Le virus de l’influenza infecte chaque année des millions d'humains ce qui a des impacts pour l’économie et entraîne le décès de nombreux individus. Le virus possède une grande capacité d'adaptation ce qui lui permet de revenir à chaque année sous forme de grippe saisonnière et occasionnellement de causer des pandémies dévastatrices. Cette capacité mutagène du virus est également la cause de résistance aux traitements pharmacologiques disponibles et encourage la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. L'activation de l’hémagglutinine du virus est une des cibles potentielles puisqu’elle permet la fusion de la protéine avec la membrane endosomale de l’hôte. La capacité de cliver l’hémagglutinine virale de certaines enzymes membres du groupe des protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP), particulièrement de la matriptase, a été explorée. Les résultats obtenus démontrent que la matriptase et plusieurs autres enzymes du groupe des TTSP sont exprimées dans l'épithélium bronchique humain. La matriptase et d'autres TTSP peuvent cliver des peptides correspondant aux séquences de clivage de l’hémagglutinine des virus de l’influenza présentement en circulation. Également, la matriptase clive de façon efficace des peptides correspondant aux séquences de clivage de l’hémagglutinine de virus de l’influenza aviaires hautement pathogéniques. En plus d'être efficace in vitro, l’enzyme possède aussi la capacité de cliver et d'activer de façon protéolytique l’hémagglutinine de virus H1N1 mais pas celle de virus H3N2 dans des modèles cellulaires d'épithélium bronchique. La microscopie confocale a également montré la colocalisation du virus de l’influenza avec la matriptase dans les endosomes lors de l’entrée du virus dans la cellule. L'utilisation de la technique d'ARN interférents contre la matriptase dans un modèle cellulaire a permis de réduire la réplication d'un virus H1N1 par 1,5 log. Le fort potentiel thérapeutique des inhibiteurs de protéases dans le traitement de l’influenza a aussi été démontré par l’utilisation de deux inhibiteurs sélectifs de la matriptase dans des modèles cellulaires d’infection. L'utilisation de l’inhibiteur IN-1 a permis de réduire de 50% la réplication d'un virus H1N1 à une concentration de 5,6 ?M. L'étude démontre donc que la matriptase est importante à la réplication des virus du sous-type HINI et que son inhibition permet une réduction significative de la charge virale ce qui ouvre la porte à de nouvelles possibilités de thérapies pour les cas sévères d'influenza.

L’hémochromatose est une maladie héréditaire caractérisée par une surcharge de fer dans l’organisme. Chez une personne saine, l’excès de fer est excrété au niveau des intestins, mais une personne souffrant d’hémochromatose accumule le fer au niveau de la circulation, du foie, du cœur, et également au niveau des autres organes. Ceci donne lieu à différents problèmes comme des maladies cardiaques et du foie, du diabète, de la fatigue chronique et également des douleurs articulaires. Deux traitements sont disponibles pour traiter l’hémochromatose. Le premier consiste à des saignées (phlébotomies) pouvant durer plusieurs mois (ou années) à des fréquences hebdomadaires. Il est également possible d’utiliser un agent chélatant du fer pour faciliter son élimination à l’extérieur de l’organisme. L’agent chélatant le plus utilisé est la déferoxamine (également connu sous le nom de desferrioxamine B) qui s’administre par injection sous-cutanée pendant plusieurs heures à une fréquence journalière. Ces deux traitements sont longs et très invasifs. C’est pourquoi notre groupe de recherche s’intéresse à la matriptase-2, une protéase à sérine transmembranaire de type II (TTSP), dont le rôle dans l’homéostasie du fer a préalablement été démontré. Dans une précédente étude, nous nous sommes intéressés à une autre TTSP, la matriptase. La matriptase est l’une des plus étudiées, notamment à cause de ses rôles dans le cancer,[indice supérieur 1–3] l’influenza[indice supérieur 4] et l’arthrose.[indice supérieur 5] Comme toutes les TTSP, la matriptase est synthétisée sous forme inactive (zymogène). Elle nécessite un premier clivage après l’acide aminé Gly[indice supérieur 149] et un second clivage autoprotéolytique après Arg[indice supérieur 614] pour libérer son domaine catalytique actif. Sa séquence d’autoactivation RQAR-VVGG a été le point de départ pour la synthèse du premier inhibiteur de la matriptase dans le laboratoire, soit RQAR. À ce peptide, un piège à sérine a été ajouté sous forme de cétobenzothiazole (Kbt).[indice supérieur 6] En 2014, après une étude de modélisation et plusieurs modifications en P4-P1, un inhibiteur sélectif et puissant sur la matriptase-2 a été obtenu, soit YYVR-Kbt.[indice supérieur 7] Le but de ma maîtrise était de remplacer les différents acides aminés aux positions P4, P3 et P2 sur YYVR-Kbt pour obtenir un inhibiteur encore plus puissant et plus sélectif pour la matriptase-2. Une librairie de 29 analogues a été produite dans le but de comprendre la relation structure-activité de cette classe d’inhibiteurs semi-peptidiques sur la matriptase-2. Pour ce faire, des acides aminés naturels et non-naturels ayant différentes fonctions (polaires, apolaires, aromatiques, etc.) ont été utilisés. Les composés ont été caractérisés selon leur constante d’inhibition (Ki) sur matriptase-2 et également sur matriptase. Les inhibiteurs les plus puissants ont été testés sur l’hepsine, une autre TTSP exprimée dans le foie, dans le but de comprendre la sélectivité pour matriptase-2. La sélectivité pour la matriptase-2 (vis-à-vis d’autres TTSP) est importante pour éviter de potentiels effets secondaires. Une recherche conformationnelle sur les composés synthétisés a été réalisée dans le but de comprendre les interactions importantes entre l’inhibiteur et les protéases. Les constantes cinétiques d’association/dissociation, le temps de résidence des trois meilleurs inhibiteurs ont été déterminés. La stabilité des meilleurs inhibiteurs dans du plasma de souris a été également testée. Cette étude a permis la rédaction d’un article scientifique intitulé « Modulating the Selectivity of Matriptase-2 Inhibitors with Unatural Amino Acids », soumis à l’European Journal of Medicinal Chemistry le 2 décembre 2016, qui est inclus dans ce mémoire.

Dans l’organisme, le fer assure le transport d’oxygène jusqu’à tous les organes, via l’hémoglobine des globules rouges. L’hepcidine, une hormone hépatique hyposidérémiante, contrôle le taux de fer sérique mis à disposition pour la synthèse de nouveaux globules rouges. La régulation de l’hepcidine implique un grand nombre de protéines, dont l’expression et l’activité répondent à la charge en fer de l’organisme. Récemment, la sérine protéase membranaire Matriptase-2 (MT2), synthétisée par le foie, a été identifiée comme actrice clé dans l’inhibition de la synthèse d’hepcidine. En effet, des mutations du gène Tmprss6 causent la synthèse de MT2 inactives, chez l’Homme et la souris, menant à une hyperhepcidinémie ; cet excès d’hormone génère une anémie de cause génétique, résistante à l’apport en fer (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Suite à des expériences in vitro, il a été proposé que MT2 inhibe l’expression de l’hepcidine en dégradant l’hémojuvéline (HJV), une protéine appartenant à la voie principale activant la synthèse de l’hormone ; le clivage d’HJV par MT2 bloquerait ainsi le signal passant par cette voie. Toutefois, des études in vivo ont montré que la protéine HJV exprimée par le foie diminue en absence de MT2. Le rôle de la protéase dans l’inhibition de l’hepcidine ne semble donc pas se limiter à l’interaction et au clivage de HJV par MT2. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de MT2 pour réguler l’homéostasie du fer, nous avons donc étudié son rôle in vivo, en absence de Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), l’activateur principal de la voie de régulation de l’hepcidine (double knock-out Bmp6 Tmprss6), et durant le développement embryonnaire et post-natal. L’analyse de ces modèles murins nous a ensuite incités à observer la conséquence d’une surexpression de MT2 in vivo et in vitro : l’excès d’activité catalytique dans ces conditions montre l’importance cruciale de réguler finement l’expression et l’activité des protéases. La synthèse de MT2 s’effectuant presque exclusivement au niveau des hépatocytes, nous avons finalement cherché à identifier les partenaires et cibles potentielles de MT2 dans ces cellules exclusivement, en isolant des hépatocytes primaires de souris WT pour les comparer à ceux de souris Tmprss6-/-, par transfection, mais également en utilisant différentes techniques de protéomique. Ces études ont permis de préciser l’importance de MT2 dans la régulation de l’hepcidine, mais aussi à quel point il est nécessaire de contrôler l’expression et l’activité catalytique de cette protéase, et donc que ses partenaires sont indispensables à sa fonction. / In the organism, iron takes care of oxygen transport until every organ, via haemoglobin of red blood cells. Hepcidin, a hepatic hyposideremic hormone, controls plasmatic iron levels at diposal for new erythroblasts synthesis. Hepcidin regulation implies a huge amount of proteins, whose activity and expression answer to iron body. Recently, membrane serine protease Matriptase-2 (MT2), synthetised by liver, has been identified as a key factor in hepcidin synthesis inhibition. Indeed, mutations of the Tmprss6 gene lead to synthesis of inactive MT2, in human and mouse, and result in hyperhepcidinemia: this excess of hormone generates an anemia of genetic cause, that resists to iron oral therapy (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Following in vitro experiments, it was suggested that MT2 inhibits hepcidin expression by degrading hemojuvelin (HJV), a protein part of the main signaling pathway positively regulating hepcidin synthesis; HJV cleavage by MT2 would then stop the signal. However, in vivo studies have shown that HJV expressed by the liver decreases in case of MT2 loss. The protease role in hepcidin inhibition seems to not be limited to HJV-MT2 interaction and cleavage. In order to better understand MT2 function in iron metabolism, we studied its role in vivo, when Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), the main activator of hepcidin regulatory pathway, is missing (double knock-out Bmp6 Tmprss6 mice), and during embryonic and postnatal development. Analysis of these mice models incited us to study the consequences of MT2 overexpression, in vivo and in vitro: excess of catalytic activity in these conditions show how crucial it is to tightly regulate proteases expression and activity. MT2 expression is almost exclusively restricted to hepatocytes; we then decided to identify its potential partners and targets in these cells, by isolating primary hepatocytes from WT mice, to compare them to Tmprss6-/- ones. These cells were transfected, and analysed by proteomic. These studies allowed us to precise MT2 importance in hepcidin regulation, but also how crucial it is to regulate expression and catalytic activity of this protease, and how its partners are essential for its role.

Les protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) forment une famille d'enzymes protéolytiques nouvellement identifiée dont les rôles physiologiques restent encore peu connus. Ces enzymes seraient, entre autres, impliqués dans la formation des tissus et leur dérégulation est reliée à de nombreux types de cancers. Récemment, une fonction essentielle dans la régulation de l'homéostasie du fer a été attribuée à l'un de ses membres, la matriptase-2 (TMPRSS6). Cet enzyme exerce ce rôle en contrôlant l'expression de l'hepcidine, une hormone importante dans la régulation du fer. Afin de mieux comprendre cette fonction de la matriptase-2, dans ce travail nous avons comparé ses propriétés enzymatiques à celles de trois autres TTSP ainsi qu'analyser son mécanisme de régulation fonctionnel. Nous démontrons que la matriptase-2 possède des préférences de substrats distinctes. Sa spécificité a été comparée à celles de la matriptase, de l'hepsine et de DESC1 en utilisant des peptides-substrats à fluorescence séquestrée. La séquence des peptides utilisés est basée sur la région P4 à P4' de la séquence d'activation de la matriptase (RQARTWGG). Les positions P4, P3, P2 et PI' ont été substituées par des acides aminés de natures différentes (non-polaire, aromatique, acide et basique) alors que la position PI a été fixée à Arg. Des quatre TTSP étudiées, la matriptase-2 est la plus permissive alors que la matriptase est la plus discriminante. DESC1 possède une préférence similaire à celle de la matriptase, mais avec une tendance pour les petits acides aminés non-polaires (Ala) en PI'. En présence de serpines, seulement AT III démontre une activité d'inhibition robuste. La matriptase-2 ainsi que l'hepsine et DESC1 sont aussi fortement inhibées en présence de PAI-1 et de [alpha][indice inférieur 2]-AP. La matriptase-2 est aussi la seule à présenter une inhibition par certains des substrats. Nous démontrons aussi l'importance de la régulation de la matriptase-2 à la membrane plasmique dans le contrôle de l'expression de l'hepcidine. Nous rapportons que la matriptase-2 subit une internalisation constitutive dans les cellules HEK293 transfectées ainsi que dans deux lignées cellulaires hépatiques humaines, les HepG2 et les hépatocytes primaires, tous les deux exprimant la matriptase-2 endogènement. La matriptase-2 marquée à la surface cellulaire est internalisée puis détectée dans des vésicules contenant de la clathrine et la protéine AP-2 pour ensuite se retrouver dans les endosomes précoces puis les lysosomes. L'internalisation de la matriptase-2 dépend de résidus spécifiques situés dans la portion amino-terminale de sa queue cytoplasmique, comme le démontre [i.e. démontrent] les résultats de la mutagénèse dirigée de ces résidus. Les cellules qui expriment ces mutants produisent des niveaux significativement diminués d'hepcidine comparées à celles exprimant la forme sauvage car les formes mutantes s'accumulent à la surface cellulaire et clivent davantage l'hémojuvéline.

This year the American Cancer Society predicts that 565,650 individuals will lose their life as a result of their battle with cancer. Due to its established roles in cancer and extracellular presentation, the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is an excellent target for anti-cancer drugs. It has been determined that matriptase and prostasin serine proteases are proteolytic regulators of EGFR membrane presentation, and downstream signaling. Currently, there are several drugs that target EGFR, but research continues in order to further understand drug-resistant EGFR. In cancer cell lines that exhibit both EGFR signaling and these proteases, proteolytic cleavage may be a mechanism of resistance to drugs that target the EGFR extracellular domain (ECD). The specific aim of this project was to determine which protease was direct! y responsible for EGFR cleavage and establish the precise cleavage site within the EGFR ECD. DNA corresponding to amino acid residues 336-505 of the EGFR ECD was cloned into the p-GEX-6P-I vector and expressed as a GST-fusion protein in E.coli cells. This fusion protein was isolated and purified by affinity chromatography. Purified GSTEGFR BCD fusion protein was mixed with prostasin and matriptase and evaluated for cleavage. No cleavage was detected using this method. Trypsin serine protease was used to ensure the cleavability of the GST-EGFR ECD. The GST-EGFR ECD fusion protein was found to be inappropriate for determining matriptase or prostasin cleavage sites, which are now being pursued by other means.

One of the most prevalent diseases acquired in older populations and currently the most common form of dementia, exists in the form of Alzheimer's [1]. Progressing over time, Alzheimer's begins intramolecularly through the buildup of amyloid precursor protein derived Aβ peptides which aggregate into neurotoxic fibrils. The fibrils result in damage to memory and cognitive systems, leading to depression of routine function and eventual death. There is currently no cure nor treatment by which this plaque buildup can be prevented or eliminated, and as such, significant work is being made towards this topic. It has been recently discovered that the human matriptase protein is capable of cleaving both the amyloid precursor protein from which Aβ peptides are made as well as the Aβ1-42 peptide itself, facilitating interest into its potential to reduce fibril formation [2][3]. In this study we set out to determine if the human matriptase serine protease domain can cleave Aβ fibrils or prevent the Aβ fibril formation in vitro. A recombinant matriptase serine protease domain (r-MatPD) was subcloned into a pET-28a-c(+) expressing vector, expressed, and purified via Ni-NTA affinity resin. The purified his-tagged r-MatPD was further auto-activated and incubated with the purified recombinant Aβ1-42 peptides. We observed that r-MatPD can cut polymerized Aβ1-42 into smaller fragments and prevent Aβ1-42 fibril formation. Effectively, this study suggested that the matriptase protease domain can be further investigated for its role in Aβ fibril clearance in vivo with a possibility of developing matriptase therapeutic potentials in treating Alzheimer's patients.

Systemic iron homeostasis is maintained by regulation of iron absorption in the duodenum, iron recycling from erythrocytes, and iron mobilization from the liver and is controlled by the hepatic hormone hepcidin. Hepcidin expression is induced via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway that preferentially uses two type I (ALK2 and ALK3) and two type II (ActRIIA and BMPR2) BMP receptors. Hemojuvelin (HJV), HFE, and transferrin receptor-2 (TfR2) facilitate this process presumably by forming a plasma membrane complex with BMP receptors. Matriptase-2 (MT2) is a protease and key suppressor of hepatic hepcidin expression and cleaves HJV. Previous studies have therefore suggested that MT2 exerts its inhibitory effect by inactivating HJV. Here, we report that MT2 suppresses hepcidin expression independently of HJV. In Hjv(-/-) mice, increased expression of exogenous MT2 in the liver significantly reduced hepcidin expression similarly as observed in wild-type mice. Exogenous MT2 could fully correct abnormally high hepcidin expression and iron deficiency in MT2(-/-) mice. In contrast to MT2, increased Hjv expression caused no significant changes in wild-type mice, suggesting that Hjv is not a limiting factor for hepcidin expression. Further studies revealed that MT2 cleaves ALK2, ALK3, ActRIIA, Bmpr2, Hfe, and, to a lesser extent, Hjv and Tfr2. MT2-mediated Tfr2 cleavage was also observed in HepG2 cells endogenously expressing MT2 and TfR2. Moreover, iron-loaded transferrin blocked MT2-mediated Tfr2 cleavage, providing further insights into the mechanism of Tfr2's regulation by transferrin. Together, these observations indicate that MT2 suppresses hepcidin expression by cleaving multiple components of the hepcidin induction pathway.

Iron is a metal element with crucial roles in human organism. Both iron deficiency and iron overload are important pathologies. Hepcidin, a peptide synthetized in the liver, is a key iron regulatory hormone. Increased amount of iron and inflammation stimulate its expression while iron deficiency and activated erythropoiesis cause hepcidin downregulation. The regulation of hepcidin expression on the molecular level and its hierarchy and interactions are not completely known. The main regulatory pathway is BMP/ SMAD which reacts to the iron amount in the organism. Several molecules, including hemojuvelin and HFE, are involved in this pathway and their mutations are linked to inappropriately low hepcidin production, iron overload and hereditary hemochromatosis. Erythroid regulation with suppressive action on hepcidin expression is known only partially as well as its connection to the BMP/ SMAD pathway. Recently, two new negative regulators of hepcidin expression have been described. Membrane enzyme present in hepatocytes - matriptase-2 (MT-2, TMPRSS6) and soluble factor secreted by erythroblasts - erythroferrone (ERFE). The aim of our work was to investigate how MT-2 is involved in the erythroid regulatory pathway, and whether it can represent the molecule where various regulatory pathways interact....

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(農学) / 乙第12878号 / 論農博第2805号 / 新制||農||1028(附属図書館) / 学位論文||H26||N4877(農学部図書室) / 31596 / (主査)教授 保川 清, 教授 安達 修二, 教授 伏木 亨 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

The glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored serine protease prostasin (PRSS8) is expressed at the apical membrane surface of epithelial cells and acts as a suppressor of tumor invasion when re-expressed in highly invasive human prostate and breast cancer cell lines. To better understand the molecular mechanisms underlying the anti-invasion phenotype associated with prostasin re-expression in prostate cancer cells, we expressed wild-type human prostasin or a serine active-site mutant prostasin in the PC-3 human prostate carcinoma cells. Molecular changes were measured at the mRNA and the protein levels. The expression of several invasion-promoting molecules is regulated by prostasin re-expression, mediated by a protein-level down-regulation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). As a result, the cellular response to EGF was reduced as shown by the down-regulation of EGF-stimulated Erk1/2 phosphorylation. The expression of Slug, urokinase-type plasminogen activator (uPA), urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) was also down-regulated by prostasin re-expression in the PC-3 cells. Co-expression of prostasin and its activating protease matriptase with EGFR in FT-293 cells induces an apparent proteolytic cleavage of the EGFR in the extracellular domain at two specific sites, generating two N-terminally truncated EGFR fragments, named EGFR135 and EGFR110. The EGFR110 is constitutively tyrosine-phosphorylated, and in its presence the phosphorylation of downstream signaling molecules including Erk1/2 and Akt is increased under serum-free conditions. Neither EGFR135 nor EGFR110 is responsive to EGF stimulation. Deletions of the EGFR extracellular domain (ECD) were generated to map the matriptase-prostasin cleavage sites. Two candidate sites were localized to regions AA1-273 and AA273-410. These data support a mechanism of action for the matriptase-prostasin epithelial extracellular serine protease activation cascade by proteolytically modulating the EGF-EGFR signaling. Prostasin gene expression is down-regulated in high-grade and hormone-refractory prostate cancers. We investigated the mechanisms by which androgens regulate prostasin expression in the prostate and prostate cancer. We treated the LNCaP human prostate cancer cells with dihydrotestosterone (DHT) and measured the mRNA expression of prostasin and potential transcription regulators of prostasin predicted by interrogation of the prostasin gene promoter sequence. Prostasin mRNA expression in the LNCaP cells was not responsive to DHT treatment. DHT marginally up-regulated mRNA expression of SREBP-1c, SREBP-2, and SNAIL, but not SREBP-1a, while dramatically increased SLUG mRNA expression, in a dose-dependent manner. Co-transfection of a prostasin promoter-reporter and SREBP cDNA in HEK-293 cells resulted in stimulation of the promoter activity at ~2 fold by SREBP-1c, and up to 6 fold by SREBP-2; while co-transfection with SNAIL or SLUG cDNA resulted in repression of the promoter activity to 43% or 59%, respectively. Co-transfection of the SLUG cDNA negated SREBP-2 s stimulation of the prostasin promoter in a dose-dependent manner. Transfection of an SREBP-2 cDNA in HEK-293 and DU-145 cells resulted in up-regulation of the endogenously expressed prostasin while transfection of a SLUG cDNA in the LNCaP cells repressed prostasin expression. Multiple SREBP-2 binding sites, known as sterol regulatory elements (SRE s), were identified at positions -897, -538, +8, +71, and +98 (named SRE-897, SRE-538, SRE+8, SRE+71, and SRE+98) in the human prostasin gene promoter. Mutagenesis of the five SRE s was carried out to evaluate their roles in SREBP-2 up-regulation of prostasin. SRE+98, a novel functional sterol regulatory element was found to be the major site for the stimulatory response of prostasin gene expression to SREBP-2. CONCLUSIONS: Prostasin regulates the expression of several invasion-promoting molecules in prostate cancer cells by down-modulating the EGF-EGFR signaling pathway. Active prostasin induces proteolytic cleavage in the EGFR ECD at two specific sites. One of the N-terminally truncated EGFR, the EGFR110 is auto-phosphorylated along with increased phosphorylation of downstream signaling molecules. The effect of the androgen DHT on prostasin expression in prostate cells is mediated via SREBP s, which stimulate the promoter, and Slug, which represses the promoter. Slug is up-regulated by DHT and EGF, providing a molecular mechanism by which epithelial cell-specific genes are silenced during prostate cancer development and progression.