Les mélanomes oculaires sont des tumeurs rares représentant environ 5% des mélanomes. Les mélanomes oculaires peuvent provenir de deux tissus : l’uvée (~500 cas/an en France) et la conjonctive (~30 cas/an). Les mélanomes uvéaux présentent un très faible taux de mutations somatiques. Ces tumeurs sont également porteuses d’altérations du nombre de copies caractéristiques (gains du 8q, 1q, 6p, pertes du 3, du 1p, du 6q ou du 8p). L’évolution du génome de ces tumeurs durant la progression métastatique est à ce jour mal décrit. Afin d’explorer l’évolution métastatique du mélanome uvéal, nous avons séquencé les exomes de 14 tumeurs primaires et 79 métastases provenant de 24 patients. Il existait une grande proximité génétique entre tumeurs primaires et métastases avec une médiane de 11,5 mutations dans les tumeurs primaires, et 14 dans les métastases. Bien que les mutations SF3B1 et EIF1AX soient des facteurs pronostiques majeurs dans les mélanomes uvéaux, leurs fréquences dans les métastases étaient similaires à celle observée dans les séries historiques de tumeurs primaires. Les métastases présentaient quelques altérations de nombre de copies supplémentaires par rapport aux tumeurs primaires correspondantes. Parmi les altérations du nombre de copies les plus souvent acquises lors du processus métastatique, les gains du 8q étaient présents dans 92% des métastases. Lors de ce travail, nous avons découvert un mélanome uvéal présentant un phénotype hypermuté CpG>TpG chez une patiente ayant présenté une réponse exceptionnelle à une immunothérapie anti-PD1. Ce phénotype hypermutateur a été expliqué par une mutation germinale délétère de MBD4 (Methyl-CpG Binding Domain 4) avec une inactivation bi-allélique dans la tumeur. Deux autres tumeurs hypermutées CpG>TpG porteuses d’une mutation de MBD4 germinale, un mélanome uvéal et un glioblastome, ont été identifiées dans les bases de données publiques. La biologie des mélanomes conjonctivaux et leurs profils génomiques sont mal connus. Nous avons séquencé les génomes de 6 tumeurs, puis procédé à un séquençage ciblé de 47 autres tumeurs. Nous avons montré que ces tumeurs présentent un profil hypermuté C>T induit par l’exposition aux ultra-violets. Ces tumeurs présentaient un profil de mutations proche des mélanomes cutanés avec une fréquence moindre de mutations BRAF (33%), et des mutations plus spécifiques des mélanomes muqueux telles que des mutations activatrices de KIT et SF3B1 dans les mélanomes conjonctivaux non exposés au soleil. Nous avons également identifié des mutations de CTNNB1 dans les tumeurs développées sur des nevi conjonctivaux. L’ensemble de ces travaux illustrent comment la description moléculaire des tumeurs rares permet d’envisager de nouvelles stratégies de médecine de précision. / Ocular melanomas are rare tumors representing about 5% of all melanomas. Ocular melanomas may arise from two tissues: the uvea (~ 500 cases / year in France) and the conjunctiva (~ 30 cases / year). Uveal melanomas have a very low rate of somatic mutations. These tumors also carry specific distinctive copy number alterations (gains of 8q, 1q, 6p, losses of 3, 1p, 6q or 8p). The evolution of the genome of these tumors during metastatic progression has been poorly described.To explore the metastatic evolution of uveal melanoma, we whole-exome sequenced 14 primary tumors and 79 metastases from 24 patients. Primary tumors and metastases presented close genetic profiles with a median of 11.5 mutations in primary tumors, and 14 in metastases. Although SF3B1 and EIF1AX mutations are major prognostic factors in uveal melanomas, their frequencies in metastases were similar to those observed in historical primary tumors. The metastases showed some additional copy number alterations compared to the corresponding primary tumors. Among the alterations acquired during the metastatic process, 8q gains were present in 92% of metastases.Thanks to this work, we found a uveal melanoma with a CpG> TpG hypermutated phenotype in a patient who had an exceptional response to anti-PD1 immunotherapy. This hypermutated phenotype was explained by a deleterious germline mutation of MBD4 (Methyl-CpG Binding Domain 4) with bi-allelic inactivation in the tumor. Two other hypermuted CpG> TpG tumors with germline MBD4 mutation, a uveal melanoma and a glioblastoma, were identified in public databases.The biology of conjunctival melanomas and their genomic profiles have been scarcely described. We sequenced the genomes of 6 tumors and then target-sequenced 47 other tumors. We showed that these tumors had a C> T hypermuted profile induced by ultraviolet exposure. These tumors presented a pattern of mutations close to cutaneous melanomas with a lower frequency of BRAF mutations (33%), and mutations that were more specific of mucosal melanomas such as activating mutations of KIT and SF3B1 in conjunctival melanomas not exposed to the sun. We also identified CTNNB1 mutations in tumors developed on conjunctival nevi.All of these works illustrate how the molecular description of rare tumors opens new avenues for precision medicine.

Le mélanome uvéal (MU) est une tumeur rare, affectant 500 à 600 nouveaux cas par an en France, mais il s’agit de la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Cette tumeur est due à la transformation des mélanocytes dérivés de la crête neurale et localisés dans l’uvée (choroïde, corps ciliaire et iris). C’est une tumeur très agressive puisque, malgré le traitement de la tumeur primaire, jusqu’à 50% des patients développeront des métastases hépatiques. En effet, malgré les nombreux efforts fournis pour le développement de nouvelles thérapies, celles-ci se sont révélées jusqu’à présent peu efficaces. Ainsi, une meilleure compréhension du processus métastatique et l’identification des gènes impliqués dans celui-ci sont des enjeux importants pour permettre le développement de nouvelles thérapies. Une analyse transcriptomique réalisé dans le laboratoire a permis d’identifier la phosphatase PRL-3 dont la surexpression est en corrélation avec le développement métastatique et le mauvais pronostic de survie des patients. Des études fonctionnelles ont montré que les cellules de MU exprimant PRL-3 avaient une capacité de migration et d’invasion accrue par rapport aux cellules exprimant une forme mutante catalytiquement inactive de la phosphatase. L’implication de PRL-3 dans le développement tumoral et le processus métastatique a été très largement décrite dans de nombreux cancers et son mécanisme d’action et ses cibles sont en cours d’investigation. De façon intéressante, certaines cibles de PRL-3 sont des protéines liées au cytosquelette. Dans le but d’identifier de nouvelles cibles de PRL-3 dans le MU, nous avons réalisé une analyse phosphoprotéomique qui nous a permis de mettre en évidence la protéine CRMP2. CRMP2 est une protéine liée au cytosquelette dont le rôle a majoritairement été décrit dans le système nerveux. CRMP2 joue un rôle dans le guidage axonal, l’extensition des neurites, la dynamique des microtubules et le trafic vésiculaire. Au cours de ma thèse, j’ai pu confirmer que dans les cellules de MU, PRL-3 modifie l’état de phosphorylation de CRMP2 en particulier sur les résidus T514 et S522. De plus, CRMP2 et PRL-3 interagisse et cette interaction aboutit à une diminution de la phosphorylation de CRMP2 sur le T514, ce qui suggère que CRMP2 est une cible directe de PRL-3. Des études fonctionnelles ont montré que l’extinction de CRMP2 par ARN interférent augmente la vitesse de migration et l’invasion des cellules de MU qui expriment PRL-3. CRMP2 est donc un frein à la migration et l’invasion des cellules de MU. La migration et l’invasion accrue dans ces cellules sont corrélées à un réarrangement du réseau d’actine avec une diminution des fibres de stress. L’étude des propriétés micro-rhéologiques des cellules de MU montre également que l’expression de PRL-3 et/ou l’extinction de CRMP2 augmente la viscosité, l’élasticité et la dureté du cytoplasme. L’extinction de CRMP2 ne modifie pas ces propriétés dans les cellules exprimant déjà PRL-3 ce qui montre que l’effet de l’extinction de CRMP2 est équivalent à celui de déphosphorylation. Enfin, dans les tumeurs l’expression de CRMP2 est associée à un bon pronostic de survie. Au cours de ma thèse, j’ai également participé à la création d’une carte du réseau d’interaction des molécules et des voies de signalisation impliquant PRL-3 dans le développement du cancer dans le cadre du projet NaviCell. Cette carte a été intégrée à la base de donnée ACSN. / Uveal melanoma (UM) is a rare tumor (500 to 600 new cases by year in France) but this is the most common intraocular cancer in adult. This tumor is due to melanocytes transformation derived from neural crest and localized in uvea (choroid, ciliary body and iris). Despite the primary tumor treatment, up to 50% of patients will develop metastases mostly localized in liver within the years following diagnosis. The median survival rate of metastasis formation is only six months. Indeed, there are currently no effective treatments against metastasis. Therefore, a better comprehension of UM metastatic process and identification of the genes involved are major issues for the development of new therapies. A transcriptomic analysis done in our laboratory allows to identify the phosphatase PRL-3 whose overexpression is correlated with metastatic development and patients poor prognosis. Besides being a bad prognosis marker, functional studies showed that UM cells expressing PRL-3 migrate faster and are more invasive than cells expressing the catalytic dead mutant of the phosphatase. The role of PRL-3 in tumorigenesis and metastatic development is well described, and numerous studies investigate his mechanism of action and his intracellular substrates. Interestingly, some of the identified PRL-3’s targets are cytoskeletal proteins. In order to identify new PRL-3’s targets in UM, we realized a phosphoproteomic analysis that allows us to identify CRMP2. CRMP2 is a cytoskeletal protein that has been mostly described in the nervous system. CRMP2 plays a role in axonal guidance, neuritis extension, microtubules dynamics and vesicular trafficking. During my PhD, I confirmed that in UM cells, PRL-3 expression modify the phosphorylation state of CRMP2 in particular on T514 and S522 residues. Moreover, CRMP2 and PRL-3 interact together and CRMP2 is less phosphorylated on the T514 following the interaction, which suggests that CRMP2 is a target of PRL-3. Furthermore, we showed that CRMP2 KO by shRNA increases UM cells velocity and invasion in cells expressing PRL-3. So CRMP2 is a brake to the migration and invasion process in UM cells. These observations are correlated with a reorganization of actin cytoskeleton with a reduction of stress fibers. The study of the microrheological properties of UM cells showed that PRL-3 expression and/or CRMP2 KO increases the viscosity, elasticity and stiffness of the cytoplasm. CRMP2 KO changes these properties only when PRL-3 is not functional which suggests that concerning the micro-rheology, CRMP2 KO is equivalent the its dephosphorylation by PRL-3. Finally, in UM tumors, CRMP2 expression are correlated with good survival prognosis. My PhD also gave me the opportunity to participate to the creation of a map about interactions and signaling pathways involving PRL-3 in cancers as part of the NaviCell project. This map was integrated in ASCN database.

Le mélanome uvéal constitue le cancer intraoculaire le plus fréquent chez l’adulte. Il s’agit d’un cancer très agressif puisque plus de 50% des patients développent des métastases principalement localisées au niveau du foie. Dans le but d’identifier des gènes pronostiques de développement métastatique, nous avons comparé le transcriptome de 28 tumeurs de mélanome uvéal issues de patients ayant développé des métastases dans les trois années qui ont suivi l’énucléation et 29 tumeurs issues de patients n’ayant pas développé de métastases ou ayant développé des métastases après 36 mois. Le gène PTP4A3/PRL-3 (protein tyrosine phosphatase type IV member 3/Protein of Regenerating Liver-3) a été identifié comme prédictif de l’apparition de métastases. Il code une phosphatase et sa surexpression dans des cellules de mélanome uvéal augmente leur migration in vitro et leur invasivité in vivo. Les évènements protéolytiques à la surface des cellules sont essentiels pour la migration et l’invasivité durant plusieurs processus physiologiques ou pathologiques tels que le développement de métastases. Ces évènements sont assurés par les métalloprotéases (MMPs) qui sont responsables de la dégradation et du remodelage de la matrice extracellulaire.Dans la première partie de cette thèse, nous avons observé que la métalloprotéase transmembranaire MT1-MMP est enrichie à la surface des cellules de mélanome uvéal OCM-1, des cellules MP41 issues de xénogreffes de tumeurs de mélanome uvéal humaines ou dans des tumeurs primaires de mélanome uvéal, surexprimant PTP4A3. Nous avons aussi observé que cette accumulation de MT1-MMP à la surface des cellules de mélanome uvéal est accompagnée d’une accumulation de la sécrétion de MMP2 dans le milieu extracellulaire des cellules exprimant PTP4A3. De plus, nous avons montré que PTP4A3 et MT1-MMP s’associent physiquement et que le trafic vésiculaire de MT1-MMP est accéléré dans les cellules exprimant PTP4A3 mais pas dans celles exprimant le mutant catalytique inactif PTP4A3(C104S). Enfin, nous avons démontré que l’inhibition de l’expression de MT1-MMP dans les cellules exprimant PTP4A3 diminue leur migration in vitro et leur invasivité in vivo. Pour conclure, nos résultats indiquent que PTP4A3 agit en amont de MT1-MMP à travers une accélération de son trafic vésiculaire et son accumulation à la surface des cellules afin de promouvoir la migration et l’invasivité cellulaires.Dans la deuxième partie de cette thèse, nous nous sommes intéressés au rôle de PTP4A3 pendant le développement embryonnaire. Les mélanocytes, incluant ceux de l’uvée, dérivent de la crête neurale pendant le développement embryonnaire. Nous avons alors supposé que la fonction de PTP4A3 pendant la progression métastatique pourrait refléter un rôle de la phosphatase dans la migration des cellules de crête neurale pendant le développement embryonnaire. Dans cette partie de la thèse, nous avons montré que PTP4A3 joue un rôle important dans la migration des cellules de crête neurale céphalique pendant le développement de l’embryon de Xenopus laevis. La perte de fonction de PTP4A3 provoque une réduction du territoire de la crête neurale, alors que le gain de fonction de cette phosphatase élargit les faisceaux de migration des cellules de crête neurale céphalique. De plus, des expériences d’isogreffes montrent que les explants de crête neurale dépourvus de l’expression de PTP4A3, sont incapables de migrer dans les embryons greffés. Plus encore, l’inhibition pharmacologique de PTP4A3 dans des cellules de crête neurale en culture diminue de façon significative leur vitesse de migration in vitro. Les résultats de cette étude démontrent que PTP4A3 est requise pour la migration des cellules de crête neurale céphalique in vivo pendant le développement embryonnaire de Xenopus laevis. Donc, les effets pro-migratoire et -invasif reliés à l’expression de la protéine PTP4A3 peuvent refléter son rôle durant la migration des cellules de crête neurale. / Uveal melanoma (UM) is the most common intraocular malignancy in adults and is an aggressive tumor since about 50% of patients will develop metastases mostly in the liver. In order to identify metastasis prognostic genes, we compared 28 uveal melanoma tumors from patients who developed metastases within three years after enucleation to 29 tumors from patients who did not develop metastases or who developed metastases after 36 months. The PTP4A3/PRL-3 gene (protein tyrosine phosphatase type IV member of Regenerating Liver 3/Protein-3) was identified as a strong predictor of metastasis occurence. PTP4A3 encodes a dual specificity phosphatase and its expression in UM cells increases their in vitro migration and in vivo invasiveness. Proteolytic events at the cell surface are essential for cell migration and invasiveness during many physiological and pathological processes such as tumor metastasis. MMPs are responsible for the degradation and turnover of the extracellular matrix (ECM). In the first part of this thesis, We found that the membrane anchored MT1-MMP is enriched at the cell surface of OCM-1, xenograft MP41 or primary human uveal melanoma tumors expressing PTP4A3. We also found that membrane accumulation of MT1-MMP in presence of PTP4A3 in OCM-1 cells is accompanied by enhanced secretion of MMP2 in the extracellular medium. Moreover, we demonstrated that PTP4A3 and MT1-MMP physically associate and that the vesicular trafficking of MT1-MMP is accelerated in presence of active PTP4A3 but not in presence of the mutant PTP4A3(C104S). Furthermore, we found that inhibition of MT1-MMP expression in PTP4A3 expressing uveal melanoma cells impairs their migration in vitro and invasiveness in vivo. Collectively, our results indicate that PTP4A3 acts upstream of MT1-MMP through acceleration of its vesicular trafficking and accumulation at the cell surface to enhance cell migration and invasiveness of uveal melanoma cells. In the second part of this thesis, we investigated the role of PTP4A3 during embryonic development. Melanocytes, including uveal melanocytes, are derived from the neural crest during embryonic development. We therefore suggested that PTP4A3 function in uveal melanoma metastasis may be related to an embryonic role during neural crest cell migration. We show that PTP4A3 plays a role in cephalic neural crest development in Xenopus laevis. PTP4A3 loss of function resulted in a reduction of neural crest territory, whilst gain of function experiments increased neural crest territory. Isochronic graft experiments demonstrated that PTP4A3-depleted neural crest explants are unable to migrate in host embryos. Pharmacological inhibition of PTP4A3 on dissected neural crest cells significantly reduced their migration velocity in vitro. Our results demonstrate that PTP4A3 is required for cephalic neural crest migration in vivo during embryonic development.Therefore, the pro-invasive and migratory effects related to the expression of PTP4A3 protein may reflect its role during neural crest migration. Thus, understanding the mechanism of action of PTP4A3 during NC migration may provide insight into PTP4A3 related migratory and invasive phenotypes in human uveal melanoma pathology.

Le Mélanome Uvéal (MU) est la tumeur de l’œil la plus fréquente dans les adultes. Aucune thérapie pour la prévention ou le soins des métastases a donné preuve d’efficacité. Nous avons établi 7 lignées cellulaires de MU à partir soit de la tumeur du patient soit du matériel tumorale provenant de xénogreffes dérivées de patients (Patient-derived Xenografts, PDXs). Ces lignées cellulaires présentent les altérations cytogénétiques et les mutations « drivers » qui ont été jusqu’au présent identifiées dans la maladie; quatre d’entre elles présentent une déficience de la protéine BAP1 (BRCA1 associated protein-1), l’ altération qui caractérise la progression tumorale dans le MU. Cette collection de lignées a été utilisée pour identifier des nouvelles stratégies thérapeutiques. Une analyse in vitro avec une série d’inhibiteurs specifiques des vois de signalisation MEK/ERK, PKC, et PI3K/mTOR a montré l’efficacité de l’inhibiteur de mTOR Everolimus sur la prolifération cellulaire, effet qui a été confirmé dans 4 PDXs ou le composé a ralenti significativement la croissance cellulaire. Nous avons ensuite effectué une analyse systématique de la synergie en combinant les inhibiteurs. La synergie la plus importante est produite par l’association d’ Everolimus et de l’inhibiteur de PI3K GDC0941, résultat confirmé par une forte augmentation de l’apoptose quand les 2 drogues sont utilisées en combinaison. Pour conclure nous avons établi un instrument utile pour l’étude préclinique du MU . Nos résultats montrent que Everolimus est efficace dans l’inhibition de la croissance de MU in vitro et in vivo et que la combinaison d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de PI3K est très efficace dans l’induction de l’apoptose des cellules de MU. Enfin, des dérivées de la vitamine D pourraient exercer un effet antiprolifératif spécifique sur les MU avec mutation de BAP1. / Uveal melanoma (UM) is the most common primary tumor of the eye in adults. There is no standard adjuvant treatment to prevent metastasis and no effective therapy in the metastatic setting. We have established a unique panel of 7 UM cell lines from either patient’s tumors or patient-derived tumor xenografts (PDXs). These cell lines bear the cytogenetic alterations and driver mutations associated with UM so far. Importantly four of them display BAP1 (BRCA1 associated protein-1) deficiency, the hallmark of tumor progression in UM. We used this panel of cell lines to identify novel therapeutic strategies for UM patients. In vitro analysis of a series of specific inhibitors of the MEK/ERK, PKC and PI3K/mTOR pathways showed the efficacy of mTOR inhibitor Everolimus in reducing the viability of UM cell lines, a finding confirmed by significantly delayed tumor growth in 4 PDXs. We then preformed a systematic analysis of drug synergy examining the effect of combinations of the selected inhibitors. The best synergy was found with PI3K inhibitor GDC0941 and Everolimus. This was confirmed by a strong increase in apoptosis with this drug combination. In conclusion we have established an useful tool for performing preclinical studies in UM . Our results show that Everolimus efficiently inhbits UM growth in vitro and in vivo, and that mTOR inhibition coupled with PI3K inhibition is a highly effective in inducing apoptosis in UM cells. Finally Vitamin D derivatives might possibly exert a specific anti proliferative effect on BAP1 mutated UM cell lines.