BAP1 est un suppresseur de tumeurs dont le nombre de partenaires protéiques rend complexe l'appréhension de son rôle dans la cellule. Chez la Drosophile, BAP1 et ASX forment le complexe Polycomb PR-DUB, qui déubiquitine l'histone H2A sur la lysine 119 afin de maintenir une répression transcriptionnelle sur ses gènes cibles. Comprendre les mécanismes de régulation de BAP1 et définir son implication au sein de la machinerie Polycomb s'avèrent donc des enjeux cruciaux pour mieux appréhender son rôle au cours de la tumorigenèse. Par des approches biochimiques, nous avons montré l'existence de plusieurs complexes fonctionnellement distincts associés à BAP1. ASXL1 semble ainsi nécessaire à l'activité H2A deubiquitinase de BAP1, tandis qu'ASXL2 forme un complexe ternaire avec BAP1 et la déméthylase d'histones KDM1B. Par ailleurs, nous avons démontré le potentiel de répresseur transcriptionnel de BAP1, qui semble posséder différents domaines répresseurs. Afin d'étudier ces aspects à l'échelle du génome, des analyses du transcriptome et de différentes marques d'histone sont en cours, dans des cellules sauvages ou mutées pour différents membres de la famille Polycomb. Dans un deuxième temps, nous avons entrepris une recherche exhaustive des substrats de BAP1. Nos résultats préliminaires suggèrent que non seulement H2A mais également H2B sont des cibles de BAP1, de même qu'un complexe protéique responsable du contrôle de la prolifération cellulaire via la régulation post-transcriptionnelle de plusieurs cyclines. Ces observations ouvrent la voie à plusieurs projets qui pourraient contribuer à expliquer les conséquences des mutations de BAP1 dans le processus tumoral. / BAP1 is as a tumor suppressor that associates to a variety of protein partners, thereby limiting the comprehension of its cellular functions. In Drosophila, BAP1 binds ASX to form the Polycomb PR-DUB complex, which deubiquitinates histone H2A on lysine 119 in order to maintain transcriptional repression on its target genes. Describing BAP1 mechanisms of action and defining how BAP1 cooperates with the Polycomb machinery are prerequisites to understand its role during tumorigenesis. Using a biochemical approach, we described the existence of several distinct subcomplexes associated with BAP1. Therefore, ASXL1 seems required for H2A deubiquitination, while ASXL2 forms a ternary complex of unknown function with BAP1 and the histone demethylase KDM1B. In addition, we demonstrated the transcriptional repressor function of BAP1, which possess several repressive domains. In addition, we are currently performing transcriptomic analysis combined with genome-wide mapping of different histone marks. These last analyses are performed in wild type cells or deficient in PR-DUB or other Polycomb components, which will help us to understand how BAP1 fits within the Polycomb machinery. In parallel, we engaged a comprehensive study aiming at the identification of new BAP1 substrates. Our preliminary results suggest that not only H2A but also H2B may be direct substrates of BAP1. In addition, we identified as a potential substrate the HNRNPM-IMP3 complex, which controls cell proliferation via post-transcriptional regulation of several cyclins. These observations pave the way for new projects that may contribute to explain the consequences of BAP1 mutations in cancer development.

BAP1 (BRCA-Associated Protein1) is a tumor suppressor gene encoding a deubiquitinating enzyme (DUB) that regulates many facets of cellular biology. Genetic studies have demonstrated that somatic BAP1 mutations occur in numerous cancer types and that germline BAP1 mutations lead to a cancer susceptibility disorder that predisposes individuals to various tumors, in particular malignant mesothelioma (MM) and both uveal melanoma (UM) and cutaneous melanoma (CM). The Testa laboratory has identified several families (including one in Louisiana, designated Lou) with germline BAP1 mutations, in which there were recurrent cases of MM, UM, and CM. We generated a Bap1 mutant mouse model with a knockin mutation identical to that observed in the Lou family (Bap1+/Lou ) to test whether this mutation alone confers susceptibility to ultraviolet (UV) light-induced melanomagenesis either alone or in combination with a mutation found in a well-established Hepatocyte Growth Factor (HGF)/Scatter Factor transgenic mouse model. Neither Bap1+/Lou, HGF, nor Bap1+/Lou;HGF mice showed a significantly higher incidence or shorter latency of UV light-induced melanoma than wild type (WT) mice. The study also suggests that germline mutation of Bap1 alone does not cause an increased incidence of UV-induced melanomas under the conditions used in this investigation. Recent evidence indicates that BAP1 participates in the DNA damage repair response, suggesting that BAP1’s role in tumorigenesis could be particularly important in cancers associated with environmental carcinogens such as ultraviolet irradiation (UVR). To further investigate the role of BAP1 (Bap1 in the mouse) in DNA damage, we first knocked down BAP1 in human melanocytes as well as Melan-A and Melan-C mouse melanocytes and then exposed the cells to UVR, followed by analysis of DNA damage repair. UVR-induced and steady state levels of DNA damage were higher in BAP1-knockdown cells compared to shGFP-control cells. Levels of UVR-related DNA damage markers such as p53, γH2AX and CPD (cyclobutane pyrimidine dimers) were increased following BAP1 loss and UVR treatment. Cell cycle analysis by flow cytometry demonstrated that cells with knockdown of BAP1 and post UVR treatment showed a higher proportion of cells in S/G2 phase. Such an effect could be due to BAP1 loss and consequent inability to repair DNA damage and/or cell cycle progression. These data are consistent with a role for BAP1 in UVR-induced DNA damage repair. In MM, it is unclear to what extent BAP1 mutations cooperate tumorigenically with mutations of other tumor suppressor genes (TSGs) implicated in MM, such as CDKN2A and NF2. While germline mutations of BAP1 clearly predispose to MM, whether somatic mutations of BAP1 drive a more aggressive, metastatic tumor phenotype may depend on the disease type. For such studies, we used conditional knockout (CKO) mice along with intrathoracic (IT) or intraperitoneal (IP) injection of adenovirus expressing Cre recombinase (Adeno-Cre) to excise critical homozygously floxed TSGs in the mesothelial lining. These labor-intensive experiments demonstrated that while homozygous deletion of Bap1, Cdkn2a, or Nf2 alone in the pleural cavity (IT) of genetically engineered mouse (GEM) models gave rise to few or no MMs, inactivation of Bap1 cooperated with loss of either Nf2 or Cdkn2a to drive development of MM in ~20% of double CKO mice, and a high incidence (22/26, 85%) of MMs with short latency (12 weeks) was observed in Bap1;Nf2;Cdkn2a (triple)-CKO mice. The same trend was confirmed when the same gene combinations were homozygously deleted IP in these same GEM models, except that a much higher incidence of MM was observed in homozygously floxed Bap1 (Bap1f/f) mice injected IP versus IT, which may be due to a larger cell surface area of the peritoneum. Adeno-Cre treatment of normal mesothelial cells from Bap1f/f;Nf2 f/f;Cdkn2 f/f mice, but not from mice with knockout of one or any two of these tumor suppressor genes, resulted in robust spheroid formation in vitro, suggesting that homozygous deletion of all three of these TSGs is sufficient to drive a cancer stem cell-like potential. RNA-seq analysis of pleural MMs from triple-CKO mice revealed enrichment of many genes transcriptionally regulated by the polycomb repressive complex 2 (PRC2). Other genes upregulated in MMs from triple-CKO mice included Vegfd and Pak3, which encode proteins involved in angiogenic and cell motility pathways. In conclusion, we hypothesize that inherited mutations of BAP1 may increase susceptibility to certain environmental factors that may induce DNA damage and contribute to cancer development. Our data also indicate that cooperative somatic inactivation of Bap1, Nf2, and Cdkn2a results in rapid, highly aggressive MMs, and that deletion of Bap1 contributes to tumorigenesis, in part, by loss of PRC2-mediated gene repression of tumorigenic target genes and by acquisition of stem-cell potential. Thus, our studies suggest a potential avenue for therapeutic intervention. / Biomedical Sciences

No description available.

L’activation des lymphocytes T (LT) CD8 naïfs mène à leur différenciation en deux sous-populations d'effecteurs, les SLEC (short-lived effector cells) et MPEC (memory precursor effector cells). Après contrôle de l’infection, les SLEC meurent par apoptose tandis que les MPEC deviennent des cellules mémoires qui protègent contre la réinfection. Peu de choses sont connues sur le rôle des mécanismes post-traductionnels, tel que la déubiquitination lors de la différenciation des LT CD8+. La déubiquitinase (DUB) BAP1 joue un rôle clé dans la différenciation thymique et dans le maintien des populations de LT matures. Elle interagit avec plusieurs partenaires comme YY1 et EZH2 dans des cellules autres que les LT. Certains de ces partenaires ont des rôles importants dans la biologie des LT CD8 notamment en contexte infectieux suggérant que BAP1 régule la réponse des LT CD8+ lors d’une infection. Afin de tester cela, des LT CD8 OT-I spécifiques pour le peptide ovalbumine dans lesquelles BAP1 a été surexprimé ont été transférés dans des souris infectées avec la bactérie Listeria monocytogenes codant pour l’ovalbumine (LM-OVA). Nos résultats au pic de la réponse démontrent un défaut de l’expansion clonale des LT CD8+, de la différenciation en SLEC et une augmentation de la différenciation en MPEC. Nous observons aussi une augmentation de la différenciation en LT centrale mémoire (TCM) au stade mémoire. Finalement, nous évaluerons aussi l’impact de la délétion de Bap1 dans la réponse des LT CD8+. Cela contribuera à une meilleure compréhension du rôle de l’ubiquitination dans la biologie des LT CD8+ dont l’importance est centrale dans la réponse face aux infections et au cancer. / Following antigen recognition, naive CD8+ T cells expand massively and differentiate into effector cells. After pathogen clearance, the short-lived effector cells (SLECs) die while memory precursor effector cells (MPECS) persist and differentiate into memory T cells to confer long-term protection against reinfection. The transcriptional network controlling the SLEC/MPEC differentiation is well characterized but little is known about the role of posttranslational modifications, such as deubiquitination, in this process. The deubiquitinase BAP1 interacts with multiple partners including YY1 and EZH2 that are important for CD8+ T cell response. BAP1 has been shown to participate in thymic differentiation and in the maintenance of mature peripheral T cells. However, the function of BAP1 during CD8+ T cell response to infection is unknow. To address this, we overexpressed BAP1 wild type (WT) in ovalbumin-specific (OT-I) CD8+ T cells by retroviral transduction and analysed their response after adoptive transfer into mice infected with Listeria monocytogenes encoding ovalbumin. The overexpression of BAP1 WT severely reduced CD8+ T cell expansion, SLEC differentiation and functionality. It also induces enhanced MPEC differentiation. In fact, we observed an increase in central memory CD8 T cell (TCM) differentiation 30 days following infection. Finally, we confirmed the presence of key partners of BAP1 complex in activated and naïve CD8+ T cells. As next steps, we will analyse the impact of BAP1-deficiency in CD8+ T cell response to infection. This will contribute to a better understanding of the role of deubiquitination in CD8+ T cell response

Le mésothéliome est une tumeur maligne rare des séreuses, au pronostic sombre, dont le facteur de risque principal connu est l’exposition à l’amiante. Il se déclare avec un temps de latence d’environ 30 ans après le début de l’exposition, atteint principalement la plèvre et touche majoritairement les hommes. L’analyse de cette pathologie, reconnue comme une maladie professionnelle et pour laquelle une Déclaration Obligatoire de maladie a été instituée en janvier 2012, s’est focalisée jusqu’alors essentiellement sur l’homme, tant sur le plan épidémiologique que sur le plan biologique. Il apparaît pourtant dans la littérature internationale des différences notables par sexe.Ces constations posent la question d’investiguer d’autres facteurs de risque, en particulier l’hypothèse d’une prédisposition génétique, les mécanismes biologiques intervenant dans les voies de la carcinogenèse du mésothéliome étant partiellement connus. Ceci incite à étudier les facteurs épidémiologiques, cliniques, biologiques et immunohistochimiques, prédisposant chez la femme au développement du mésothéliome pleural et péritonéal, et d’évaluer leurs impacts pronostiques, à partir des cas diagnostiqués entre 1998 et 2013, issus de la plus importante base de données française. Elle incite également à établir un état des lieux épidémiologique actualisé par sexe en France pour le mésothéliome pleural et péritonéal ; ces données étant inexistantes pour la France pour le péritoine. / Mesothelioma is a rare malignant serous tumor with a poor prognosis of which asbestos exposure is the major known risk factor. It occurs with a latent period about 30 years after exposure, reaches mainly the pleura and affects mainly the men. The study of this pathology, recognized as an occupationnal disease and for which a Mandatory Declaration of Disease was introduced in January 2012, focused until then mainly on men, both epidemiologically and biologically. However, there are significant gender differences in the international literature.These results raise the question of investigating other risk factors, in particular the hypothesis of genetic predisposition, the biological mechanisms involved in mesothelioma carcinogenesis pathways being partially known. This encourages the study of epidemiological, clinical, biological and immunohistochemical factors predisposing women to the development of pleural and peritoneal mesothelioma, and to evaluate their prognostic impacts, based on cases diagnosed between 1980 and 2015, from the largest French database. It also encourages the establishment of an updated epidemiological inventory by gender in France for pleural and peritoneal mesothelioma; these data are non-existent for peritoneum.

Le Mélanome Uvéal (MU) est la tumeur de l’œil la plus fréquente dans les adultes. Aucune thérapie pour la prévention ou le soins des métastases a donné preuve d’efficacité. Nous avons établi 7 lignées cellulaires de MU à partir soit de la tumeur du patient soit du matériel tumorale provenant de xénogreffes dérivées de patients (Patient-derived Xenografts, PDXs). Ces lignées cellulaires présentent les altérations cytogénétiques et les mutations « drivers » qui ont été jusqu’au présent identifiées dans la maladie; quatre d’entre elles présentent une déficience de la protéine BAP1 (BRCA1 associated protein-1), l’ altération qui caractérise la progression tumorale dans le MU. Cette collection de lignées a été utilisée pour identifier des nouvelles stratégies thérapeutiques. Une analyse in vitro avec une série d’inhibiteurs specifiques des vois de signalisation MEK/ERK, PKC, et PI3K/mTOR a montré l’efficacité de l’inhibiteur de mTOR Everolimus sur la prolifération cellulaire, effet qui a été confirmé dans 4 PDXs ou le composé a ralenti significativement la croissance cellulaire. Nous avons ensuite effectué une analyse systématique de la synergie en combinant les inhibiteurs. La synergie la plus importante est produite par l’association d’ Everolimus et de l’inhibiteur de PI3K GDC0941, résultat confirmé par une forte augmentation de l’apoptose quand les 2 drogues sont utilisées en combinaison. Pour conclure nous avons établi un instrument utile pour l’étude préclinique du MU . Nos résultats montrent que Everolimus est efficace dans l’inhibition de la croissance de MU in vitro et in vivo et que la combinaison d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de PI3K est très efficace dans l’induction de l’apoptose des cellules de MU. Enfin, des dérivées de la vitamine D pourraient exercer un effet antiprolifératif spécifique sur les MU avec mutation de BAP1. / Uveal melanoma (UM) is the most common primary tumor of the eye in adults. There is no standard adjuvant treatment to prevent metastasis and no effective therapy in the metastatic setting. We have established a unique panel of 7 UM cell lines from either patient’s tumors or patient-derived tumor xenografts (PDXs). These cell lines bear the cytogenetic alterations and driver mutations associated with UM so far. Importantly four of them display BAP1 (BRCA1 associated protein-1) deficiency, the hallmark of tumor progression in UM. We used this panel of cell lines to identify novel therapeutic strategies for UM patients. In vitro analysis of a series of specific inhibitors of the MEK/ERK, PKC and PI3K/mTOR pathways showed the efficacy of mTOR inhibitor Everolimus in reducing the viability of UM cell lines, a finding confirmed by significantly delayed tumor growth in 4 PDXs. We then preformed a systematic analysis of drug synergy examining the effect of combinations of the selected inhibitors. The best synergy was found with PI3K inhibitor GDC0941 and Everolimus. This was confirmed by a strong increase in apoptosis with this drug combination. In conclusion we have established an useful tool for performing preclinical studies in UM . Our results show that Everolimus efficiently inhbits UM growth in vitro and in vivo, and that mTOR inhibition coupled with PI3K inhibition is a highly effective in inducing apoptosis in UM cells. Finally Vitamin D derivatives might possibly exert a specific anti proliferative effect on BAP1 mutated UM cell lines.

Les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l’OGlcNAcylation et l’ubiquitination jouent des rôles critiques dans la coordination des fonctions protéiques et par conséquent influencent grandement de nombreux processus cellulaires. Il est à noter que ces modifications sont hautement dynamiques et finement regulées. Par exemple, l’ubiquitination peut être réversible via l’action des déubiquitinases comme le suppresseur de tumeurs BAP1. Parmis les gènes codant pour les déubiquitinases, BAP1 est la plus souvent mutée dans le cancer. Des études récentes ont démontré l’importance des dynamiques de modifications post-traductionnelles dans la régulation du complexe BAP1. En plus, BAP1 forme un complexe multi-protéiques contenant plusieurs régulateurs transcriptionnels comme la protéine polycomb OGT et les facteurs de transcription FOXK1 et FOXK2. OGT est une enzyme unique qui catalyze l’ajout d’un groupement O-GlcNAc sur ses substrats afin d’en moduler l’activité enzymatique, les interactions protéines-protéines et leur localisation cellulaire. Cette modification est aussi liée au métabolisme puisque son substrat donneur, l’UDP-GlcNAc, est dérivé de la voie biosynthétique des hexosamines. Parallèlement, FOXK1/2 ont aussi été démontrés comme étant critiques à des processus métaboliques telles que la myogenèse et l’autophagie. Lors de nos études, nous avons identifié FOXK1 comme un nouveau substrat d’OGT. De plus, les niveaux d’O-GlcNAcylation de FOXK1 fluctuent lors de l’entrée/sortie du cycle cellulaire. En outre, nous avons identifié l’importance de FOXK1 dans l’adipogenèse et observé que l’interaction FOXK1/BAP1 est affectée par le métabolisme cellulaire. En résumé, nos études ont révélé l’importance d’OGT dans la régulation de certaines composantes du complexe BAP1, ce qui aidera à la compréhension de l’effet suppresseur de tumeur de BAP1 ainsi que son mécanisme d'action dans différents processus tel que le remodelage de la chromatine. / Post-translational modifications such as phosphorylation, O-GlcNAcylation and ubiquitination play critical roles in coordinating protein function and are therefore involved in diverse cellular processes. Of relevance here, ubiquitination may be removed by deubiquitinases such as the tumour suppressor BAP1, which represents the most mutated deubiquitinase gene in the human genome. Recent studies have revealed that important and dynamic post-translational modifications regulate several functions of the BAP1 complex. Indeed, BAP1 has been shown to form a multi-protein complex with several transcriptional regulators including the polycomb group protein OGT and the transcription factors FOXK1 and FOXK2. OGT is a unique enzyme that catalyzes the addition of an O-GlcNAc moiety to target proteins, which impacts protein function including enzymatic activity, protein-protein interactions and subcellular localization. This modification is also highly linked to cellular metabolism, as the donor substrate for the reaction, UDP-GlcNAc, is derived from the hexosamine biosynthesis pathway. Similarly, FOXK1 and FOXK2 have been shown to be implicated in metabolic processes such as myogenesis and autophagy. During our studies, we identified FOXK1 but not FOXK2 as a novel substrate of OGT. Further, we found that this OGlcNAcylation is modulated during the entry/exit of cell cycle. We also found that FOXK1 is critical for adipogenesis and that the interaction between FOXK1/BAP1 is compromised during nutrient starvation. Thus, our studies have revealed that OGT selectively modulates and regulates components of the BAP1 complex which may impact different cellular processes, notably chromatin remodelling and could help understanding how BAP1 acts as a tumor suppressor.

L’O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle qui consiste en l’ajout covalent du N-acetylglucosamine au groupement hydroxyle des sérines et thréonines des protéines nucléaires et cytoplasmiques. Ce type de glycosylation atypique est régulé de manière très dynamique par l’action de l’O-GlcNAc transférase (OGT) et de l’O-GlcNAcase (OGA) qui catalysent et hydrolysent cette modification respectivement. Aujourd’hui, OGT émerge comme un régulateur transcriptionnel et senseur critique du métabolisme où les protéines ciblées par l’O-GlcNAcylation couvrent la presque totalité des voies de signalisation cellulaire. Récemment, des études ont aussi proposé qu’OGT soit impliquée dans la régulation épigénétique par l’O-GlcNAcylation des histones. Dans le but de caractériser le rôle fonctionnel d’OGT dans la régulation épigénétique, nous avons revisité le concept d’O-GlcNAcylation des histones et, de manière surprenante, n’avons pu confirmer cette observation. En fait, nos données indiquent que les outils disponibles pour détecter l’O-GlcNAcylation des histones génèrent des artéfacts. De ce fait, nos travaux supportent plutôt un modèle où la régulation épigénétique médiée par OGT se fait par l’O-GlcNAcylation de régulateurs transcriptionnels recrutés à la chromatine. Parmi ceux-ci, OGT s’associe au complexe suppresseur de tumeurs BAP1. En étudiant le rôle d’OGT dans ce complexe, nous avons identifié le facteur de transcription FOXK1 comme un nouveau substrat d’OGT et démontrons qu’il est régulé par O-GlcNAcylation durant la prolifération cellulaire. Enfin, nous démontrons que FOXK1 est aussi requis pour l’adipogenèse. Ensemble, nos travaux suggèrent un rôle important d’OGT dans la régulation du complexe BAP1. / O-GlcNAcylation is a post-translational modification which consists in the covalent addition of an N-acetylglucosamine sugar to the hydroxyl group of serine and threonine residues of nuclear and cytoplasmic substrates. This atypical glycosylation is regulated in a very dynamic manner through the action of the O-GlcNAc transferase (OGT) and the O-GlcNAcase (OGA) that catalyze and hydrolyze this modification respectively. OGT has emerged as a critical transcriptional regulator and sensor of metabolism whereby proteins targeted by O-GlcNAcylation cover several cell signaling pathways. Recently, studies have also suggested that OGT may be involved in epigenetic regulation through the O-GlcNAcylation of histones. For the purpose of characterizing the functional role of OGT in epigenetic regulation, our group revisited the concept of histone O-GlcNAcylation and surprisingly, our work could not confirm this observation. In fact, our data indicate that the available tools for histone O-GlcNAcylation detection generate artifacts. Consequently, our work rather supports a model whereby OGT-mediated epigenetic regulation is indirectly achieved through O-GlcNAcylation of chromatin-associated transcriptional regulators. Among these, OGT strongly associates with the BAP1 tumor suppressor complex. Thus, by focusing on the role of OGT in this complex, we identified the transcription factor FOXK1 as a novel substrate of OGT and demonstrate that it is regulated throught O-GlcNAcylation during cell proliferation. Finally, we demonstrate that FOXK1 is also required for adipogenesis. Taken together, these data suggest an important role of OGT in regulating the BAP1 complex.

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle majeur dans la régulation d’une multitude de processus cellulaires. Dans cette thèse, je discuterai de la caractérisation de deux protéines, BRCA1 et BAP1, soit deux suppresseurs de tumeurs fonctionnellement reliés. BRCA1, une ubiquitine ligase qui catalyse la liaison de l’ubiquitine à une protéine cible, est mutée dans les cancers du sein et de l'ovaire. Il est bien établi que cette protéine aide à maintenir la stabilité génomique suite à un bris double brin de l’ADN (BDB), et ce, à l’aide d’un mécanisme de réparation bien caractérisé appelé recombinaison homologue. Cependant, les mécanismes de régulation de BRCA1 suite à des stresses génotoxiques n’impliquant pas directement un BDB ne sont pas pleinement élucidés. Nous avons démontré que BRCA1 est régulée par dégradation protéasomale suite à une exposition des cellules à deux agents génotoxiques reconnus pour ne pas directement générer des BDBs, soit les rayons UV, qui provoquent la distorsion de l’hélice d’ADN, et le méthyle méthanesulfonate (MMS), qui entraîne l’alkylation de l’ADN. La dégradation de BRCA1 est réversible et indépendante des kinases associées à la voie des PI3 kinase, soit ATM, ATR et DNA-PK, protéines qui sont rapidement activées par les dommages à l’ADN. Nous proposons que la dégradation de BRCA1 prévienne son recrutement intempestif, ainsi que celui des facteurs qui lui sont associés, à des sites de dommages d’ADN qui ne sont pas des BDBs, et que cette régulation coordonne la réparation de l’ADN. L’enzyme de déubiquitination BAP1 a initialement été identifiée comme une protéine capable d’interagir avec BRCA1 et de réguler sa fonction. Elle est également connue pour sa capacité à se lier avec les protéines du groupe Polycomb, ASXL1 et ASXL2. Cependant, l’importance de ces interactions n’a toujours pas été établie. Nous avons démontré que BAP1 forme deux complexes protéiques mutuellement exclusifs avec ASXL1 et ASXL2. Ces interactions sont critiques pour la liaison de BAP1 à l’ubiquitine ainsi que pour la stimulation de son activité enzymatique envers l’histone H2A. Nous avons également identifié des mutations de BAP1 dérivées de cancers qui empêchent à la fois son interaction avec ASXL1 et AXSL2, et son activité de déubiquitinase, ce qui fournit un lien mécanistique direct entre la déubiquitination de H2A et la tumorigenèse. Élucider les mécanismes de régulation de BRCA1 et BAP1 menera à une meilleure compréhension de leurs rôles de suppresseurs de tumeurs, permettant ainsi d’établir de nouvelles stratégies de diagnostic et traitement du cancer. / Ubiquitination is a post-translational modification that plays major roles in regulating a plethora of cellular processes. In this thesis, I will discuss the biochemical and functional characterization of two functionally related proteins, BRCA1 and BAP1, both of which are important tumor suppressors. BRCA1, an ubiquitin ligase that catalyzes the attachment of ubiquitin to target proteins, is mutated in breast and ovarian cancers. BRCA1 roles in maintaining genomic stability following DNA double strand breaks (DSBs) by promoting the homologous recombination repair pathway is well established. However, how BRCA1 is regulated following genotoxic stress that does not directly involve DSBs is still not fully elucidated. We showed that BRCA1 is downregulated, through proteasomal degradation, following exposure of the cells to the DNA helix distorting agent UV or the DNA alkylating agent Methyl Methanesulfonate (MMS), two DNA damaging agents that do not directly generate DSBs. BRCA1 downregulation is reversible and is independent of the PI3 kinase related kinases, ATM, ATR or DNA-PK which constitute primary responders that are rapidly activated by DNA damage. We proposed that BRCA1 downregulation prevents the untimely recruitment of BRCA1 and associated factors to DNA damage sites that are not DSBs, thus coordinating the DNA damage/repair response. The deubiquitinating enzyme BAP1 was initially identified as an interacting protein that regulates the function of BRCA1. BAP1 is also known to interact with the Polycomb group proteins ASXL1 and ASXL2. However, the importance of this interaction was not fully understood. We showed that BAP1 forms two mutually exclusive complexes with ASXL1 and ASXL2. These interactions are critical for BAP1 binding to ubiquitin and stimulation of its deubiquitinase activity towards histone H2A. We also identified cancer-derived mutations of BAP1 that abrogate its interaction with ASXL1 and ASXL2 and deubiquitinase activity, which provide a direct mechanistic link between H2A deubiquitination and tumorigenesis. Elucidating how BRCA1 and BAP1 are regulated will lead to a better understanding of their roles as tumor suppressors and this will in turn help establishing improved diagnostic and therapeutic strategies to treat cancer.

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle central dans divers processus biologiques. Elle peut être contrecarrée par les déubiquitinases (DUBs). "BRCA1-Associated Protein 1" (BAP1) est une déubiquitinase, qui fait partie de complexes multiprotéiques, possèdant une fonction de suppression tumorale ainsi qu'un potentiel anti-métastatique. De plus, BAP1 est phosphorylée suite aux dommages à l’ADN par les kinases ATM/ATR. En nous basant sur ces données, nous avons purifié les protéines associées à BAP1 dans des conditions de stress génotoxique. Bien que la composition du complexe et l’activité DUB semblent inchangées, nous avons pu identifier des changements critiques dans les niveaux et les sites de phosphorylation, confirmant la régulation de BAP1 suite aux dommages à l’ADN. En déplétant BAP1 par ARNi et en utilisant des mutants dominants négatifs, nous avons obtenu des résultats suggèrant que suite au stress génotoxique, cette DUB est requise pour prolonger le point de contrôle en G2/M et ce, en retardant la reprise du cycle cellulaire. D'un autre côté, l'expression de BAP1 dans des cellules cancéreuses qui en sont déficientes restore une ploïdie normale et diminue la fréquence d'aberrations nucléaires, suggérant que cette protéine joue un rôle dans la stabilité génomique. Nos résultats suggèrent fortement que BAP1 joue un rôle dans la réponse des cellules au stress génotoxique et la stabilité génomique. Nos travaux permettront ainsi d’identifier et de caractériser les voies de signalisation cellulaire régulant l’activité et la fonction de BAP1 durant les périodes d’exposition à des agents qui endommagent l’ADN. Les connaissances acquises seront donc d’une valeur tangible pour nôtre compréhension de la mutagenèse induite par des agents carcinogènes, un déterminant clé de la formation des tumeurs. / Ubiquitination is a reversible, covalent post-translational modification that regulates protein function and as such plays crucial roles in a wide range of physiological processes. Importantly, gain- or loss-of-function mutations in components of the ubiquitin system have been causally linked to tumorigenesis. The reverse reaction of ubiquitination is catalyzed by deubiquitinases (DUBs), a family of enzymes that removes ubiquitin from proteins. BRCA1-Associated Protein 1 (BAP1) is a deubiquitinase known to be a tumor suppressor and anti-metastatic protein since deletions and rearrangements are observed in a wide range of tumors. However, little is known about how BAP1 works into the cells. Here, we show that BAP1 is hyperphosphorylated after DNA damage by gamma radiations and ultraviolet light, probably by ATM and/or ATR. Moreover, we found that BAP1 depletion cause a defect in the maintenance of the G2/M checkpoint after gamma radiation, suggesting that BAP1 is required to maintain the arrest after DNA damage. This delay is important to allow DNA repair and to prevent genomic instability. Consistently, we found that BAP1 expression in BAP1 deficient cells restore normal diploidy and prevent nuclear aberrations, suggesting that BAP1 links DNA damage induced checkpoint regulation to genomic stability: two important processes for carcinogenesis. These findings provide new insights into the role of deubiquitination in cell signaling and neoplastic transformation.