La supervivencia celular frente a los cambios ambientales requiere el mantenimiento de un equilibrio dinámico entre la síntesis y la degradación de proteínas. La degradación de proteínas, además de regular diferentes procesos celulares, tiene como función principal la eliminación de productos que no son útiles para la célula en determinadas situaciones o cuya acumulación puede ser tóxica. Los productos de esta degradación, es decir los aminoácidos, son reutilizados para la síntesis de nuevas moléculas o son metabolizados para la obtención de energía. La alteración de esta proteólisis intracelular puede llevar a la acumulación en el citoplasma de orgánulos defectuosos o de moléculas que se pueden agrupar en agregados insolubles y que pueden así desencadenar diferentes patologías. Aunque se ha avanzado bastante durante los últimos años en los conocimientos sobre la degradación intracelular de proteínas y de sus principales mecanismos, existen bastantes detalles moleculares todavía desconocidos. Por este motivo es necesario aportar nueva información sobre estos procesos que además podría ser relevante para identificar nuevas dianas terapéuticas y desarrollar tratamientos más eficaces para las enfermedades derivadas de alteraciones en los mismos. La degradación de proteínas ocurre por diferentes mecanismos que pueden clasificarse generalmente en dependientes o no de unos orgánulos citoplásmicos, los lisosomas. La macroautofagia (a la que se denomina generalmente con el término más simple de autofagia) y el sistema ubicuitina-proteasomas son, respectivamente, los más importantes de esos dos grupos. Básicamente, el sistema ubicuitina-proteasomas consiste en la poliubicuitinación de proteínas que son después degradadas por los proteasomas. La autofagia en cambio se inicia con el secuestro de porciones del citoplasma en estructuras de doble membrana que se cierran formando los autofagosomas. Posteriormente, los autofagosomas se fusionan con endosomas y con lisosomas dando lugar a los autolisosomas, en los que por la acción de las proteasas o catepsinas lisosomales se degrada el material encerrado. La autofagia está regulada por una amplia variedad de vías de señalización que responden a multitud de factores ambientales. Entre estos últimos, la situación de ayuno de nutrientes es la inductora más potente de la autofagia. Durante la privación de nutrientes como los aminoácidos, la célula sufre un estrés energético que debe tratar de reducir produciendo ATP a partir de nuevas fuentes. Para ello activa la autofagia para degradar los componentes de la célula, como las proteínas, hasta producir sus unidades básicas que después son metabolizadas. Por el contrario, se ha demostrado que cuando se proporcionan aminoácidos a la célula la autofagia es inhibida. Aunque el efecto sobre la autofagia de los aminoácidos ha sido estudiado ampliamente en muchos laboratorios, no estaba tan claro ese efecto en el caso de otro nutriente, la glucosa, ya que cuando planteamos ese estudio los datos eran contradictorios. En este trabajo hemos podido establecer claramente que la glucosa tiene un papel inductor sobre la autofagia empleando técnicas muy variadas que incluyen: la cuantificación por ¿Western-blot¿ de los niveles del marcador de autofagia LC3-II en presencia o en ausencia de inhibidores lisosomales, la cuantificación de la proteína degradada, total y por la vía autofágica, mediante experimentos de pulso y caza, la cuantificación morfométrica de estructuras autofágicas (equivalentes a autofagosomas y autolisosomas) por microscopia electrónica y la cuantificación de la masa lisosomal por fluorescencia. Además, hemos comprobado que la glucosa también induce la ubicuitinación de proteínas y la degradación de estas por los proteasomas. Con estos y otros datos obtenidos durante el desarrollo de esta tesis doctoral, hemos podido concluir que la glucosa induce la autofagia en todos los tipos celulares estudiados y en todas las condiciones ensayadas. Este efecto disminuye o se enmascara cuando están presentes a la vez otros factores que son inhibidores de la autofagia, como los aminoácidos o el suero bovino fetal, lo que podría explicar algunos de los datos contradictorios en la literatura. La glucosa aporta la energía necesaria para el correcto funcionamiento de la autofagia a partir de unos niveles mínimos de ATP. Un descenso en la disponibilidad energética a través de la inhibición de la glucólisis reprime la autofagia inducida por la glucosa. Sin embargo, la estimulación de la autofagia por glucosa no parece depender únicamente de la disponibilidad de ATP, sino que hemos identificado una vía de señalización en la que no interviene AMPK a pesar de responder al descenso de los niveles de ATP y al aumento de los niveles de calcio durante la incubación en un medio carente de glucosa. Esta vía tampoco implica a mTORC1 y en ella sí interviene en cambio la MAPK p38¿, como hemos comprobado con diferentes inhibidores de esta quinasa, con el uso de siRNAs o empleando MEFs p38-/-. Consideramos que estos resultados contribuyen a clarificar más la regulación de la autofagia por nutrientes y, más concretamente, por uno tan relevante como es la glucosa. / Moruno Manchón, JF. (2013). Regulación de la degradación intracelular de proteínas por glucosa [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34775 / TESIS

El alcohol es un compuesto neurotóxico y su abuso puede causar daño cerebral y neurodegeneración. Sin embargo, los procesos neuropatológicos que producen estos efectos no se conocen con exactitud. Nuestro grupo demostró por primera vez que el etanol induce gliosis, neuroinflamación, daño cerebral y neurodegeneración mediante la activación del sistema inmune innato en cerebro a través de los receptores TLR4 de las células gliales. Además, evidencias recientes apuntan a que el alcohol altera los procesos de degradación de proteínas en patologías como la hepatopatía alcohólica, pero se desconoce si estos procesos proteolíticos también participan en el daño cerebral inducido por el consumo de alcohol. Mediante esta tesis, pretendemos evaluar la relación de los dos principales complejos proteolíticos, el sistema ubicuitina-proteasoma y la vía de la autofagia, con el daño producido por el alcohol en el cerebro, así como la implicación de los receptores TLR4 en este proceso. Para ello, usaremos ratones WT y TLR4-/- tratados crónicamente con etanol en agua durante 5 meses y los compararemos con los respectivos controles mediante técnicas como el western blot, PCR cuantitativa, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o citometría. Del mismo modo, trabajaremos también con cultivos primarios de células gliales para evaluar el efecto del alcohol en dosis agudas in vitro. Nuestra hipótesis de partida es que al activar la señalización por TLR4, el etanol causa inflamación en el cerebro, estrés oxidativo y acumulación de proteínas por disfunción de los sistemas proteolíticos. Esta acumulación de agregados proteicos podría a su vez estimular la activación de los receptores TLR4, amplificando los efectos del etanol en la producción de daño cerebral y neurodegeneración. / Pla Rodríguez, A. (2014). IMPORTANCIA DE LOS MECANISMOS DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS EN LA NEURODEGENERACIÓN CAUSADA POR EL ABUSO DE ALCOHOL: PAPEL DE LOS RECEPTORES TLR4 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36532 / TESIS

Targeted protein degradation plays a central role in eukaryotic cell regulation and homeostasis. The ubiquitin proteasome system (UPS) is involved in a large number of cellular events, being, day by day, more difficult to find pathways without links with the system. Proteins are marked for degradation by ubiquitin ligases that append polyubiquitin signals, which can recruit the targeted protein to the 26S proteasome for degradation. In the process, polyubiquitin chains appended to the target protein are disassembled into free monoubiquitin for subsequent rounds of substrate tagging by means of deubiquitinating enzymes. Rpn10 is a proteasome receptor that recognizes the Lys48-linked polyubiquitin degradation signal by means of a ubiquitin-interacting motif (UIM). Mutation of the UIM domain of Rpn10 significantly ablates the proteolytic capacity of the proteasome. Rpn10 also contains a Von Willebrand factor A (VWA) domain which is responsible of Rpn10 interactions inside the proteasome. Rpn10 is in equilibrium with a pool of free protein so that it functions as both, a receptor at the proteasome, and an extraproteasomal adaptor. In the present work, we have shown that Rpn10 is monoubiquitinated (Rpn10-mUb) in vivo and that Rpn10-mUb is found in both proteasomal and non-proteasomal pools. Levels of Rpn10-mUb are regulated in vivo by Rps5, a NEDD4 ubiquitin-ligase protein family, and Ubp2, a deubiquitinating enzyme. Our observations link for first time monoubiquitin signal with proteasome regulation. Monoubiquitination strongly inhibits Rpn10 to interact with ubiquitin conjugates by a specific interaction in cis between Rpn10 UIM domain and the linked monoubiquitin. By means of genetic and proteomics tools we found that four sites of Rpn10 sequence are subjected to monoubiquitination by Rsp5 (Lys71, Lys84, Lys99 and Lys268), but Lys84 within its VWA domain is the preferred one. Ubiquitination of Rpn10 inhibits its ability to bind polyubiquitinated substrates, thus functioning as mechanism of inactivation of this receptor. Interestingly, our findings suggest that Rpn10 monoubiquitination could decrease proteasome activity. The UIM of Rpn10 also strongly interacts with the ubiquitin-like domain (Ubl) of Dsk2, a polyubiquitin-binding protein. Furthermore, extraproteasomal Rpn10 plays a critical role in filtering Dsk2 and its substrates from the proteasome. We evaluated the affinity of several forms of Rpn10-mUb to Dsk2 and found that Ub-UIM interaction in cis of Rpn10-mUb impairs the binding of Dsk2 in trans. These results suggest that in an extraproteasomal context, Rpn10 monoubiquitination could regulate the Dsk2-Rpn10 interaction. Notably, the proteasomal pool of Rpn10-mUb is suppressed under perturbations that promote the proteolytic pathway, such as stress by temperature and oxidative stress, whereas the extraproteasomal pool remains fairly constant. To assess whether the distinct behavior of the Rpn10-mUb pools correlated with the modification of different lysine residues of Rpn10, we set up assays of absolute quantification of the two major ubiquitination sites, Lys84 and Lys268, by mass spectrometry (AQUA). The obtained results clearly indicate that Lys84 is the main target of Rsp5 ligase in both pools of Rpn10, enhancing the role of the VWA domain in Rpn10 ubiquitination. Finally, we have combined ubiquitin remnant profiling with quantitative proteomic approaches to identify ubiquitinated species that are increased in RPN10-RAD23 deletion, under standard growth conditions and cold-shock stress. Enriched conjugates have been distributed across different biological functions being proteins involved in RNA processing and transport metabolism accounting for the biggest fractions. Further molecular biology approaches and informatic analysis are required to address which proteins are likely to be true UPS substrates as opposed to proteins regulated by ubiquitination in a non-proteolytic manner. Overall, our results provide a novel evidence of involvement of monoubiquitin signals in the regulation of the availability of substrates to bind proteasomal surfaces. Considering that substrate binding is the first event in the multicatalytic process promoted by the proteasome, the control of the accessibility of proteasome receptors is a crucial level of proteasome regulation. Thus, if the NEDD4 enzyme catalyzed monoubiquitination of Rpn10 inhibits proteasome activity, the control of this reaction could be an interesting target. Classical proteasome inhibitors, such as Bortezomib, which target the proteolytic activity of the core particle of the proteasome, are used as anticancer drugs. We propose that Rpn10 monoubiquitination could be considered as a new target in cancer research. / La degradació de proteïnes juga un rol essencial en la regulació i homeostasi de les cèl•lules eucariotes. Les proteïnes són marcades per a la seva degradació per ubicuitina lligases les quals annexen cadenes de poliubicuitina enviant de manera específica la proteïna al 26S proteasoma on serà degradada. Rpn10 és un receptor del proteasoma que reconeix cadenes d’ubicuitina a través del seu motiu UIM (ubiquitin-interacting motif). Rpn10 també conté un domini VWA el qual és responsable de les interaccions de Rpn10 en el seu context proteasomal. Rpn10 també es troba en equilibri amb una fracció no proteasomal. En el present treball hem demostrat que Rpn10 està monoubicuitinat (Rpn10-mUb) in vivo i que aquesta modificació es troba en ambdues fraccions proteasomal i extraproteasomal. Els nivells de Rpn10-mUb estan regulats in vivo per Rsp5, una ubicuitina lligasa de la família de les NEDD4, i Ubp2, una deubicuitinasa. Mitjançant mètodes genètics i de proteòmica es van trobar quatre lisines modificades per ubicuitina en la seqüència de Rpn10 (Lys71, Lys84, Lys99 and Lys268) éssent la Lys84 la diana preferent de Rsp5. La monoubicuitinació inhibeix la capacitat de Rpn10 d’unir substrats poliubicuitinats i en, conseqüència, és un mecanisme d’innactivació d’aquest receptor. També s’ha trobat que Rpn10-mUb disminuiex l’activitat del proteasoma. Els nostres resultats relacionen per primera vegada la monoubicuitinació amb la regulació del proteasoma, procés que imita la droga Bortezomib. Es proposa que Rpn10-mUb podria considerar-se com a nova diana en la teràpia contra el càncer.

Donada la resistència a la quimioteràpia que presenta el melanoma i el carcinoma d’endometri avançat, és important la investigació destinada a buscar dianes terapèutiques. En aquest treball hem investigat els efectes de d’anàlegs de la somatostatina (SA), d’inhibidors del proteasoma (PI) com Bortezomib, de l’inhibidor de receptors tirosina cinasa Sunitinib i la combinació de Sunitinib i Bortezomib en línies cel•lulars de melanoma. Aquesta combinació també l’hem testat en el carcinoma d’endometri. S’observa que les cel•lules de melanoma expressen varis receptors de la somatostatina. Els PI són eficients a l’hora d’induir una parada en el cicle cel•lular i apoptosi. Les línies cel•lulars que presenten PDGFRα i VEGFR2 són sensibles a Sunitinib, i aquest interacciona amb Bortezomib de forma sinèrgica. En el carcinoma d’endometri, Sunitinib indueix una parada en el cicle cel•lular, apoptosi, inhibeix la via NFκB i interacciona sinèrgicament amb Bortezomib. Els SAs i PI podrien ser útils en combinació amb altres agents i l’ús de Bortezomib i Sunitinib ha mostrat ser efectiu en determinats casos de melanoma i en el carcinoma d’endometri. / Dada la resistencia a la quimioterapia que presenta el melanoma y el carcinoma de endometrio avanzado, es importante aquella investigación destinada a buscar dianas terapéuticas. En este trabajo hemos investigado los efectos de análogos de la somatostatina (SAs), de inhibidores del proteasoma (PI) como Bortezomib, del inhibidor de receptores tirosina cinasa Sunitinib y la combinación de Sunitinib y Bortezomib en líneas celulares de melanoma. Esta combinación también la hemos testado en el carcinoma de endometrio. Se observa que las células de melanoma expresan varios receptores de la somatostatina. Los PI son eficientes a la hora de inducir una parada en el ciclo celular y apoptosis. Las líneas celulares que presentan PDGFR α i VEGFR2 son sensibles a Sunitinib, y éste interacciona con Bortezomib de forma sinérgica. En el carcinoma de endometrio, Sunitinib induce una parada en el ciclo celular, apoptosis, inhibe la via NFκB e interacciona sinérgicamente con Bortezomib. Los SAs y PI podrían ser útiles en combinación con otros agentes y el uso de Bortezomib y Sunitinib ha demostrado ser efectivo en determinados casos de melanoma y en el carcinoma de endometrio. / As advanced melanoma and endometrial carcinoma is highly resistant to chemotherapy it is important the research focused to the search of therapeutic targets. In the present work, we have investigated the effects of somatostatin analogues (SAs), proteasome inhibitors (PI) such as Bortezomib, the tyrosine kinase receptor inhibitor Sunitinib and the combined therapy of Sunitinib and Bortezomib. This combination has been also tested in endometrial carcinoma. It is observed that melanoma cell lines express various somatostatin receptors. In addition, proteasome inhibitors induce a cell cycle arrest and apoptosis. Those cells presenting activated PDGFRα or VEGFR2 are more sensitive to Sunitinib and this interacts synergistically with Bortezomib. In endometrial carcinoma, Sunitinib induces a cell cycle arrest, apoptosis, inhibits NFκB pathway and interacts synergistically with Bortezomib. The SAs and PI could be useful combined with other agents and the use of Bortezomib and Sunitinib has shown to be effective in certain cases of melanoma and in endometrial carcinoma.

La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común de nuestra sociedad tras el de Alzheimer. Se caracteriza por una disminución de los niveles del neurotransmisor dopamina asociada a la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra del mesencéfalo, proceso que sucede de forma análoga en las células dopaminérgicas de la retina, el subtipo de células amacrinas A18. En consecuencia, además de las múltiples deficiencias motoras y cognitivas que conlleva esta enfermedad, también se han observado alteraciones, a nivel morfológico y fisiológico, en la retina de enfermos de Parkinson y animales modelo de esta enfermedad. Dichas alteraciones incluyen deficiencias en la agudeza visual, sensibilidad al contraste, percepción del color y adaptación a la oscuridad, así como en la detección del movimiento. Sin embargo, se hace necesario esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes a esta patología en la retina con el fin de facilitar el diagnóstico molecular y la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas. En esta Tesis Doctoral se ha analizado la expresión génica y el patrón de distribución en la retina de distintos mamíferos, desde roedores hasta la especie humana, de dos proteínas de elevada relevancia en la enfermedad de Parkinson, denominadas parkina y UCH-L1, dos importantes componentes del sistema ubicuitina-proteasoma, implicado en la homeostasis proteica celular. En este contexto, se han revisado en profundidad los componentes que integran este sistema en la retina, junto a su papel en el desarrollo y función de este tejido en condiciones fisiológicas y sus alteraciones en condiciones patológicas. Por otra parte, se ha estudiado el patrón de procesamiento ('splicing') alternativo del ARNm del gen PARK2, el cual codifica la proteína parkina, en la retina de mamíferos en condiciones fisiológicas, proceso cuya desregulación está implicada en el desarrollo y progresión de diversas patologías que afectan a la retina, incluida la enfermedad de Parkinson. Adicionalmente, se han investigado las alteraciones a nivel proteico en la retina de monos parkinsonianos tratados con el compuesto neurotóxico MPTP, mediante técnicas de proteómica. Finalmente, se han catalogado y cuantificado todos los genes expresados en la retina adulta humana mediante secuenciación masiva del transcriptoma (RNA-Seq), con especial énfasis en aquellos relacionados con enfermedades neurodegenerativas que afectan a la retina. En conclusión, en esta Tesis Doctoral se ha abordado mediante diferentes aproximaciones experimentales en la retina de mamíferos el estudio de la expresión de los genes y proteínas relacionados con enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central que cursan con alteraciones en la estructura y función de la retina.

Germ-line mutations in the breast cancer susceptibility gene BRCA1 strongly increase the risk of developing breast and ovarian cancer in women. Different hypothesis have been proposed to explain this tissue specificity. One of the most argued hypothesis is the one that proposes a link between BRCA1 and ovarian hormones' action. Much data have been published in the last years pointing to an important role of progesterone receptor (PR) in inducing normal mammary development and also breast cancer formation. This study aimed to search for a functional relationship between BRCA1 and PR in breast cancer cells. We have found that BRCA1 inhibits the transcriptional activity of PR. We have investigated in more detail the mechanism of this effect. BRCA1 and PR interact in vivo in a ligand-independent fashion. Most importantly, BRCA1 alters the ligand-independent and dependent degradation of PR protein through its ubiquitination and this might have a direct effect on the level of PR recruitment on regulated promoters. BRCA1 is recruited to the hormone-responsive regions of PR-target genes and affects the presence of histone deacetylase activity and the level of monoubiquitinated histone H2A, linking BRCA1 action with chromatin status. These findings support a connection between BRCA1, the principal tumour suppressor responsible for familial breast cancer, and the progesterone receptor transcriptional activity. This relationship can be hypothesized to be reflected in the BRCA1-related breast tumourigenesis. / Mutaciones germinales en el gen breast cancer susceptibility gene BRCA1 aumentan altamente el riesgo de padecer cáncer de mama y ovario en mujeres. Se han propuesto diferentes hipótesis para explicar esta especificidad de tejido. Una de las hipótesis más argumentadas es la que propone una relación entre BRCA1 y la acción de las hormonas ováricas. En los últimos años se han publicado numerosos datos señalando al papel esencial del receptor de progesterona (PR) en la inducción del desarrollo normal de la mama y en la formación del cáncer de mama. Este estudio pretendía buscar una relación funcional entre BRCA1 y PR en células de cáncer de mama. Hemos demostrado que BRCA1 inhibe la actividad transcripcional de PR. Hemos investigado en más detalle el mecanismo de este efecto. BRCA1 y PR interaccionan in vivo de una manera independiente de ligando. Y lo que es más, BRCA1 altera la degradación independiente y dependiente de ligando de PR a través de su ubiquitinización y esto podría tener un efecto directo en el nivel de reclutamiento de PR en promotores regulados. BRCA1 es reclutado a las regiones de respuesta a hormona de genes diana de PR y afecta la presencia de actividad histona desacetilasa y el nivel de histona H2A monoubiquitinada, estableciendo un enlace entre la acción de BRCA1 y el estado de la cromatina. Estos hallazgos apoyan una conexión entre BRCA1, el principal supresor de tumor responsable del cáncer de mama hereditario, y la actividad transcripcional del receptor de progesterona. Se puede hipotetizar que esta relación se ve reflejada en el proceso de tumorigénesis BRCA1-dependiente.