Dans l’organisme, le fer assure le transport d’oxygène jusqu’à tous les organes, via l’hémoglobine des globules rouges. L’hepcidine, une hormone hépatique hyposidérémiante, contrôle le taux de fer sérique mis à disposition pour la synthèse de nouveaux globules rouges. La régulation de l’hepcidine implique un grand nombre de protéines, dont l’expression et l’activité répondent à la charge en fer de l’organisme. Récemment, la sérine protéase membranaire Matriptase-2 (MT2), synthétisée par le foie, a été identifiée comme actrice clé dans l’inhibition de la synthèse d’hepcidine. En effet, des mutations du gène Tmprss6 causent la synthèse de MT2 inactives, chez l’Homme et la souris, menant à une hyperhepcidinémie ; cet excès d’hormone génère une anémie de cause génétique, résistante à l’apport en fer (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Suite à des expériences in vitro, il a été proposé que MT2 inhibe l’expression de l’hepcidine en dégradant l’hémojuvéline (HJV), une protéine appartenant à la voie principale activant la synthèse de l’hormone ; le clivage d’HJV par MT2 bloquerait ainsi le signal passant par cette voie. Toutefois, des études in vivo ont montré que la protéine HJV exprimée par le foie diminue en absence de MT2. Le rôle de la protéase dans l’inhibition de l’hepcidine ne semble donc pas se limiter à l’interaction et au clivage de HJV par MT2. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de MT2 pour réguler l’homéostasie du fer, nous avons donc étudié son rôle in vivo, en absence de Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), l’activateur principal de la voie de régulation de l’hepcidine (double knock-out Bmp6 Tmprss6), et durant le développement embryonnaire et post-natal. L’analyse de ces modèles murins nous a ensuite incités à observer la conséquence d’une surexpression de MT2 in vivo et in vitro : l’excès d’activité catalytique dans ces conditions montre l’importance cruciale de réguler finement l’expression et l’activité des protéases. La synthèse de MT2 s’effectuant presque exclusivement au niveau des hépatocytes, nous avons finalement cherché à identifier les partenaires et cibles potentielles de MT2 dans ces cellules exclusivement, en isolant des hépatocytes primaires de souris WT pour les comparer à ceux de souris Tmprss6-/-, par transfection, mais également en utilisant différentes techniques de protéomique. Ces études ont permis de préciser l’importance de MT2 dans la régulation de l’hepcidine, mais aussi à quel point il est nécessaire de contrôler l’expression et l’activité catalytique de cette protéase, et donc que ses partenaires sont indispensables à sa fonction. / In the organism, iron takes care of oxygen transport until every organ, via haemoglobin of red blood cells. Hepcidin, a hepatic hyposideremic hormone, controls plasmatic iron levels at diposal for new erythroblasts synthesis. Hepcidin regulation implies a huge amount of proteins, whose activity and expression answer to iron body. Recently, membrane serine protease Matriptase-2 (MT2), synthetised by liver, has been identified as a key factor in hepcidin synthesis inhibition. Indeed, mutations of the Tmprss6 gene lead to synthesis of inactive MT2, in human and mouse, and result in hyperhepcidinemia: this excess of hormone generates an anemia of genetic cause, that resists to iron oral therapy (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Following in vitro experiments, it was suggested that MT2 inhibits hepcidin expression by degrading hemojuvelin (HJV), a protein part of the main signaling pathway positively regulating hepcidin synthesis; HJV cleavage by MT2 would then stop the signal. However, in vivo studies have shown that HJV expressed by the liver decreases in case of MT2 loss. The protease role in hepcidin inhibition seems to not be limited to HJV-MT2 interaction and cleavage. In order to better understand MT2 function in iron metabolism, we studied its role in vivo, when Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), the main activator of hepcidin regulatory pathway, is missing (double knock-out Bmp6 Tmprss6 mice), and during embryonic and postnatal development. Analysis of these mice models incited us to study the consequences of MT2 overexpression, in vivo and in vitro: excess of catalytic activity in these conditions show how crucial it is to tightly regulate proteases expression and activity. MT2 expression is almost exclusively restricted to hepatocytes; we then decided to identify its potential partners and targets in these cells, by isolating primary hepatocytes from WT mice, to compare them to Tmprss6-/- ones. These cells were transfected, and analysed by proteomic. These studies allowed us to precise MT2 importance in hepcidin regulation, but also how crucial it is to regulate expression and catalytic activity of this protease, and how its partners are essential for its role.

Les protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) forment une famille d'enzymes protéolytiques nouvellement identifiée dont les rôles physiologiques restent encore peu connus. Ces enzymes seraient, entre autres, impliqués dans la formation des tissus et leur dérégulation est reliée à de nombreux types de cancers. Récemment, une fonction essentielle dans la régulation de l'homéostasie du fer a été attribuée à l'un de ses membres, la matriptase-2 (TMPRSS6). Cet enzyme exerce ce rôle en contrôlant l'expression de l'hepcidine, une hormone importante dans la régulation du fer. Afin de mieux comprendre cette fonction de la matriptase-2, dans ce travail nous avons comparé ses propriétés enzymatiques à celles de trois autres TTSP ainsi qu'analyser son mécanisme de régulation fonctionnel. Nous démontrons que la matriptase-2 possède des préférences de substrats distinctes. Sa spécificité a été comparée à celles de la matriptase, de l'hepsine et de DESC1 en utilisant des peptides-substrats à fluorescence séquestrée. La séquence des peptides utilisés est basée sur la région P4 à P4' de la séquence d'activation de la matriptase (RQARTWGG). Les positions P4, P3, P2 et PI' ont été substituées par des acides aminés de natures différentes (non-polaire, aromatique, acide et basique) alors que la position PI a été fixée à Arg. Des quatre TTSP étudiées, la matriptase-2 est la plus permissive alors que la matriptase est la plus discriminante. DESC1 possède une préférence similaire à celle de la matriptase, mais avec une tendance pour les petits acides aminés non-polaires (Ala) en PI'. En présence de serpines, seulement AT III démontre une activité d'inhibition robuste. La matriptase-2 ainsi que l'hepsine et DESC1 sont aussi fortement inhibées en présence de PAI-1 et de [alpha][indice inférieur 2]-AP. La matriptase-2 est aussi la seule à présenter une inhibition par certains des substrats. Nous démontrons aussi l'importance de la régulation de la matriptase-2 à la membrane plasmique dans le contrôle de l'expression de l'hepcidine. Nous rapportons que la matriptase-2 subit une internalisation constitutive dans les cellules HEK293 transfectées ainsi que dans deux lignées cellulaires hépatiques humaines, les HepG2 et les hépatocytes primaires, tous les deux exprimant la matriptase-2 endogènement. La matriptase-2 marquée à la surface cellulaire est internalisée puis détectée dans des vésicules contenant de la clathrine et la protéine AP-2 pour ensuite se retrouver dans les endosomes précoces puis les lysosomes. L'internalisation de la matriptase-2 dépend de résidus spécifiques situés dans la portion amino-terminale de sa queue cytoplasmique, comme le démontre [i.e. démontrent] les résultats de la mutagénèse dirigée de ces résidus. Les cellules qui expriment ces mutants produisent des niveaux significativement diminués d'hepcidine comparées à celles exprimant la forme sauvage car les formes mutantes s'accumulent à la surface cellulaire et clivent davantage l'hémojuvéline.