Le coronavirus humain 229E (HCoV-229E) est responsable de rhumes mais peut entraîner de graves complications respiratoires chez les personnes âgées ou atteintes d’une maladie Chronique. Les coronavirus sont des virus enveloppés avec un génome à ARN positif simple brin. Trois protéines virales sont ancrées dans l'enveloppe virale : la protéine spike (S), la protéine de membrane (M) et la protéine d’enveloppe (E). Les protéines M et E sont impliquées dans l'assemblage viral et la sécrétion. La protéine S s'assemble en trimères à la surface des virions et joue un rôle-clé dans l’entrée du virus dans sa cellule-cible. Elle est constituée de deux domaines, le domaine S1 responsable de la liaison du virus à son récepteur et le domaine S2 responsable de la fusion de l’enveloppe virale avec une membrane cellulaire. La fusion est activée par des protéases cellulaires par clivage de la protéine S. Dans un premier temps nous avons caractérisé ce mécanisme. Pour cela, nous avons d'abord cloné la protéine S d’un isolat circulant de HCoV-229E. Nous avons analysé le clivage protéolytique de la protéine S par des sérine-protéases de type trypsine conduisant au processus de fusion à l’aide de particules pseudotypées rétrovirales. Les Résidus arginine, sites potentiels de reconnaissance par les protéases et présents au niveau de la jonction S1/S2 ou de la région S2’ ont été mutés individuellement (R565N, R679N, R683N ou R687N) afin d’étudier leur rôle lors de l'activation de la fusion. Contrairement à d'autres coronavirus, l'activation permettant la fusion de HCoV-229E semble être un processus en une seule étape. En effet, seule la mutation R683N inhibe l’infection médiée par des sérine-protéases et le clivage à l'interface S1/S2 ne semble pas être un pré-requis. Les protéines S de coronavirus sont fortement N-glycosylées et constituent la principale cible des anticorps neutralisants. Nous avons analysé le rôle de la N-glycosylation du domaine S1 dans les mécanismes d'entrée et dans la neutralisation par des anticorps. L'analyse de la séquence de la protéine clonée montre la présence de 33 sites potentiels de N-glycosylation, dont 18 dans le domaine S1 qui ont été numérotés de N1 à N18. Ces 18 sites de N-glycosylation ont été abolis individuellement par mutagenèse dirigée. L’effet des mutations sur l'infectiosité virale a été évalué en utilisant des particules pseudotypées rétrovirales. L'infectiosité des mutants N6, N7 ou N9 est diminuée tandis que deux mutants N12 et N15 montrent une augmentation de l'infectiosité. Nous n'avons détecté aucune différence d'interaction de ces mutants avec une forme soluble du récepteur, l'aminopeptidase N (APN). Des expériences d’activation de la fusion virale à la surface cellulaire par la trypsine suggèrent que les glycanes présents aux positions 6, 7 et 9 sont impliquées dans la fusion virale, cependant nous n’avons détecté aucune différence de clivage de ces mutants par la trypsine. Pour le mutant N17 uniquement, la diminution partielle de l'infectiosité pourrait s'expliquer par une diminution de l'incorporation de la protéine S dans les pseudoparticules, due au mauvais repliement de la protéine, comme le montre le profil du mutant en western blot en conditions réductrices ou non.Nous avons ensuite évalué si les N-glycanes pouvaient moduler la reconnaissance de la protéine S par des anticorps neutralisants. Des pseudoparticules contenant les différents mutants ont été produites et utilisées pour infecter des cellules en présence d'anticorps neutralisants. Nos données montrent que les mutants N4, N10, N11, N12, N15, N16, N17, N18 réduisent la sensibilité des pseudoparticules à la neutralisation des anticorps. Dans ensemble, nos résultats suggèrent que les N-glycanes de la protéine S jouent un rôle important dans l'entrée virale et modulent la reconnaissance de la protéine par des anticorps neutralisants. / The human coronavirus 229E (HCoV-229E) is a causative agent of common colds and can lead to severe respiratory complications in elderly persons and those with underlying disease. Coronavirus are enveloped viruses with a single stranded, positive-sense RNA genome. Three viral proteins are anchored in the viral enveloppe : the spike (S) protein, the membrane (M) protein and the enveloppe (E) protein. The M and E proteins are involved in viral assembly and secretion. The spike proteins assemble into trimers at the surface of the virions and play a key role in the early steps of viral infection. The spike protein comprised two domains, the S1 domain responsible for receptor binding and the S2 domain responsible for fusion of the viral enveloppe with the host cell membrane. Coronavirus fusion is activated by the proteolytic processing of the spike protein. First, we charaterized the proteolytic processing of the HCoV-229E spike protein by trypsin-like serine-proteases. To do so, we first cloned the spike protein of a circulating isolate of HCoV-229E. To investigate the role of the S1/S2 junction and the specific role of the 3 arginine residues located in the S2’ region in the proteolytic activation of HCoV-229E spike protein, the arginine residues present at these positions were mutated individually (R565N, R679N, R683N or R687N). Our results show that unlike other coronaviruses, HCoV-229E fusion activation appears to be a one step process. Indeed, the cleavage of the S1/S2 interface does not seem to be a pre-requisite, and the fusion activation strongly relies on the S2’ region, with R683 acting as the cleavage site.The spike protein is highly N-glycosylated and is the main target of neutralizing antibodies. We analysed the role of S1 domain N-glycosylation in the entry functions of the S protein and in neutralization by antibodies. Analysis of the sequence of the cloned protein shows the presence of 33 potential N-glycosylation sites, 18 being located in the S1 domain (numbered from N1 to N18). We mutated the 18 N-glycosylation sites of S1 individually by site-directed mutagenesis and studied the effect of the mutations using retroviral pseudotyped particles. Infectivity of the spike proteins with mutation either at the N6, N7 or N9 glycosylation site was strongly impaired. We did not detect any difference of interaction of these mutants with the soluble form of the receptor, the aminopeptidase N (APN). Results obtained by inducing the fusion of pseudoparticles at the cell surface with trypsin suggest that N-glycans located at the position N6, N7 and N9 are involved in viral fusion. However, the proteolytic processing of the protein required for fusion activation does not seem to be affected. Two mutants N12 and N15 show an increase of infectivity. Mutation of the N-glycosylation site N17 induces a partial decrease in infectivity. Indeed a decrease of spike protein incorporation into pseudoparticles was observed likely due to misfolding of the protein as shown by the profile of the mutant in western blot under reducing and non-reducing conditions. We next assessed if N-glycans can modulate the recognition of the spike protein by neutralizing antibodies. Pseudoparticles harbouring the different mutants were produced and used to infect cells in presence or absence of neutralizing antibodies. Our data demonstrate that mutants N4, N10, N11, N12, N15, N16, N17, N18 reduce the sensitivity of pseudoparticules to antibody neutralization. Taken together our results suggest that N-glycans of the S protein play an important role in viral entry and modulate the recognition of the protein by neutralizing antibodies.

Coronaviruses have caused three large outbreaks in the past century. The most recent one, also still ongoing, is represented by the SARS-CoV-2/Covid-19 pandemic. Efforts have been taken to develop efficient vaccines and antivirals and one of the major virus-based targets in drug development is represented by the main protease of these viruses. Main proteases are proteins (cysteine hydrolases) with high level of conservation among different coronaviruses and have an important role in the virus life cycle. Due to the need of developing broad-spectrum antivirals against Coronaviruses, this study aimed to set up a CPE-based assay for testing compounds against the main protease of human coronavirus 229E. An optimized TCID50 protocol was established by using MRC-5 cells, at a density of 1x104 cells/ml with a 3h incubation prior infection with a concentration of 10-1 of HCoV-229E. The cell viability was assessed through MTT assay. Using reference compounds, with previously demonstrated antiviral potency against the main protease of different coronaviruses (GC-376, Nirmatrelvir), the efficiency of the conceived assay was validated (GC-376 EC50 = 1.24 μM; Nirmatrelvir Ec50= 0.72 μM). Compound 19 was proved to also be active against the main protease of HCoV-229E (EC50 = 0.22 μM), and together with previous findings, it was concluded that this compound has a broad-spectrum activity. Newly developed compounds MP17 and MP19 were also demonstrated to be efficient against HCoV-229E. As a future perspective, further investigations of these compounds should take place for the identification of EC50 values.

Une antisepsie-désinfection (ATS-D) efficace est fondamentale si l'on considère le manque de traitements antiviraux spécifiques, l'émergence de nouveaux virus et l'accroissement du nombre d'infections nosocomiales virales. A ce jour, une seule norme Européenne, la norme NF EN 14476+A1, propose un cadre pour évaluer l'activité ATS-D antivirale en médecine Humaine et certaines améliorations sont encore nécessaires.Dans ce but, nous avons développé et validé, biologiquement et physico-chimiquement, un protocole pour évaluer l'activité ATS-D antivirale. Ce dernier est basé sur une méthode originale de filtration sur gel faisant appel à des colonnes de Séphadex™ G-25 et G-10 de notre conception comme moyen de neutralisation. Nous avons ainsi évalué, sur le coronavirus Humain 229E (HCoV 229E), les activités ATS-D de deux molécules de référence, la chlorhexidine (CHX) et l'hexamidine (HXM), ainsi que de deux calixarènes : le tetra-para-sulfonato-calix[4]arène (C[4]S) et le 1,3-bis(bithiazolyl)-tetra-para-sulfonato-calix[4]arène (C[4]S-BTZ). Selon la norme Européenne, pour qu'une formulation puisse prétendre à une activité ATS-D antivirale, il faut qu'elle induise une diminution de 4 log10 dans les titres viraux. L'HXM et le C[4]S n'ont montré qu'une très faible activité vis à vis du HCoV 229E. La CHX a montré quant à elle une activité beaucoup plus intéressante bien qu'elle ne puisse néanmoins pas prétendre à une activité ATS sur le HCoV 229E. Enfin, le C[4]S-BTZ a montré une activité comparable, voire meilleure, que la CHX. Son activité s'est en effet avérée plus rapide, rémanente et dénuée de cytotoxicité, contrairement à la CHX / Efficient antisepsis-disinfection is fundamental, considering the lack in antiviral treatments, the emergence of new viruses and the raising of viral nosocomial infections. Only one European Standard (NF EN 14476 + A1) proposes a frame to evaluate antiseptic antiviral activity in Human medicine and some improvements are still needed. We thus developed and validated, biologically and physico-chemically, a virucidal assay based on an original gel filtration method, using “in-house” G-25 and G-10 Sephadex™ columns, as neutralization method. We evaluated, on the Human coronavirus 229E (HCoV 229E), the antiseptic activity of two reference molecules, chlorhexidine (CHX) and hexamidine (HXM), and of two new potent antiviral drugs: the tetra-para-sulfonatocalix[4]arene (C[4]S) and the 1,3-bis(bithiazolyl)-tetra-para-sulfonato calix[4]arene (C[4]S-BTZ). A 4 log10 reduction in viral titers is required, according to the European Standard.HXM and C[4]S showed almost no activity on the HCoV 229E. Considering the CHX, it showed a quite interesting activity, even if it did not reach the threshold to pretend to an antiseptic activity on the HCoV 229E. Finally, The C[4]S-BTZ showed a comparable activity to the CHX, and even better. Thanks to this original method, we could highlight a new interesting molecule, the C[4]S-BTZ, which showed a close activity to the CHX, but faster, residual and exempt of cytotoxicity, whereas chlorhexidine did