The United States enjoys a per-capita gross domestic product more than five times the size of Mexico (World Bank, 2015). Yet the immigration policies of the United States fail to recognize the incentives workers in Mexico have to immigrate, legally or otherwise, into the United States. The law alone fails to control the movement of people across a 1,900-mile land border. Immigration has contributed to the economic and cultural dynamism of the United States. In the short-run, it may create economic winners and losers, leading to domestic tension. After Congress debated and then rejected President George W. Bush’s immigration overhaul in 2007, state governments started adopting laws and rules targeting illegal immigrants. Many of those laws forced employers to use the electronic E-Verify system to check whether prospective hires were eligible to work in the United States. Typically, the primary goal was to bar illegal immigrants from the workforce. Additional goals included boosting the employment prospects and earnings of legal residents, and encouraging illegal immigrants to voluntarily leave markets governed by E-Verify requirements. Politicians focused particular attention on the U.S. agricultural industry, which is not surprising since U.S. Department of Agriculture surveys show roughly half the agricultural workforce is working in the country illegally. Farmers say they hire illegal workers because they cannot find enough U.S. workers to harvest labor-intensive produce and livestock. Supporters of the E-Verify law in Georgia said one of their policy goals was to encourage farmers to secure legal, foreign laborers through the federally run H2A visa program. The H2A system allows growers facing domestic labor shortages to import foreign laborers for up to 10 months, though the program is bureaucratically cumbersome and requires that cost-sensitive growers pay above-market wages. To determine whether E-Verify laws encourage H2A use, the author reviewed every state E-Verify law affecting the agricultural industry. After aggregating H2A usage data at the state level, the author conducted a fixed-effects regression that controls for years, monthly seasonal fluctuations, state effects, H2A wage costs, and the relative strength of a state’s E-Verify law. While there is anecdotal evidence that E-Verify laws may disrupt labor markets, there is little statistical evidence that state E-Verify laws cause farmers to increasingly rely on the H2A system. Surprisingly, there is statistical evidence that the strictest E-Verify laws may reduce H2A usage.

La chromatine est une structure composée d'ADN et de protéines, principalement des histones, permettant la compaction du génome à l'intérieur du noyau des cellules eucaryotes. Cette compaction de l'ADN, bien qu'essentielle, représente dans un même temps une barrière à plusieurs processus cellulaires exigeant un accès à l'ADN, dont la transcription génique. L'échange d'histones canoniques par des variants d'histones, tel H2A.Z, est un des moyens utilisés par les cellules pour reconfigurer la chromatine, et ainsi contrôler l'expression des gènes. Connaître les interactions protéiques de H2A.Z est donc une façon de mieux comprendre cette histone, mais également les mécanismes de transcription génique. Dans ce but, nous avons utilisé et optimisé une méthode basée sur une purification par affinité en tandem de protéines complexées à H2A.Z sur la chromatine, chez la levure Saccharomyces cerevisiae . Les partenaires protéiques de H2A.Z isolés de cette façon ont par la suite pu être identifiés à l'aide de la spectrométrie de masse, et c'est ainsi que la protéine Hsm3 a été relevée. La protéine Hsm3 était déjà connue comme étant importante pour la réparation des bases mal appariées, ainsi que comme chaperonne dans l'assemblage de la base de la sous-unité 19S du protéasome, mais aucun rôle en transcription ne lui était jusqu'à présent associé. Nous avons tenté de mieux caractériser cette protéine en construisant une souche de levure n'exprimant plus le gène HSM3 , puis en faisant des essais de croissance avec cette souche sur différents milieux. Ceci nous a permis de constater que Hsm3 est importante pour la croissance des cellules sur un milieu contenant de la caféine. À l'aide d'autres immunoprécipitations, nous avons par la suite pu confirmer l'interaction de cette protéine avec les histones H2A et H2A.Z sur la chromatine. Des essais d'expression ont finalement démontré la nécessité de Hsm3 pour l'induction de l'expression des gènes INO1, SUC2, GAL1 et GAL10 , mais seulement sous certaines conditions de croissance. Puisque cette protéine était déjà connue en tant que chaperonne du protéasome, nous avons vérifié si les phénotypes associés à la suppression de Hsm3 provenaient seulement d'un retard dans l'assemblage de ce complexe. Pour ce faire, nous avons comparé les effets de l'inactivation du protéasome à une suppression de Hsm3 sur l'induction de l'expression des gènes, mais nos résultats ne nous ont pas permis de confirmer ni d'infirmer cette hypothèse. En conclusion, la protéine Hsm3 interagit directement avec la chromatine, et est impliquée dans certains mécanismes de transcription génique, cette implication étant fortement dépendante des conditions de croissance utilisées.

The human genome is organised into a DNA-protein complex called chromatin, of which the main repeating unit is the nucleosome. Chromatin is generally repressive to gene expression, rendering RNA Polymerase II regulatable gene expression dependent on chromatin remodelling complexes. These complexes will displace nucleosomes or change the nucleosomal structure by incorporating histone variants or by the post- translational modification of histone. Chromatin remodelling works in concert with transcription activators on regulatory elements of regulatable genes. The histone variant H2A.Z has a major role in creating a permissive structure at gene regulatory elements. Conversely, the di- and tri-methylation of histone H3 lysine 27 (H3K27) has a repressive effect on gene regulation, but can be reversed by the recently identified demethylase, JMJD3. The steroid hormone estrogen (E2) and its intracellular receptor estrogen receptor [alpha] (ER[alpha]) stimulate transcription of target genes by promoting local changes in hormone-responsive promoters embedded in chromatin. ER[alpha]-dependent cancers demonstrate deregulated proliferation, and the treatment of these cancers with anti-estrogens (AE) occasionally leads to resistant cancer subtypes. H2A.Z overexpression has been associated with ER[alpha] target gene expression and breast cancer. In addition, an interesting link exists between ER[alpha] and H3K27me3 related chromatin remodelling complexes. We thus hypothesized that ER[alpha]-mediated transcription in normal and antiestrogen-resistant breast cancer implicates the modification of chromatin signatures on target genes and results in proliferation. We observed that H2A.Z overexpression is related to ER[alpha] levels and leads to increased proliferation in low E2 concentrations and in the presence of the AE tamoxifen. We also show that the perturbation of a repressive epigenetic mark that normally controls the expression of the proto-oncogene BCL2 in response to E2 leads to its constitutive transcriptional activation and deregulation of the apoptosis program in AE-resistant breast cancer cells. Therefore my doctoral studies present the following conclusions: (1) epigenetic modifications are useful prognostic markers for breast cancer severity; (2) the deregulation of these modifications leads to carcinogenesis; and (3) continued deregulation of these pathways can lead to more severe breast cancer and AE resistance.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

BAP1 est un suppresseur de tumeurs dont le nombre de partenaires protéiques rend complexe l'appréhension de son rôle dans la cellule. Chez la Drosophile, BAP1 et ASX forment le complexe Polycomb PR-DUB, qui déubiquitine l'histone H2A sur la lysine 119 afin de maintenir une répression transcriptionnelle sur ses gènes cibles. Comprendre les mécanismes de régulation de BAP1 et définir son implication au sein de la machinerie Polycomb s'avèrent donc des enjeux cruciaux pour mieux appréhender son rôle au cours de la tumorigenèse. Par des approches biochimiques, nous avons montré l'existence de plusieurs complexes fonctionnellement distincts associés à BAP1. ASXL1 semble ainsi nécessaire à l'activité H2A deubiquitinase de BAP1, tandis qu'ASXL2 forme un complexe ternaire avec BAP1 et la déméthylase d'histones KDM1B. Par ailleurs, nous avons démontré le potentiel de répresseur transcriptionnel de BAP1, qui semble posséder différents domaines répresseurs. Afin d'étudier ces aspects à l'échelle du génome, des analyses du transcriptome et de différentes marques d'histone sont en cours, dans des cellules sauvages ou mutées pour différents membres de la famille Polycomb. Dans un deuxième temps, nous avons entrepris une recherche exhaustive des substrats de BAP1. Nos résultats préliminaires suggèrent que non seulement H2A mais également H2B sont des cibles de BAP1, de même qu'un complexe protéique responsable du contrôle de la prolifération cellulaire via la régulation post-transcriptionnelle de plusieurs cyclines. Ces observations ouvrent la voie à plusieurs projets qui pourraient contribuer à expliquer les conséquences des mutations de BAP1 dans le processus tumoral. / BAP1 is as a tumor suppressor that associates to a variety of protein partners, thereby limiting the comprehension of its cellular functions. In Drosophila, BAP1 binds ASX to form the Polycomb PR-DUB complex, which deubiquitinates histone H2A on lysine 119 in order to maintain transcriptional repression on its target genes. Describing BAP1 mechanisms of action and defining how BAP1 cooperates with the Polycomb machinery are prerequisites to understand its role during tumorigenesis. Using a biochemical approach, we described the existence of several distinct subcomplexes associated with BAP1. Therefore, ASXL1 seems required for H2A deubiquitination, while ASXL2 forms a ternary complex of unknown function with BAP1 and the histone demethylase KDM1B. In addition, we demonstrated the transcriptional repressor function of BAP1, which possess several repressive domains. In addition, we are currently performing transcriptomic analysis combined with genome-wide mapping of different histone marks. These last analyses are performed in wild type cells or deficient in PR-DUB or other Polycomb components, which will help us to understand how BAP1 fits within the Polycomb machinery. In parallel, we engaged a comprehensive study aiming at the identification of new BAP1 substrates. Our preliminary results suggest that not only H2A but also H2B may be direct substrates of BAP1. In addition, we identified as a potential substrate the HNRNPM-IMP3 complex, which controls cell proliferation via post-transcriptional regulation of several cyclins. These observations pave the way for new projects that may contribute to explain the consequences of BAP1 mutations in cancer development.

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle majeur dans la régulation d’une multitude de processus cellulaires. Dans cette thèse, je discuterai de la caractérisation de deux protéines, BRCA1 et BAP1, soit deux suppresseurs de tumeurs fonctionnellement reliés. BRCA1, une ubiquitine ligase qui catalyse la liaison de l’ubiquitine à une protéine cible, est mutée dans les cancers du sein et de l'ovaire. Il est bien établi que cette protéine aide à maintenir la stabilité génomique suite à un bris double brin de l’ADN (BDB), et ce, à l’aide d’un mécanisme de réparation bien caractérisé appelé recombinaison homologue. Cependant, les mécanismes de régulation de BRCA1 suite à des stresses génotoxiques n’impliquant pas directement un BDB ne sont pas pleinement élucidés. Nous avons démontré que BRCA1 est régulée par dégradation protéasomale suite à une exposition des cellules à deux agents génotoxiques reconnus pour ne pas directement générer des BDBs, soit les rayons UV, qui provoquent la distorsion de l’hélice d’ADN, et le méthyle méthanesulfonate (MMS), qui entraîne l’alkylation de l’ADN. La dégradation de BRCA1 est réversible et indépendante des kinases associées à la voie des PI3 kinase, soit ATM, ATR et DNA-PK, protéines qui sont rapidement activées par les dommages à l’ADN. Nous proposons que la dégradation de BRCA1 prévienne son recrutement intempestif, ainsi que celui des facteurs qui lui sont associés, à des sites de dommages d’ADN qui ne sont pas des BDBs, et que cette régulation coordonne la réparation de l’ADN. L’enzyme de déubiquitination BAP1 a initialement été identifiée comme une protéine capable d’interagir avec BRCA1 et de réguler sa fonction. Elle est également connue pour sa capacité à se lier avec les protéines du groupe Polycomb, ASXL1 et ASXL2. Cependant, l’importance de ces interactions n’a toujours pas été établie. Nous avons démontré que BAP1 forme deux complexes protéiques mutuellement exclusifs avec ASXL1 et ASXL2. Ces interactions sont critiques pour la liaison de BAP1 à l’ubiquitine ainsi que pour la stimulation de son activité enzymatique envers l’histone H2A. Nous avons également identifié des mutations de BAP1 dérivées de cancers qui empêchent à la fois son interaction avec ASXL1 et AXSL2, et son activité de déubiquitinase, ce qui fournit un lien mécanistique direct entre la déubiquitination de H2A et la tumorigenèse. Élucider les mécanismes de régulation de BRCA1 et BAP1 menera à une meilleure compréhension de leurs rôles de suppresseurs de tumeurs, permettant ainsi d’établir de nouvelles stratégies de diagnostic et traitement du cancer. / Ubiquitination is a post-translational modification that plays major roles in regulating a plethora of cellular processes. In this thesis, I will discuss the biochemical and functional characterization of two functionally related proteins, BRCA1 and BAP1, both of which are important tumor suppressors. BRCA1, an ubiquitin ligase that catalyzes the attachment of ubiquitin to target proteins, is mutated in breast and ovarian cancers. BRCA1 roles in maintaining genomic stability following DNA double strand breaks (DSBs) by promoting the homologous recombination repair pathway is well established. However, how BRCA1 is regulated following genotoxic stress that does not directly involve DSBs is still not fully elucidated. We showed that BRCA1 is downregulated, through proteasomal degradation, following exposure of the cells to the DNA helix distorting agent UV or the DNA alkylating agent Methyl Methanesulfonate (MMS), two DNA damaging agents that do not directly generate DSBs. BRCA1 downregulation is reversible and is independent of the PI3 kinase related kinases, ATM, ATR or DNA-PK which constitute primary responders that are rapidly activated by DNA damage. We proposed that BRCA1 downregulation prevents the untimely recruitment of BRCA1 and associated factors to DNA damage sites that are not DSBs, thus coordinating the DNA damage/repair response. The deubiquitinating enzyme BAP1 was initially identified as an interacting protein that regulates the function of BRCA1. BAP1 is also known to interact with the Polycomb group proteins ASXL1 and ASXL2. However, the importance of this interaction was not fully understood. We showed that BAP1 forms two mutually exclusive complexes with ASXL1 and ASXL2. These interactions are critical for BAP1 binding to ubiquitin and stimulation of its deubiquitinase activity towards histone H2A. We also identified cancer-derived mutations of BAP1 that abrogate its interaction with ASXL1 and ASXL2 and deubiquitinase activity, which provide a direct mechanistic link between H2A deubiquitination and tumorigenesis. Elucidating how BRCA1 and BAP1 are regulated will lead to a better understanding of their roles as tumor suppressors and this will in turn help establishing improved diagnostic and therapeutic strategies to treat cancer.

No description available.

En dégradant la majorité des protéines cellulaires, le protéasome se positionne comme un régulateur clé du protéome, vis-à-vis duquel la plupart des tumeurs présentent une forte addiction en raison du débalancement protéique qui les caractérise. Quoique son inhibition se soit avérée être une bonne stratégie anticancer, elle est demeurée limitée aux cancers sanguins. Malheureusement, leur traitement devient tôt ou tard compromis par la résistance cellulaire. Raison pour laquelle l'élucidation du mécanisme de mort en jeu pourrait permettre de mieux cerner cette résistance, ce qui constituerait les fondements pour un traitement plus efficace. L'un des événements les plus spectaculaires et les plus précoces à se manifester dans le cadre de ce traitement, est la déubiquitination massive de l'histone H2A sur la lysine (K) 119. Une corrélation positive plutôt paradoxale entre cet événement, qui est associé à l'expression génique, et la sensibilité cellulaire à l'inhibition du protéasome, a été remarquée. Cela a mené à s'intéresser à sa signification biologique. Des cellules cancéreuses et primaires ont servi de systèmes d'étude protéomique par immunobuvardage et par immunofluorescence, pour analyser l'état de la chromatine et la distribution spatio-temporelle des histones durant l'inhibition du protéasome. Des inhibiteurs chimiques, des ARN interférents et des vecteurs d'expression ont été utilisés à cette fin. Un impressionnant phénomène survenant à la suite de l'inhibition du protéasome a été révélé. En effet, une baisse drastique du niveau d'histones sur la chromatine s'opère simultanément à la déubiquitination de H2A-ub (K119). Le protéasome étant inhibé, celles-ci, et possiblement les histones synthétisées en phase S, subiraient une translocation irréversible dans les nucléoles, et ce avant le déclenchement de l'apoptose. Ce phénomène est reproduit par divers inhibiteurs du protéasome et par siRNA, et il survient autant dans des cellules cancéreuses que primaires, mais pas dans les cellules résistantes, qui ne démontrent d'ailleurs pas de déubiquitination de H2A-ub (K119). Par ailleurs, il a été montré que la surexpression d'histones exogènes mène à leur translocation nucléolaire, et que la combinaison de l'inhibition du protéasome à cette surexpression pourrait être léthale. Quoique majoritairement préliminaires, les résultats révèleraient un surprenant mécanisme de régulation post-traductionnelle des histones endogènes, qui seraient séquestrées dans les nucléoles lorsqu'elles ne sont pas incorporées à la chromatine. En effet, l'inhibition du protéasome occasionne une importante perturbation de la chromatine pendant plusieurs heures. En raison de la cytotoxicité intrinsèque des histones libres et de leur abondance dans les cellules, celles-ci pourraient bien être à l'origine de la mort induite par l'inhibition du protéasome. Enfin, en sa qualité de senseur majeur de stress, le nucléole pourrait bien être le point de départ de la signalisation menant à la mort. / By degrading most of cellular proteins, the proteasome is positioned as a key regulator of the proteome, against which most tumors have a strong addiction, due to the protein imbalance that characterizes them. Although its inhibition has been shown to be a good anticancer strategy, it is still limited to blood cancers. Unfortunately, their treatment sooner or later becomes compromised by cellular resistance. This is why the elucidation of the mechanism of death involved could allow a better understanding of this resistance, which would in turn constitute the basis for a more effective treatment One of the most spectacular and early events to manifest during this treatment is the massive deubiquitylation of histone H2A on lysine (K) 119. A rather paradoxical positive correlation between this event, which is associated with gene expression, and cellular sensitivity to proteasome inhibition, has been noticed. This led to an interest in its biological significance. Cancer and primary cells have been used as systems for proteomic study by immunoblot and immunofluorescence, to analyze chromatin status and the spatio-temporal distribution of histones during proteasome inhibition. Chemical inhibitors, interfering RNAs and expression vectors have been used for this purpose. An impressive phenomenon occurring during the proteasome inhibition has been revealed. Indeed, a drastic drop in histones level on chromatin occurs simultaneously with the deubiquitylation of H2A-ub (K119). The proteasome being inhibited, these, and possibly histones synthesized in S phase, would undergo an irreversible translocation in the nucleoli before the onset of apoptosis. This phenomenon is replicated by various proteasome inhibitors and siRNA, and occurs in both cancer and primary cells, but not in resistant cells, which do not demonstrate deubiquitination of H2A-ub (K119). Furthermore, overexpression of exogenous histones has been shown to lead to their nucleolar translocation, and it is thought that the combination of proteasome inhibition with this overexpression could be lethal. Although mostly preliminary, the results would reveal a surprising mechanism of post-translational regulation of endogenous histones, which would be sequestered in nucleoli when not incorporated into chromatin. Indeed, inhibition of the proteasome causes a significant disruption of the chromatin for several hours. Due to the intrinsic cytotoxicity of free histones and to their great cellular abundance, these may well be the cause of the death induced by proteasome inhibition. Finally, as a major stress sensor, the nucleolus could be the starting point of the death signaling.

Germ-line mutations in the breast cancer susceptibility gene BRCA1 strongly increase the risk of developing breast and ovarian cancer in women. Different hypothesis have been proposed to explain this tissue specificity. One of the most argued hypothesis is the one that proposes a link between BRCA1 and ovarian hormones' action. Much data have been published in the last years pointing to an important role of progesterone receptor (PR) in inducing normal mammary development and also breast cancer formation. This study aimed to search for a functional relationship between BRCA1 and PR in breast cancer cells. We have found that BRCA1 inhibits the transcriptional activity of PR. We have investigated in more detail the mechanism of this effect. BRCA1 and PR interact in vivo in a ligand-independent fashion. Most importantly, BRCA1 alters the ligand-independent and dependent degradation of PR protein through its ubiquitination and this might have a direct effect on the level of PR recruitment on regulated promoters. BRCA1 is recruited to the hormone-responsive regions of PR-target genes and affects the presence of histone deacetylase activity and the level of monoubiquitinated histone H2A, linking BRCA1 action with chromatin status. These findings support a connection between BRCA1, the principal tumour suppressor responsible for familial breast cancer, and the progesterone receptor transcriptional activity. This relationship can be hypothesized to be reflected in the BRCA1-related breast tumourigenesis. / Mutaciones germinales en el gen breast cancer susceptibility gene BRCA1 aumentan altamente el riesgo de padecer cáncer de mama y ovario en mujeres. Se han propuesto diferentes hipótesis para explicar esta especificidad de tejido. Una de las hipótesis más argumentadas es la que propone una relación entre BRCA1 y la acción de las hormonas ováricas. En los últimos años se han publicado numerosos datos señalando al papel esencial del receptor de progesterona (PR) en la inducción del desarrollo normal de la mama y en la formación del cáncer de mama. Este estudio pretendía buscar una relación funcional entre BRCA1 y PR en células de cáncer de mama. Hemos demostrado que BRCA1 inhibe la actividad transcripcional de PR. Hemos investigado en más detalle el mecanismo de este efecto. BRCA1 y PR interaccionan in vivo de una manera independiente de ligando. Y lo que es más, BRCA1 altera la degradación independiente y dependiente de ligando de PR a través de su ubiquitinización y esto podría tener un efecto directo en el nivel de reclutamiento de PR en promotores regulados. BRCA1 es reclutado a las regiones de respuesta a hormona de genes diana de PR y afecta la presencia de actividad histona desacetilasa y el nivel de histona H2A monoubiquitinada, estableciendo un enlace entre la acción de BRCA1 y el estado de la cromatina. Estos hallazgos apoyan una conexión entre BRCA1, el principal supresor de tumor responsable del cáncer de mama hereditario, y la actividad transcripcional del receptor de progesterona. Se puede hipotetizar que esta relación se ve reflejada en el proceso de tumorigénesis BRCA1-dependiente.