontrent que des enzymes trypsin-like clivent GLG1 et génèrent le fragment de 55 kDa. L’inhibition du clivage de l’ectodomaine de GLG1 par TIMP3 suggère que les ADAMs sont impliquées dans la relâche du fragment de 150 kDa. De plus, nous avons montré que l’expression de GLG1 augmente au cours de la différenciation adipocytaire. / Golgi apparatus protein 1 (GLG1) is a 160 kDa transmembrane protein interacting with apolipoprotein B100 (apoB100), low-density lipoprotein receptor (LDLR) and proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). However, the protein’s posttranslational regulation and mechanism of action are poorly understood. Previous studies showed that GLG1 is cleaved resulting in two fragments of 150 kDa and 55 kDa secreted at the cell surface and in the extracellular matrix. The first objective of this study is to identify enzymes responsible for GLG1 proteolysis and the effect of cleavage on its function in lipid metabolism. Furthermore, our collaborators showed that mice with GLG1 knockout have a higher number of adipocytes, but those cells are smaller in size compared to those in wild type mice. Therefore, the second objective of the study is to measure the variation of GLG1 expression during adipocytes differentiation and to identify the effects of GLG1 knockout on adipocytes differentiation. For the first objective, HEK293T cells overexpressing GLG1 were either transfected with basic amino acid-specific proprotein convertases (PCSK) or treated with enzyme inhibitors. Media and cell lysates were analyzed by Western blot. No new fragments were detected in media of PCSK-transfected cells. Cell treatment with trypsin-like serine proteases inhibitors, AEBSF and Gabexate mesylate, reduced the secretion of the 55 kDa fragment. To identify the metalloproteinase responsible for GLG1 shedding, GLG1 was co-transfected with Tissue Inhibitors of Metalloproteinase (TIMP1-4). Our results showed that TIMP3 inhibits shedding of the 150 kDa fragment. Finally, wild-type mouse plasma was analyzed by Western blot and showed the presence of both fragments in vivo. For the second objective of the study, fibroblasts 3T3-L1 cells were differentiated into adipocytes and GLG1 mRNA and protein expression were measured at day 0, 2, 4, 6, 8 and 10 by qPCR and Western Blot. Our results showed that GLG1 expression increased during differentiation and a peak was observed at day 4. To conclude, in the first objective of our study, our results showed that trypsin-like enzymes cleave GLG1 and produce a 55 kDa fragment. Shedding of GLG1 is inhibited by TIMP3, which suggests that ADAM10 or ADAM17 are involved in the release of the 150 kDa fragment. In addition, both 55 kDa and 150 kDa fragments were found in normal mouse plasma supporting the relevance of our findings in vivo. In the second objective of our study, GLG1 expression increased during adipocyte differentiation suggesting a role in adipose tissue development and/or morphology. In conclusion, our study will help elucidate how proteolysis of GLG1 impacts its role in the regulation of apoB and PCSK9 secretion and lipid metabolism and how can GLG1 expression affect adipocytes differentiation.