L’activation du récepteur tyrosine kinase Met par son ligand, l’Hépatocyte Growth Factor, induit des réponses cellulaires nécessaires au développement embryonnaire, comme la survie ou la migration. Cependant une dérégulation de sa signalisation favorise la tumorigenèse. Mon laboratoire a montré que le récepteur Met subit des clivages protéolytiques régulant son activité. Ainsi, le « PreSenilin-dependent Regulated Intramembrane Proteolysis », un double clivage par des métalloprotéases membranaires puis le complexe γ-sécrétase, contrôle sa demi-vie. Suite à un stress apoptotique, Met est clivé par les caspases en un fragment intracellulaire amplificateur d’apoptose. J’ai pu montrer que le récepteur Met est la cible d’une autre famille de protéases, les calpaïnes, qui réalisent deux clivages distincts en fonction du contexte cellulaire. En effet, la mutation R970C observée dans certains cancers ou une forte densité cellulaire induisent le clivage de Met en un fragment de 45 kDa, p45 Met, qui se relocalise dans le noyau et augmente la dispersion et la motilité cellulaire, suggérant un rôle dans la transformation cellulaire. D’autre part, lors d'un stress calcique induisant la nécrose, le récepteur Met est à la fois clivé par les calpaïnes et les métalloprotéases. Bien que les fragments générés ne semble pas amplifier la mort cellulaire, ce double clivage permet une dégradation efficace de Met et inhibe ainsi des signaux de survie transmis pas Met. L’ensemble de ces fragments est détecté dans des tumeurs pulmonaires surexprimant Met, indiquant que les clivages identifiés par notre laboratoire reflètent des mécanismes existant dans des conditions pathologiques. / Met receptor activation by its ligand, Heptocyte Growth Factor, induces cell responses necessary for embryonic development such as cell survival or motility. However, its deregulation is involved in tumorigenesis. My laboratory previously showed that Met activity is regulated by proteolytic cleavage. Indeed, PreSenilin-dependent Regulated Intramembrane Proteolysis (or PS-RIP), two sequential cleavages mediated by membrane metalloproteases and the γ-secretase complex, controls Met half-life. Following apoptotic stress, Met is also cleaved by caspases into an intracellular fragment which amplifies apoptosis.I showed that Met is targeted by calpains, another protease family mediating two different cleavages in two different cellular contexts. Indeed, the R970C Met mutation or high cell density induces cleavage of Met into a fragment about 45kDa, p45 Met, which translocates in the nucleus and favors cell scattering and motility, suggesting it is involved in cell transformation. On the other hand, during necrosis induced by calcium stress, Met receptor is cleaved by both calpains and metalloproteases. Although the generated fragments do not seem to have biological properties, these two cleavages mediate an efficient degradation of Met receptor and consequently inhibiting of the survival signals it can provide. Interestingly, these fragments are detected in lung cancer samples overexpressing Met indicating that proteolytic cleavages of Met we identified have a pathological relevance.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’émergence récente de nouvelles thérapies antivirales efficaces est une avancée considérable pour lutter contre l'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC). Cependant, un pic de carcinomes hépatocellulaires, représentant l'atteinte hépatique ultime liée à l'infection, est attendu dans la prochaine décennie. Approfondir les connaissances des différentes étapes du cycle viral et de l’interférence du VHC avec l'hépatocyte hôte permet de mieux comprendre la pathogénèse associée à ce virus. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'identifier le réseau de partenaires cellulaires et viraux de la protéine non-structurale NS2 du VHC et de mieux comprendre les mécanismes d'action et de régulation de cette protéine transmembranaire multi-fonctionnelle, qui est un acteur clé du clivage protéolytique de la polyprotéine virale et de la morphogénèse des virions. Dans une première partie, nous avons analysé comparativement les mécanismes moléculaires de l’activité enzymatique des protéines NS2 du VHC et de plusieurs hepacivirus non-humains, qui infectent des primates du Nouveau Monde (GBV-B) ou qui ont été récemment identifiés chez plusieurs autres espèces animales (NPHV, RHV, BHV et GHV). Des analyses phylogénétiques, des modèles structuraux tridimensionnels et des Études dans un contexte d'expression transitoire de précurseurs polypeptidiques viraux ou dans des modèles d'infection ont montré que l’activité des protéases NS2 de divers hepacivirus (1) s'exerce à la jonction NS2/NS3 sous la forme d'homodimères formant deux triades catalytiques composites ; (2) est régulée dans le contexte de la polyprotéine virale par quelques résidus de surface du domaine N-terminal de NS3 (NS3N) nécessaires à son activation ; (3) est efficace en l'absence complète de NS3N, suggérant un rôle négatif ou régulateur, plutôt qu'activateur de NS3N, contrairement au dogme en vigueur actuellement. Ces travaux soulignent l'importance fonctionnelle des mécanismes protéolytiques de NS2 conservés parmi les différents hepacivirus. Dans une deuxième partie, nous avons identifié un réseau de facteurs cellulaires et viraux interagissant avec NS2 au cours du cycle infectieux par un crible interactomique reposant sur la purification par affinité et l'analyse par spectrométrie de masse des complexes protéiques isolés de cellules hépatocytaires infectées, ainsi que par un test de complémentation enzymatique fonctionnelle. Par une approche d'ARN interférence, nous avons ensuite montré qu'un nombre limité de facteurs cellulaires interagissant avec NS2 sont impliqués dans la production et la sécrétion de particules virales infectieuses, incluant des protéines du complexe de la peptidase signal (SPCS) au sein du réticulum endoplasmique, des protéines chaperonnes (DNAJB11, HSPA5) et une protéine impliquée dans le transport intracellulaire (SURF4). Notamment, nos Études suggèrent que plusieurs membres du SPCS forment un complexe multi-protéique avec NS2, impliquant Également la glycoprotéine virale E2, qui jouerait un rôle dans une Étape précoce de l'assemblage ou lors de l’enveloppement de la particule virale. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis d'identifier pour la première fois une série limitée de facteurs hépatocytaires interagissant spécifiquement avec la protéine NS2 du VHC au cours de l'infection et de déterminer parmi ceux-ci les facteurs essentiels la morphogenèse virale. Par ailleurs, nos résultats ont permis d’enrichir les connaissances naissantes des hepacivirus non-humains récemment identifiés et de montrer que ceux-ci partageaient avec le VHC des mécanismes clés mis en jeu au cours du cycle viral, ce qui contribue consolider leur intérêt comme modèles animaux de substitution. / The recent emergence of a panel of direct acting antivirals will certainly help combat chronic hepatitis C in the future. However, in the current context worldwide, a peak of hepatitis C virus (HCV)-induced hepatocellular carcinoma is expected in the next decade. Deepening our understanding of HCV life cycle and HCV interference with host cells may help monitor HCV-associated pathogenesis. The aim of my PhD work was to identify the network of host and viral interactors of HCV nonstructural protein 2 and to unravel the mechanisms of action and regulation of this multifunctional, transmembrane protein, which is key both for the viral polyprotein cleavage and virion morphogenesis.In the first part of the work, we comparatively characterized molecular mechanisms underlying the enzymatic activity of NS2 proteins from HCV and from various non-human hepaciviruses that infect small New World primates (GBV-B) or that were recently identified in the wild in several mammalian species (NPHV, RHV, BHV, GHV). A combination of phylogenetic analyses, tridimensional structural models, and studies relying on the transient expression of viral polypeptide precursors or on infection models showed that NS2 proteases of the various hepaciviruses (1) act as dimers with two composite active sites to ensure NS2/NS3 junction cleavage, (2) are regulated in the polyprotein backbone via a hydrophobic patch at the surface of NS3 N-terminal domain (NS3N) that is essential to activate NS2 protease, and (3) are efficient in the complete absence of NS3N, which is unprecedented and suggests that NS3N has rather a negative or regulating role on NS2 activity. These data underline the functional importance of NS2 proteolytic mechanisms that are conserved across hepaciviruses.In the second part, we identified a network of cellular factors and viral proteins that interact with NS2 in the course of HCV infection using an interactomic screen based on affinity purification and mass spectrometry analysis of protein complexes retrieved form HCV infected hepatoma cells, as well as a split-luciferase complementation assay. Next, using a gene silencing approach, we found that a limited set of NS2 interactors among these host factors were involved in HCV particle assembly and/or secretion. This includes members of the endoplasmic reticulum signal peptidase complex (SPCS), chaperone proteins (DNAJB11, HSPA5) and a factor involved in intracellular transport (SURF4). Notably, our data are in favor of the existence of a multiprotein complex involving NS2, several members of the SPCS, and the viral E2 glycoprotein, which likely plays a role in an early step of HCV particle assembly or during particle envelopment. Altogether, my PhD work allowed us to identify a limited set of hepatocyte factors interacting with HCV NS2 during infection and to pinpoint those that are essential for HCV morphogenesis. Additionally, our results contributed to the molecular characterization of the recently identified non-human hepaciviruses and revealed that these hepaciviruses share with HCV key mechanisms in the course of their infectious life cycles. This highlights the value of non-human hepaciviruses as surrogate animal models of HCV infection.

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d'ARNr 5S sont transcrits par l'ARN polymérase III qui fait intervenir plusieurs facteurs de transcription dont TFIIIA qui reconnaît spécifiquement le promoteur interne de ces gènes et permet ainsi le recrutement de l'ensemble du complexe de transcription. Le gène TFIIIA est composé de sept exons dont le troisième, résultant de l'exonisation d'une molécule d'ARNr 5S, est épissé de façon alternative produisant ainsi deux transcrits. Le transcrit ES, qui ne contient pas cet exon, code pour la protéine TFIIIA pleine longueur et fonctionnelle. Le transcrit EI, dans lequel l'exon " 5S-like " est maintenu, est reconnu et dégradé par la voie NMD (Non-Mediated Decay). L'exon " 5S-like " a, en effet, la particularité de contenir un codon stop prémature qui en fait une cible de la voie NMD. Lors de l'étude de l'expression des transcrits ES et EI ainsi que celle de l'accumulation de la protéine TFIIIA au cours du développement, nous avons montré que le taux de la protéine TFIIIA fonctionnelle est soumis à plusieurs niveaux de régulation. En effet, la production de la protéine TFIIIA pleine longueur est le résultat de la synthèse du transcrit ES et de sa traduction mais également de l'efficacité du clivage protéolytique de la protéine. Lors de la maturation de la graine, l'accumulation croissante de protéine TFIIIA résulte d'une augmentation des quantités de transcrits ES couplée à une diminution du clivage protéolytique. Dans les premiers jours du développement, la protéine TFIIIA n'est détectée qu'après le 4ème jour, suite à la diminution du clivage. Sa présence est corrélée au remodelage de la chromatine de l'ADNr 5S. La combinaison de ces deux mécanismes permet ainsi la production de TFIIIA et de son produit de transcription l'ARNr 5S en fonction des besoins de la plante.

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d’ARNr 5S sont transcrits par l’ARN polymérase III qui fait intervenir plusieurs facteurs de transcription dont TFIIIA qui reconnaît spécifiquement le promoteur interne de ces gènes et permet ainsi le recrutement de l’ensemble du complexe de transcription. Le gène TFIIIA est composé de sept exons dont le troisième, résultant de l’exonisation d’une molécule d’ARNr 5S, est épissé de façon alternative produisant ainsi deux transcrits. Le transcrit ES, qui ne contient pas cet exon, code pour la protéine TFIIIA pleine longueur et fonctionnelle. Le transcrit EI, dans lequel l’exon « 5S-like » est maintenu, est reconnu et dégradé par la voie NMD (Non-Mediated Decay). L’exon « 5S-like » a, en effet, la particularité de contenir un codon stop prémature qui en fait une cible de la voie NMD. Lors de l’étude de l’expression des transcrits ES et EI ainsi que celle de l’accumulation de la protéine TFIIIA au cours du développement, nous avons montré que le taux de la protéine TFIIIA fonctionnelle est soumis à plusieurs niveaux de régulation. En effet, la production de la protéine TFIIIA pleine longueur est le résultat de la synthèse du transcrit ES et de sa traduction mais également de l’efficacité du clivage protéolytique de la protéine. Lors de la maturation de la graine, l’accumulation croissante de protéine TFIIIA résulte d’une augmentation des quantités de transcrits ES couplée à une diminution du clivage protéolytique. Dans les premiers jours du développement, la protéine TFIIIA n’est détectée qu’après le 4ème jour, suite à la diminution du clivage. Sa présence est corrélée au remodelage de la chromatine de l’ADNr 5S. La combinaison de ces deux mécanismes permet ainsi la production de TFIIIA et de son produit de transcription l’ARNr 5S en fonction des besoins de la plante. / In Arabidopsis thaliana, 5S rRNA genes are transcribed by RNA polymerase III. TFIIIA, specifically required for transcription of these genes, binds to the internal control region of the 5S rRNA genes and allows the assembly of the full transcription complex pol III. The TFIIIA gene consists of seven exons, the third of which results in the exonisation of one 5S rRNA molecule. This exon “5S-like” is alternatively skipped or included to produce either of two transcript isoforms. The ES transcript encodes the fully functional TFIIIA protein. The EI transcript, which contains the exon “5S-like”, is a target of the NMD pathway (Non-Mediated Decay). Indeed, the exon “5S-like” contains a premature stop codon, which is recognized by this RNA decay pathway. During the study of the ES and EI transcripts expression and the TFIIIA protein accumulation throughout the plant development, we show that TFIIIA functional protein levels are under control of many regulation steps. Actually the production of the full-length TFIIIA protein results from production and translation of the ES transcript but also from the proteolytic cleavage efficiency of TFIIIA protein. During the seed maturation, the strong accumulation of TFIIIA results from an increase in ES amounts and a proteolytic cleavage decrease. After the fourth day post-germination, TFIIIA protein is detected because the proteolytic cleavage decreases. TFIIIA presence is correlated with 5S rDNA chromatin reorganization. The combination of these two mechanisms allows TFIIIA production and its transcription product 5S rRNA according to the plants needs.

Le coronavirus humain 229E (HCoV-229E) est responsable de rhumes mais peut entraîner de graves complications respiratoires chez les personnes âgées ou atteintes d’une maladie Chronique. Les coronavirus sont des virus enveloppés avec un génome à ARN positif simple brin. Trois protéines virales sont ancrées dans l'enveloppe virale : la protéine spike (S), la protéine de membrane (M) et la protéine d’enveloppe (E). Les protéines M et E sont impliquées dans l'assemblage viral et la sécrétion. La protéine S s'assemble en trimères à la surface des virions et joue un rôle-clé dans l’entrée du virus dans sa cellule-cible. Elle est constituée de deux domaines, le domaine S1 responsable de la liaison du virus à son récepteur et le domaine S2 responsable de la fusion de l’enveloppe virale avec une membrane cellulaire. La fusion est activée par des protéases cellulaires par clivage de la protéine S. Dans un premier temps nous avons caractérisé ce mécanisme. Pour cela, nous avons d'abord cloné la protéine S d’un isolat circulant de HCoV-229E. Nous avons analysé le clivage protéolytique de la protéine S par des sérine-protéases de type trypsine conduisant au processus de fusion à l’aide de particules pseudotypées rétrovirales. Les Résidus arginine, sites potentiels de reconnaissance par les protéases et présents au niveau de la jonction S1/S2 ou de la région S2’ ont été mutés individuellement (R565N, R679N, R683N ou R687N) afin d’étudier leur rôle lors de l'activation de la fusion. Contrairement à d'autres coronavirus, l'activation permettant la fusion de HCoV-229E semble être un processus en une seule étape. En effet, seule la mutation R683N inhibe l’infection médiée par des sérine-protéases et le clivage à l'interface S1/S2 ne semble pas être un pré-requis. Les protéines S de coronavirus sont fortement N-glycosylées et constituent la principale cible des anticorps neutralisants. Nous avons analysé le rôle de la N-glycosylation du domaine S1 dans les mécanismes d'entrée et dans la neutralisation par des anticorps. L'analyse de la séquence de la protéine clonée montre la présence de 33 sites potentiels de N-glycosylation, dont 18 dans le domaine S1 qui ont été numérotés de N1 à N18. Ces 18 sites de N-glycosylation ont été abolis individuellement par mutagenèse dirigée. L’effet des mutations sur l'infectiosité virale a été évalué en utilisant des particules pseudotypées rétrovirales. L'infectiosité des mutants N6, N7 ou N9 est diminuée tandis que deux mutants N12 et N15 montrent une augmentation de l'infectiosité. Nous n'avons détecté aucune différence d'interaction de ces mutants avec une forme soluble du récepteur, l'aminopeptidase N (APN). Des expériences d’activation de la fusion virale à la surface cellulaire par la trypsine suggèrent que les glycanes présents aux positions 6, 7 et 9 sont impliquées dans la fusion virale, cependant nous n’avons détecté aucune différence de clivage de ces mutants par la trypsine. Pour le mutant N17 uniquement, la diminution partielle de l'infectiosité pourrait s'expliquer par une diminution de l'incorporation de la protéine S dans les pseudoparticules, due au mauvais repliement de la protéine, comme le montre le profil du mutant en western blot en conditions réductrices ou non.Nous avons ensuite évalué si les N-glycanes pouvaient moduler la reconnaissance de la protéine S par des anticorps neutralisants. Des pseudoparticules contenant les différents mutants ont été produites et utilisées pour infecter des cellules en présence d'anticorps neutralisants. Nos données montrent que les mutants N4, N10, N11, N12, N15, N16, N17, N18 réduisent la sensibilité des pseudoparticules à la neutralisation des anticorps. Dans ensemble, nos résultats suggèrent que les N-glycanes de la protéine S jouent un rôle important dans l'entrée virale et modulent la reconnaissance de la protéine par des anticorps neutralisants. / The human coronavirus 229E (HCoV-229E) is a causative agent of common colds and can lead to severe respiratory complications in elderly persons and those with underlying disease. Coronavirus are enveloped viruses with a single stranded, positive-sense RNA genome. Three viral proteins are anchored in the viral enveloppe : the spike (S) protein, the membrane (M) protein and the enveloppe (E) protein. The M and E proteins are involved in viral assembly and secretion. The spike proteins assemble into trimers at the surface of the virions and play a key role in the early steps of viral infection. The spike protein comprised two domains, the S1 domain responsible for receptor binding and the S2 domain responsible for fusion of the viral enveloppe with the host cell membrane. Coronavirus fusion is activated by the proteolytic processing of the spike protein. First, we charaterized the proteolytic processing of the HCoV-229E spike protein by trypsin-like serine-proteases. To do so, we first cloned the spike protein of a circulating isolate of HCoV-229E. To investigate the role of the S1/S2 junction and the specific role of the 3 arginine residues located in the S2’ region in the proteolytic activation of HCoV-229E spike protein, the arginine residues present at these positions were mutated individually (R565N, R679N, R683N or R687N). Our results show that unlike other coronaviruses, HCoV-229E fusion activation appears to be a one step process. Indeed, the cleavage of the S1/S2 interface does not seem to be a pre-requisite, and the fusion activation strongly relies on the S2’ region, with R683 acting as the cleavage site.The spike protein is highly N-glycosylated and is the main target of neutralizing antibodies. We analysed the role of S1 domain N-glycosylation in the entry functions of the S protein and in neutralization by antibodies. Analysis of the sequence of the cloned protein shows the presence of 33 potential N-glycosylation sites, 18 being located in the S1 domain (numbered from N1 to N18). We mutated the 18 N-glycosylation sites of S1 individually by site-directed mutagenesis and studied the effect of the mutations using retroviral pseudotyped particles. Infectivity of the spike proteins with mutation either at the N6, N7 or N9 glycosylation site was strongly impaired. We did not detect any difference of interaction of these mutants with the soluble form of the receptor, the aminopeptidase N (APN). Results obtained by inducing the fusion of pseudoparticles at the cell surface with trypsin suggest that N-glycans located at the position N6, N7 and N9 are involved in viral fusion. However, the proteolytic processing of the protein required for fusion activation does not seem to be affected. Two mutants N12 and N15 show an increase of infectivity. Mutation of the N-glycosylation site N17 induces a partial decrease in infectivity. Indeed a decrease of spike protein incorporation into pseudoparticles was observed likely due to misfolding of the protein as shown by the profile of the mutant in western blot under reducing and non-reducing conditions. We next assessed if N-glycans can modulate the recognition of the spike protein by neutralizing antibodies. Pseudoparticles harbouring the different mutants were produced and used to infect cells in presence or absence of neutralizing antibodies. Our data demonstrate that mutants N4, N10, N11, N12, N15, N16, N17, N18 reduce the sensitivity of pseudoparticules to antibody neutralization. Taken together our results suggest that N-glycans of the S protein play an important role in viral entry and modulate the recognition of the protein by neutralizing antibodies.

Résumé: Chaque année, les épidémies saisonnières d’influenza causent de 3 à 5 millions de cas sévères de maladie, entraînant entre 250 000 et 500 000 décès mondialement. Seulement deux classes d’antiviraux sont actuellement commercialisées pour traiter cette infection respiratoire : les inhibiteurs de la neuraminidase, tels que l’oseltamivir (Tamiflu) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (adamantanes). Toutefois, leur utilisation est limitée par l’apparition rapide de résistance virale. Il est donc d’un grand intérêt de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’influenza. Le virus influenza dépend de l’activation de sa protéine de surface hémagglutinine (HA) pour être infectieux. L’activation a lieu par clivage protéolytique au sein d’une séquence d’acides aminés conservée. Ce clivage doit être effectué par une enzyme de l’hôte, étant donné que le génome du virus ne code pour aucune protéase. Pour les virus infectant l’humain, plusieurs études ont montré le potentiel de protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) à promouvoir la réplication virale : TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 et matriptase, identifiée récemment par notre équipe (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activent l’HA des virus influenza A (principalement H1N1 et H3N2). Toutefois, il existe peu d’information sur le clivage de l’HA des virus influenza B, et seulement TMPRSS2 et HAT ont été identifiées comme étant capables d’activer ce type de virus. Les travaux de ce projet de maîtrise visaient à identifier d’autres TTSP pouvant activer l’HA de l’influenza B. L’efficacité de clivage par la matriptase, hepsine, HAT et Desc1 a été étudiée et comparée entre ces TTSP. Ces quatre protéases s’avèrent capables de cliver l’HA de l’influenza B in vitro. Cependant, seul le clivage par matriptase, hepsine et HAT promeut la réplication virale. De plus, ces TTSP peuvent aussi supporter la réplication de virus influenza A. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de TTSP, développé en collaboration avec notre laboratoire, permet de bloquer significativement la réplication virale dans les cellules épithéliales bronchiques humaines Calu-3. Cet inhibiteur se lie de façon covalente et lentement réversible au site actif de la TTSP par un mécanisme slow tight-binding. Puisque cet inhibiteur cible une composante de la cellule hôte, et non une protéine virale, il n’entraîne pas le développement de résistance après 15 passages des virus en présence de l’inhibiteur dans les cellules Calu-3. L’inhibition des TTSP activatrices d’HA dans le système respiratoire humain représente donc une nouvelle stratégie thérapeutique pouvant mener au développement d’antiviraux efficaces contre l’influenza. / Abstract: Seasonal influenza epidemics cause between 3 and 5 millions severe cases of disease, leading to 250 000 to 500 000 deaths worldwide. Only two classes of drugs are currently available to treat influenza infections: neuraminidase inhibitors, such as oseltamivir (Tamiflu) and M2 channel inhibitors (adamantanes). However, the use of these antivirals is restricted by rapid emergence of viral resistance. It is therefore of great interest to develop new therapeutic strategies for the treatment of influenza disease. The influenza virus requires activation of its surface protein hemagglutinin (HA) to become infectious. This activation is achieved by proteolytic cleavage in a highly conserved amino acid sequence of the protein. Host cell proteases are responsible for this cleavage since the viral genome doesn’t encode any protease. For viruses that infect humans, many studies have shown the potential of type II transmembrane serine proteases (TTSP) to promote viral replication: TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 and matriptase, recently identified by our team (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activate HA of influenza A viruses (mainly H1N1 and H3N2). However, little is known about cleavage of influenza B virus HA, and only TMPRSS2 and HAT have been identified as being capable of activating this type of virus. This project aimed to identify other TTSPs able to activate influenza B HA. Cleavage efficacies of matriptase, hepsin, HAT and Desc1 were studied and compared. These four proteases were shown to be able to cleave influenza B HA using in vitro assays. However, only cleavage by matriptase, hepsin and HAT promoted viral replication. Moreover, these TTSPs also supported the replication of influenza A viruses. Thus, the use of a slow, tight-binding inhibitor (developed in collaboration with our laboratory) that binds to the TTSP active site, forming a covalent and reversible bond, significantly blocked viral replication in human bronchial epithelial Calu-3 cells. Since this inhibitor targets a host cell component, instead of a viral protein, viruses did not develop resistance after 15 passages in presence of the inhibitor in Calu-3 cells. Thus, inhibition of HA-activating TTSPs in the human respiratory tract represents a novel therapeutic strategy against influenza.

Un obstacle important dans l’éradication du virus de l’immunodéfience humaine (VIH-1) est l’établissement de réservoirs viraux où le virus reste à l’état latent ainsi que l’absence de vaccin efficace. Bien que les molécules antivirales actuelles permettent d’augmenter l’espérance de vie des personnes vivant avec le VIH-1 (PLWH) ainsi que de diminuer la réplication virale chez cellesci, elles ne contribuent pas à l’élimination de ces réservoirs. La hausse de résistance envers ces molécules inhibitrices nécessite le développement constant de nouvelles molécules. L’une d’entre elles, temsavir (BMS-626529), est un nouvel inhibiteur d’attachement approuvé par la FDA depuis 2020. Sa cible, la glycoprotéine d’enveloppe (Env), est le seul antigène viral présent à la surface des cellules infectées et des virions, représentant donc la cible idéale des anticorps. L’Env mature se trouve sous forme d’hétérodimère (gp120 et gp41) suite au clivage de son précurseur gp160. Temsavir lie sous la boucle β20-β21 de la gp120 et prévient donc, par compétition, l’interaction entre l’Env et le récepteur CD4 de l’hôte. En plus de son rôle en tant qu’inhibiteur d’attachement, temsavir permet de stabiliser le trimère dans sa conformation dite «fermée». Un ancien analogue de temsavir, BMS-806, a montré réduire l’addition de glycans ainsi que de diminuer le clivage du précurseur gp160. Nos études démontrent que temsavir possède également un impact sur ces mécanismes impliqués dans la maturation et la flexibilité de l’Env de plusieurs souches du VIH-1. De ce fait, nous avons investigué l’effet de cette altération sur la conformation des différentes Env. Nos observations montrent que l’effet de temsavir sur le clivage protéolytique est associé à une diminution de la reconnaissance de l’Env par des anticorps ciblant différentes régions de celle-ci. Cette modification de la reconnaissance de l’Env est également associée à l’efficacité de la réponse cytotoxique cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) à éliminer les cellules infectées. Les résultats présentés dans ce mémoire, notamment l’effet de temsavir sur la conformation de l’Env, devrait être considéré lors du développement d’immunothérapies ciblant le réservoir viral. / An important obstacle in the eradication of the human immunodeficiency virus (HIV-1) is the establishment of viral reservoirs where the virus remains in a latent state and the absence of a potent vaccine. Although current antiretroviral molecules increase the life expectancy of people living with HIV-1 (PLWH) as well as reduce viral replication, they do not contribute to the elimination of these reservoirs. Also, the increase in drugs resistances towards these inhibitory molecules requires the constant development of new molecules. One of them, temsavir (BMS-626529), is a new attachment inhibitor approved by the FDA since 2020. Its target, the envelope glycoprotein (Env), is the only viral antigen present at the surface of infected cells and virions and thus, is also the main target of antibodies. This mature Env consists of three gp120-gp41 heterodimers after the proteolytic cleavage of its gp160 precursor. Temsavir binds under the β20-β21 loop of gp120 and prevents the interaction between Env and the host CD4 receptor. In addition to its role as an attachment inhibitor, temsavir stabilizes the trimer in its "closed" conformation. A previous analog of temsavir, BMS-806, has been shown to affect the addition of glycans as well as the cleavage of the gp160 precursor. Our studies demonstrate that temsavir also has an impact on these mechanisms involved in the maturation and flexibility of Env of several strains of HIV-1. Therefore, we investigated the effect of this alteration on the conformation of different Env. Our observations showed that the effect of temsavir on proteolytic cleavage is associated with a decrease in Env recognition by antibodies targeting different regions of Env. This modification in Env recognition also appears to be associated with the efficacy of antibody to mediate potent antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) against infected-cells. The results presented in this master thesis, should be considered when developing immunotherapies aimed at targeting the viral reservoir in Fostemsavir-treated individuals.

L’ubiquitination, une modification post-traductionnelle importante pour le contrôle de nombreux processus cellulaires, est une réaction réversible. La réaction inverse, nommée déubiquitination est catalysée par les déubiquitinases (DUB). Nous nous sommes intéressés dans nos travaux à étudier l’ubiquitination de l’histone H2A (H2Aub), au niveau des résidus lysines 118 et 119 (K118/K119), une marque épigénétique impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire et la réparation de l’ADN. Le régulateur transcriptionnel BAP1, une déubiquitinase nucléaire, a été initialement identifié pour sa capacité à promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 forme un complexe multi-protéique avec plusieurs facteurs transcriptionnels et sa fonction principale est la déubiquitination de H2Aub. Plusieurs études ont démontré que BAP1 est un gène suppresseur de tumeurs majeur et qu’il est largement muté et inactivé dans une multitude de cancers. En effet, BAP1 émerge comme étant la DUB la plus mutée au niveau des cancers. Cependant, le ou les mécanismes d’action et de régulation du complexe BAP1 restent très peu connus. Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des partenaires protéiques de BAP1. De manière significative nous avons caractérisé un mécanisme unique de régulation entre deux composants majeurs du complexe BAP1 à savoir, HCF-1 et OGT. En effet, nous avons démontré que HCF-1 est requis pour maintenir le niveau protéique de OGT et que cette dernière est indispensable pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant son clivage par O-GlcNAcylation, une signalisation cellulaire nécessaire au bon fonctionnement de HCF-1. Également, nous avons découvert un nouveau mécanisme de régulation de BAP1 par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. En effet, UBE2O agit comme un régulateur négatif de BAP1 puisque l’ubiquitination de ce dernier induit sa séquestration dans le cytoplasme et l’inhibition de sa fonction suppressive de tumeurs. D’autre part nous nous sommes penchés sur la caractérisation de l’association de BAP1 avec deux facteurs de la famille des protéines Polycombes nommés ASXL1 et ASXL2 (ASXL1/2). Nous avons investigué le rôle de BAP1/ASXL1/2, particulièrement dans les mécanismes de déubiquitination et suppression de tumeurs. Nous avons démontré que BAP1 interagit directement iii via son domaine C-terminale avec le même domaine ASXM de ASXL1/2 formant ainsi deux complexes mutuellement exclusifs indispensables pour induire l’activité déubiquitinase de BAP1. De manière significative, ASXM s’associe avec BAP1 pour créer un nouveau domaine composite de liaison à l’ubiquitine. Ces interactions BAP1/ASXL1/2 régulent la progression harmonieuse du cycle cellulaire. De plus, la surexpression de BAP1 et de ASXL2 au niveau des fibroblastes induit la sénescence de manière dépendante de leurs interactions. D’autre part, nous avons identifié des mutations de cancers au niveau de BAP1 le rendant incapable de lier ASXL1/2, d’exercer sa fonction d’autodéubiquitination et de ce fait d’agir comme suppresseur de tumeurs. Ainsi nous avons révélé un lien étroit entre le gène suppresseur de tumeurs BAP1, son activité déubiquitinase et le contrôle de la prolifération cellulaire. / The reverse reaction of ubiquitination, a crucial post-translational modification, is catalyzed by deubiquitinases (DUBs). BAP1 is an ubiquitously expressed nuclear DUB that recently emerged as an important tumor suppressor highly mutated and inactivated in an increasing number of cancers of diverse origins. Both somatic and germline mutations with loss of heterozygosity were observed in tumors, making BAP1 the most mutated DUB in human malignancies. We previously reported that BAP1 is a component of a large multi-protein complex that includes several transcription regulators. The Drosophila homologue of BAP1, Calypso, forms the Polycomb-repressive DUB (PR-DUB) complex with Additional Sex Comb, ASX. This complex catalyzes the deubiquitination of histone H2A, an essential chromatin modification that regulates gene expression. Despite the ever increasing number of findings describing the occurrence of BAP1 mutations in cancers, few studies investigated the mechanisms of action of this DUB as a tumor suppressor. Therefore, the biological function and the mechanism of action and regulation of BAP1 remains largely uncharacterized. In the work described in this thesis, we investigated the roles of BAP1 partners in modulating its catalytic activity and tumor suppressor function. More specifically we discovered a unique mechanism of regulation between two major components of BAP1 complexes, namely HCF-1 and OGT. Indeed, HCF-1 is important for the maintenance of the cellular levels of OGT. OGT, in turn, is required for the proper proteolytic maturation of HCF-1 by promoting its O-GlcNAcylation. This signaling event is required for HCF-1 function as a cell cycle regulator. On the other hand, we deciphered an intricate mechanism of regulation of BAP1 by the atypical E2/E3 ligase, UBE2O. UBE2O, promote the multi-monoubiquitination of BAP1 on its NLS mediating its cytoplasmic sequestration and thus inhibition of its tumor suppressor function. Another aspect of modulation of BAP1 H2Aub catalysis is provided by the association of BAP1 with ASXL1 and ASXL2 (ASXL1/ASXL2), two orthologs of ASX. We investigated the role of BAP1/ASXL1/2, particularly in the mechanisms of deubiquitination and tumor suppression. We have demonstrated that BAP1 interacts directly via its C-terminal domain with the ASXM domain of ASXL1/2, thus forming two mutually exclusive complexes. Significantly, ASXM promote, through assembly with BAP1, the generation of a composite ubiquitin binding domain (CUBI), indispensable for inducing the deubiquitinase activity of BAP1 towards H2Aub. The interactions between BAP1 and ASXL1/2 regulate cell cycle progression. In addition, overexpression of BAP1 or ASXL2 in fibroblasts induces senescence in CTD- and ASXM-dependent manner. We also identified cancer-derived mutation of BAP1 that selectively abolish its interaction with ASXL1 and ASXL2 as well as its H2A deubiquitinase activity. Significantly, this mutant suppressed senescence induced by BAP1 overexpression. Thus we provided a link between the tumor suppressor BAP1, its deubiquitinase activity and the control of cell proliferation.