Le virus de l’influenza infecte chaque année des millions d'humains ce qui a des impacts pour l’économie et entraîne le décès de nombreux individus. Le virus possède une grande capacité d'adaptation ce qui lui permet de revenir à chaque année sous forme de grippe saisonnière et occasionnellement de causer des pandémies dévastatrices. Cette capacité mutagène du virus est également la cause de résistance aux traitements pharmacologiques disponibles et encourage la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. L'activation de l’hémagglutinine du virus est une des cibles potentielles puisqu’elle permet la fusion de la protéine avec la membrane endosomale de l’hôte. La capacité de cliver l’hémagglutinine virale de certaines enzymes membres du groupe des protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP), particulièrement de la matriptase, a été explorée. Les résultats obtenus démontrent que la matriptase et plusieurs autres enzymes du groupe des TTSP sont exprimées dans l'épithélium bronchique humain. La matriptase et d'autres TTSP peuvent cliver des peptides correspondant aux séquences de clivage de l’hémagglutinine des virus de l’influenza présentement en circulation. Également, la matriptase clive de façon efficace des peptides correspondant aux séquences de clivage de l’hémagglutinine de virus de l’influenza aviaires hautement pathogéniques. En plus d'être efficace in vitro, l’enzyme possède aussi la capacité de cliver et d'activer de façon protéolytique l’hémagglutinine de virus H1N1 mais pas celle de virus H3N2 dans des modèles cellulaires d'épithélium bronchique. La microscopie confocale a également montré la colocalisation du virus de l’influenza avec la matriptase dans les endosomes lors de l’entrée du virus dans la cellule. L'utilisation de la technique d'ARN interférents contre la matriptase dans un modèle cellulaire a permis de réduire la réplication d'un virus H1N1 par 1,5 log. Le fort potentiel thérapeutique des inhibiteurs de protéases dans le traitement de l’influenza a aussi été démontré par l’utilisation de deux inhibiteurs sélectifs de la matriptase dans des modèles cellulaires d’infection. L'utilisation de l’inhibiteur IN-1 a permis de réduire de 50% la réplication d'un virus H1N1 à une concentration de 5,6 ?M. L'étude démontre donc que la matriptase est importante à la réplication des virus du sous-type HINI et que son inhibition permet une réduction significative de la charge virale ce qui ouvre la porte à de nouvelles possibilités de thérapies pour les cas sévères d'influenza.

Short-term creep tests in tension and in compression were conducted on southern pine, Douglas-fir, yellow-poplar, and Parallam™ samples at temperatures ranging between 20 and 80° C and at 6, 9 and 12% moisture content. The principle of time-temperature superposition was applied to form a master curve that extended for a maximum of 2 years. The horizontal shift factors followed an Arrhenius relation with activation energies ranging between 75 and 130 kJ/mole. It was not possible to superpose the compliance curves at 70 and 80° C, this is attributed to the presence of multiple components in wood with different temperature dependence. Long-term creep tests were also conducted in tension and in compression at 20° C and 12% moisture content for over 2 years. The resulting compliance curves were fitted to the power law equation using a nonlinear fitting procedure. The results were compared with those of the short-term creep tests. Finite element analysis was conducted on selected wood structures to determine the effect of creep on serviceability and stability. / Ph. D.

Les protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) forment une famille d'enzymes protéolytiques nouvellement identifiée dont les rôles physiologiques restent encore peu connus. Ces enzymes seraient, entre autres, impliqués dans la formation des tissus et leur dérégulation est reliée à de nombreux types de cancers. Récemment, une fonction essentielle dans la régulation de l'homéostasie du fer a été attribuée à l'un de ses membres, la matriptase-2 (TMPRSS6). Cet enzyme exerce ce rôle en contrôlant l'expression de l'hepcidine, une hormone importante dans la régulation du fer. Afin de mieux comprendre cette fonction de la matriptase-2, dans ce travail nous avons comparé ses propriétés enzymatiques à celles de trois autres TTSP ainsi qu'analyser son mécanisme de régulation fonctionnel. Nous démontrons que la matriptase-2 possède des préférences de substrats distinctes. Sa spécificité a été comparée à celles de la matriptase, de l'hepsine et de DESC1 en utilisant des peptides-substrats à fluorescence séquestrée. La séquence des peptides utilisés est basée sur la région P4 à P4' de la séquence d'activation de la matriptase (RQARTWGG). Les positions P4, P3, P2 et PI' ont été substituées par des acides aminés de natures différentes (non-polaire, aromatique, acide et basique) alors que la position PI a été fixée à Arg. Des quatre TTSP étudiées, la matriptase-2 est la plus permissive alors que la matriptase est la plus discriminante. DESC1 possède une préférence similaire à celle de la matriptase, mais avec une tendance pour les petits acides aminés non-polaires (Ala) en PI'. En présence de serpines, seulement AT III démontre une activité d'inhibition robuste. La matriptase-2 ainsi que l'hepsine et DESC1 sont aussi fortement inhibées en présence de PAI-1 et de [alpha][indice inférieur 2]-AP. La matriptase-2 est aussi la seule à présenter une inhibition par certains des substrats. Nous démontrons aussi l'importance de la régulation de la matriptase-2 à la membrane plasmique dans le contrôle de l'expression de l'hepcidine. Nous rapportons que la matriptase-2 subit une internalisation constitutive dans les cellules HEK293 transfectées ainsi que dans deux lignées cellulaires hépatiques humaines, les HepG2 et les hépatocytes primaires, tous les deux exprimant la matriptase-2 endogènement. La matriptase-2 marquée à la surface cellulaire est internalisée puis détectée dans des vésicules contenant de la clathrine et la protéine AP-2 pour ensuite se retrouver dans les endosomes précoces puis les lysosomes. L'internalisation de la matriptase-2 dépend de résidus spécifiques situés dans la portion amino-terminale de sa queue cytoplasmique, comme le démontre [i.e. démontrent] les résultats de la mutagénèse dirigée de ces résidus. Les cellules qui expriment ces mutants produisent des niveaux significativement diminués d'hepcidine comparées à celles exprimant la forme sauvage car les formes mutantes s'accumulent à la surface cellulaire et clivent davantage l'hémojuvéline.

Résumé: Chaque année, les épidémies saisonnières d’influenza causent de 3 à 5 millions de cas sévères de maladie, entraînant entre 250 000 et 500 000 décès mondialement. Seulement deux classes d’antiviraux sont actuellement commercialisées pour traiter cette infection respiratoire : les inhibiteurs de la neuraminidase, tels que l’oseltamivir (Tamiflu) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (adamantanes). Toutefois, leur utilisation est limitée par l’apparition rapide de résistance virale. Il est donc d’un grand intérêt de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’influenza. Le virus influenza dépend de l’activation de sa protéine de surface hémagglutinine (HA) pour être infectieux. L’activation a lieu par clivage protéolytique au sein d’une séquence d’acides aminés conservée. Ce clivage doit être effectué par une enzyme de l’hôte, étant donné que le génome du virus ne code pour aucune protéase. Pour les virus infectant l’humain, plusieurs études ont montré le potentiel de protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) à promouvoir la réplication virale : TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 et matriptase, identifiée récemment par notre équipe (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activent l’HA des virus influenza A (principalement H1N1 et H3N2). Toutefois, il existe peu d’information sur le clivage de l’HA des virus influenza B, et seulement TMPRSS2 et HAT ont été identifiées comme étant capables d’activer ce type de virus. Les travaux de ce projet de maîtrise visaient à identifier d’autres TTSP pouvant activer l’HA de l’influenza B. L’efficacité de clivage par la matriptase, hepsine, HAT et Desc1 a été étudiée et comparée entre ces TTSP. Ces quatre protéases s’avèrent capables de cliver l’HA de l’influenza B in vitro. Cependant, seul le clivage par matriptase, hepsine et HAT promeut la réplication virale. De plus, ces TTSP peuvent aussi supporter la réplication de virus influenza A. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de TTSP, développé en collaboration avec notre laboratoire, permet de bloquer significativement la réplication virale dans les cellules épithéliales bronchiques humaines Calu-3. Cet inhibiteur se lie de façon covalente et lentement réversible au site actif de la TTSP par un mécanisme slow tight-binding. Puisque cet inhibiteur cible une composante de la cellule hôte, et non une protéine virale, il n’entraîne pas le développement de résistance après 15 passages des virus en présence de l’inhibiteur dans les cellules Calu-3. L’inhibition des TTSP activatrices d’HA dans le système respiratoire humain représente donc une nouvelle stratégie thérapeutique pouvant mener au développement d’antiviraux efficaces contre l’influenza. / Abstract: Seasonal influenza epidemics cause between 3 and 5 millions severe cases of disease, leading to 250 000 to 500 000 deaths worldwide. Only two classes of drugs are currently available to treat influenza infections: neuraminidase inhibitors, such as oseltamivir (Tamiflu) and M2 channel inhibitors (adamantanes). However, the use of these antivirals is restricted by rapid emergence of viral resistance. It is therefore of great interest to develop new therapeutic strategies for the treatment of influenza disease. The influenza virus requires activation of its surface protein hemagglutinin (HA) to become infectious. This activation is achieved by proteolytic cleavage in a highly conserved amino acid sequence of the protein. Host cell proteases are responsible for this cleavage since the viral genome doesn’t encode any protease. For viruses that infect humans, many studies have shown the potential of type II transmembrane serine proteases (TTSP) to promote viral replication: TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 and matriptase, recently identified by our team (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activate HA of influenza A viruses (mainly H1N1 and H3N2). However, little is known about cleavage of influenza B virus HA, and only TMPRSS2 and HAT have been identified as being capable of activating this type of virus. This project aimed to identify other TTSPs able to activate influenza B HA. Cleavage efficacies of matriptase, hepsin, HAT and Desc1 were studied and compared. These four proteases were shown to be able to cleave influenza B HA using in vitro assays. However, only cleavage by matriptase, hepsin and HAT promoted viral replication. Moreover, these TTSPs also supported the replication of influenza A viruses. Thus, the use of a slow, tight-binding inhibitor (developed in collaboration with our laboratory) that binds to the TTSP active site, forming a covalent and reversible bond, significantly blocked viral replication in human bronchial epithelial Calu-3 cells. Since this inhibitor targets a host cell component, instead of a viral protein, viruses did not develop resistance after 15 passages in presence of the inhibitor in Calu-3 cells. Thus, inhibition of HA-activating TTSPs in the human respiratory tract represents a novel therapeutic strategy against influenza.

Hormonally-triggered regulatory hierarchies play a major role in organismal development. Disruption of a single member of such a hierarchy can lead to irregular development and disease. Therefore, knowledge of the members involved and the mechanisms controlling signaling through such pathways is of great importance in understanding how resulting developmental defects occur. Type II transmembrane serine proteases (TTSPs) make up a family of cell surface-associated proteases that play important roles in the development and homeostasis of a number of mammalian tissues. Aberrant expression of TTSPs is linked to several human disorders, including deafness, heart and respiratory disease and cancer. However, the mechanism by which these proteases function remains unknown. The ecdysone-responsive Stubble TTSP of Drosophila serves as a good model in which to study the functional mechanism of the TTSP family. The Stubble protease interacts with the intracellular Rho1 (RhoA) pathway to control epithelial development in imaginal discs. The Rho1 signaling pathway regulates cellular behavior via control of gene expression and actin cytoskeletal dynamics. However, the mechanism by which the Stubble protease interacts with the Rho1 pathway to control epithelial development, in particular leg imaginal disc morphogenesis, has yet to be elucidated. The Stubble protein consists of several conserved domains. One approach to a better understanding of the mechanism of action of Stubble in regulating Rho1 signaling is to define which of the conserved domains within the protease are required for proper function. Sequence analysis of twelve recessive Stubble mutant alleles has revealed that the proteolytic domain is essential for proper function. Alleles containing mutations which disrupt regions of the protease domain necessary for protease activation or substrate binding, as well as those with deletions or truncations that remove some portion of the proteolytic domain, result in defective epithelial development in vivo. In contrast, mutations in other regions of the Stubble protein, including the disulfide-knotted and cytoplasmic domains, were not observed. Another important step for defining the connection between Stubble and Rho1 signaling is to identify a Stubble target that acts as an upstream regulator of the Rho1 pathway. We performed a genetic screen in which 97 of the 147 Drosophila non-olfactory and non-gustatory G-protein-coupled receptors (GPCRs), a family of proteins that has been shown to be protease-activated and to activate Rho1 signaling, were tested for interactions with a mutant allele of Stubble. We found 4 genomic regions uncovering a total of 7 GPCRs that interact genetically when in heterozygous combination with a Stubble mutant. Further analysis of these genes is necessary to determine if any of these GPCRs is targeted by Stubble during activation of the Rho1 pathway.

Polymeric adhesives play an increasingly critical role in today's engineering designs. When used, adhesively bonded components reduce or eliminate the need for bolted or welded connections. In many cases, this can reduce stress concentrations and weight. With energy dissipating adhesives, noise and vibration reduction are possible, as is the use of unique or complicated designs that could not otherwise be constructed. Adhesive properties however, can vary greatly with time, temperature, and environmental exposure conditions such as moisture. It is therefore critical, to understand the behavior of adhesives over the range of conditions that a bonded component might experience. In this work, the behavior of a urethane-based adhesive was characterized and long-term durability predictions were developed as a result of the data collected. The popular T-peel sample geometry has been used extensively in this study to explore the mechanics of a bonded system and the resulting impact on adhesive durability. The T-peel specimens used, consist of two aluminum sheets or adherends bonded together, with tabs bent back in the shape of a "T" for gripping in a universal load frame. Unlike some other test geometries, T-peel samples are often made with relatively thin adherends that may experience significant plastic deformation during testing. This extraneous energy dissipation greatly complicates the analysis to extract meaningful fracture properties of the adhesive. During testing, the load required to propagate a crack in the adhesive layer is measured at fixed displacement rates. The total system energy can then be partitioned into the energy dissipated within the adhesive (fracture energy), and the energy dissipated through plastic work in bending of the adherends. By performing these tests at different temperatures and rates, the calculated fracture energies span a wide range of possible material behavior. Using the principles of Time Temperature Superposition (TTS), the collected data can be shifted to different times or temperatures. This behavior is well understood in polymer physics, and is made possible with material specific "shift factors". By using the principles of TTS, data collected in in a relatively short experimental window, can be used to accurately predict the behavior of the adhesive in years or even decades. In this work, nearly 200 T-peel samples were tested in four different studies. A preliminary set of unaged specimens was used to develop testing and data analysis methodologies. A second set of unaged samples was tested over a wide range of temperatures and rates, in addition to a third group, subjected to constant moisture and cyclically varying temperature. The final set of specimens, was exposed to 20 separate isothermal aging conditions. The experimental data showed that the 400+ cycles, were insufficient to statistically distinguish these samples from their unaged counterparts. Additionally, samples aged for up to 2000 hours in a dry environment, or 500 hours in a wet environment, showed no reduction in fracture energies in comparison with unaged samples. Specimens aged for more than 500 hours however, were observed to have a significant decrease in fracture energy values. Strong correlations between the thickness of the adhesive layer and estimated fracture energy values were found in this study. As adhesive thickness varied substantially due to manufacturing differences in the specimens tested, new analysis techniques were developed to deal with the variations in adhesive thickness. A MATLAB code based on the ICPeel program, was written to provide a spatial variation of parameters such as adhesive thickness, peel load, and fracture energy. This provided additional insights into the behavior of these T-peel coupons, and prompted the investigation of the Universal Peel Diagram concept. While this diagram was not found to be applicable to the adhesive tested in this study, the analysis indicated that T-peel coupons could be multivalued. That is, a single measured load value does not always describe an adhesive's fracture energy (as is widely believed). Depending on the sample's geometry and material properties, several measured loads could cause debonding. This has potentially far reaching implications on the selection of appropriate T-peel test geometries, as a single measured load is often assumed to correlate to an adhesive's true fracture energy. In this work, both aged and unaged T-peel specimens were tested and the basis of the Universal Peel Diagram investigated. Given sufficient exposure times to moisture, elevated temperatures were found to significantly reduce the amount of energy dissipated in the urethane-based adhesive. Additionally, the Universal Peel Diagram indicated that for some systems, the load required for debond is in fact, multivalued. Therefore, care should be taken when designing a T-peel test configuration to avoid the multivalued regions. / Master of Science / Polymeric adhesives play an increasingly critical role in today's engineering designs. When used, adhesively bonded components reduce or eliminate the need for bolted or welded connections, reducing their weight in the process. With adhesives, noise and vibration reduction are possible, as is the use of unique or complicated designs that could not otherwise be constructed. Adhesive properties, however, can vary greatly with time, temperature, and other environmental exposure conditions such as moisture. It is therefore critical to understand the behavior of adhesives over the range of conditions that a bonded component might experience. In this work, the behavior of a urethane-based adhesive was characterized in order to develop long-term durability predictions. Numerous test methods have been developed to characterize the behavior of adhesively bonded joints. In this work, T-peel specimens were used consisting of two aluminum sheets (the adherends), bonded together with tabs bent back in the shape of a "T" for gripping in a universal load frame. During testing, the load required to propagate a crack in the adhesive layer is measured. An outcome of this measurement and subsequent data analysis is the fracture energy—a measure of the effectiveness of the adhesive in transferring loads. If we perform these tests at different temperatures and loading rates, we can determine fracture energy values which span a wide range of possible material behavior. Using principles from basic polymer physics, the collected data can be shifted to different times or temperatures enabling us to accurately predict the behavior of the adhesive over years or even decades. In this work, nearly 200 T-peel samples were tested in four different studies. A preliminary set of unaged specimens was used to develop testing and data analysis methodologies. Unaged and cyclically (temperature) aged samples were tested over a wide range of temperatures and rates. The fourth set of specimens was subjected to 20 separate isothermal aging conditions and also tested at different temperatures and rates. The experimental data showed that the 400+ temperature cycles were insufficient to damage these samples significantly. Additionally, samples aged for up to 2000 hours in a dry environment, or 500 hours in a wet environment showed no reduction in performance in comparison with unaged samples. Specimens aged for more than 500 hours in a wet environment however, demonstrated a significant decreases in fracture energy values. Strong correlations between the thickness of the adhesive layer and estimated fracture energy values were found in this study, and new analysis techniques were developed to analyze the effect of these thickness variations on the joint performance.

La fibrose kystique (FK) est caractérisée par une inflammation pulmonaire chronique. Cette dernière est définie entre autres par une augmentation importante de la production de mucus. Celui-ci s'accumule dans les bronches empêchant ainsi l'éventuel passage de l'air. De plus, le mucus forme une barrière protectrice pour les bactéries qui va causer l'inflammation des poumons. La protéase human airway trypsin-like (HAT) a été retrouvée dans les expectorations de patients atteints d'asthme et bronchite chronique, pathologies similaires à la FK. Elle semble jouer un rôle dans l'inflammation car elle augmente entre autres la production de MUC5AC, protéine composant majoritairement le mucus. Le but de cette étude était de synthétiser la HAT dans une conformation active dans un système eucaryote pour étudier ses propriétés biochimiques, enzymatiques ainsi que son potentiel pro-inflammatoire dans la lignée cellulaire pulmonaire Calu-3. L'ADNc codant pour la partie soluble de la HAT a été inséré dans le vecteur pMT-BiP V5-His. Cet ADN recombinant fut ensuite transfecté dans les cellules de Drosophile Schneider 2 (S2). La HAT recombinante a par la suite été purifiée et son activité protéolytique testée avec un substrat fluorogénique. Ses propriétés biochimiques et enzymatiques ont été étudiées ainsi que son effet sur la production d'IL-8 et sa détection dans les expectorations de patients. La HAT purifiée était «enzymatiquement» pure, donc l'effet protéolytique observé avec le substrat fluorogénique est dû à la protéase. Les analyses de ses propriétés biochimiques montrent que l'activité protéolytique de la HAT est inhibée par un pH acide (<6.5), certains inhibiteurs synthétiques (l'aprotinine, la leupeptine et le PEFABLOC) et endogène (i.e: alpha-2 anti-plasmine (a2-AP)) de protéases à sérine. D'un autre côté, les essais enzymatiques révèlent que la HAT a une préférence pour les substrats ayant une arginine en P4, P3 et Pl plutôt que ceux ayant un glutamate en P4, P2 et P1'. Finalement, l'étude sur l'implication physiologique de l'enzyme démontre que la protéase ne semble pas avoir d'effet ou au plus peu d'effet sur la production d' IL-8. [Symboles non conformes]