Nas células eucariotas a maioria das proteínas citoplasmáticas não são degradadas nos lisossomas, mas em organelas altamente conservadas encontradas em humanos, arquibactérias, plantas e leveduras, os proteassomas. Esta estrutura multicatalítica é constituída por componentes menores, cujo núcleo funcional é o componente 20S, que contém várias atividades proteolíticas (tríptica, quimotríptica, de peptidilglutamil peptidase, BrAAP e SNAAP). Esse componente 20S, associado ao complexo regulatório 19S, que é composto de múltiplas ATPases, forma o complexo 26S, responsável pela degradação de proteínas conjugadas com a ubiquitina. Estas estruturas citosólicas certamente desempenham papel importante no desenvolvimento de protozoários parasitas e na sua interação com células dos hospedeiros permissivos. Nesta dissertação, apresentamos um estudo sobre o papel do proteassoma na interação e desenvolvimento de promastigotas de Leishmania chagasi em macrófagos murinos. Inicialmente, purificamos e caracterizamos parcialmente o proteassoma de promastigotas de L. chagasi. Observamos que o complexo presente na L. chagasi possui atividades proteolíticas frente a pelo menos dois substratos sintéticos, LLVY-AMC e LRR-AMC, que avaliam, respectivamente, as atividades quimiotripsina-símile e tripsina-símile. A atividade tripsina-simile é maior que a atividade quimiotripsina-simile; e além disso, esta última é totalmente inibida pela lactacistina, um inibidor específico do proteassoma, enquanto a atividade tripsina-simile é apenas parcialmente inibida. Utilizando a lactacistina foi possível analisar o papel desse complexo proteolítico durante a infecção e desenvolvimento intracelular da L. chagasi. Promastigotas mantidas em cultura na presença de 50μM de lactacistina tiveram seu crescimento bloqueado. Essas promastigotas eram capazes de infectar macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, mas não conseguiam sobreviver dentro desses macrófagos. Esta incapacidade de sobrevivência foi específica para os parasitas tratados com a lactacistina, não sendo observado nos parasitas tratados com outros inibidores de proteases. Estes resultados sugerem que o proteassoma pode ter um papel importante no desenvolvimento intracelular e na replicação das promastigotas de L. chagasi no hospedeiro vertebrado. / Proteasomes are multicatalitic and multisubunit endopeptidase complexes widely distributed in eukaryotic cells. These enzymes are central proteases in the cytosol and nucleus and are involved in removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, in processing and degradation of transcriptional regulators in stress response and in the processing of protein antigens. This multicatalytic proteinase complex is composed of a catalytic core, 20S proteasome, which have multiple proteolytic activities (trypsin-like, chymotrypsin-like, peptidylglutamtyl-peptide hydrolyzing, BrAAP and SNAAP). The 20S proteasome associates with the multisubunit complex 19S to produce the 26S proteasome. The 26S proteasome has specificity for ubiquitinylated protein substrates and hydrolyses ATP during proteolysis of ubiquitinylated proteins. In the present work we have purified a 20S form of proteasome from Leishmania chagasi and partially characterized it. The purified 20S proteasome has activity towards fluorogenic substrates that are cleaved by trypsin or chymotrypsin, and is sensitive to lactacystin, a specific inhibitor of the proteasome. We show that the L.chagasi proteasome the trypsin-like activity is higher than the chymotrypsin-like. Therefore the chymotrypsin-like activity is inhibited by lactacystin and the trypsin-like it is only partially inhibited. We show here that lactacystin blocks in vitro L chagasi promastigote replication at a final concentration of 50 µM. To evaluate the effect of proteasome inhibition on the infectivity and intracellular development of L. chagasi, murine macropages were challenged with promastigotes from early stationary phase treated with lactacystin. Infectivity of macrophages was the same in lactacystin-treated parasites as in the untreated ones. Contrarywise, the intracellular development of the parasite is impaired by pretreating promastigotes with lactacystin. These promastigotes were able to infect BALB/c peritoneal macrophages but they did not survive inside macrophages. These data indicate the important role of the proteasomes of L. chagasi promastigotes on the intracellular development and replication in host cells in vitro.

A distrofia muscular progressiva no cão Golden Retriever (GRMD) é uma miopatia genética homóloga à Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) que acomete humanos. A utilização do modelo canino é considerada ideal uma vez que a progressão da doença, as manifestações clínicas e a massa corporal se assemelham às apresentadas por meninos doentes. Sabe-se que a degradação de proteínas musculares e atrofia muscular estão intimamente relacionadas com a atuação do sistema catalítico ubiquitina-proteassoma. Estudos utilizando camundongos com distrofia muscular e músculos de humanos DMD (in vitro) tratados com inibidores de proteassoma (MG-132 e bortezomibe) apresentaram restauração da distrofina e das proteínas associadas à distrofina e melhora do fenótipo histopatológico. Nesta pesquisa, foram avaliados cinco cães GRMD, dois tratados com Bortezomibe e três controles. Coletou-se biopsia muscular antes de iniciar o tratamento e ao término do mesmo, para os testes de histologia, ultraestrutura e imunohistoquímica. Foram realizados semanalmente testes bioquímicos e em cada ciclo de aplicação do bortezomibe foi mensurada a taxa de inibição do proteassoma. Na primeira biopsia todos os cães apresentaram morfologia histopatológica das fibras musculares semelhantes. Ao final do tratamento, os cães tratados apresentaram menor deposição de tecido conjuntivo e infiltração de células inflamatórias que os cães não tratados julgados por meio da histologia, morfometria do colágeno e ultraestrutura. Na ultraestrutura observamos infiltração de macrófagos nas fibras, material degenerado, fibroblastos ativados e deposição e tecido conjuntivo em endomísio e perimísio das fibras. Pela análise de imunohistoquímica, não constatamos presença de distrofina na membrana sarcoplasmática de ambos os grupos avaliados. Entretanto, os cães tratados apresentaram maior expressão das proteínas α e β distroglicano, o que sugere uma melhora no fenótipo histopatológico da doença. Nos cães não tratados observou-se maior expressão de phospho- NFκB e TGF-β1 sugerindo maior ativação de fatores pró-apoptóticos e moléculas inflamatórias, e maior deposição de tecido conjuntivo, respectivamente. Os testes de inibição do proteassoma indicaram maior inibição nas células sanguíneas uma hora após a aplicação do bortezomibe e estes de comportaram de forma dose-dependente. Concluímos que os inibidores de proteassoma podem melhorar a morfologia das fibras musculares dos cães GRMD tratados, diminuindo a deposição de colágeno e infiltração de células inflamatórias, bem como restaurar parte das proteínas associadas à distrofina na membrana sarcoplasmática das fibras musculares. / The Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) is a genetic myopathy homologue to Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) in human. Use of canine model is the better because the disease development, clinical signs and body mass are closed to the sick children. It has been known muscle protein proteolysis and muscle atrophy are related with ubiquitin-proteasome pathway. Researches using mdx mice and human muscle (in vitro) treated with proteasome inhibitor (MG-132 and bortezomib) showing rescue of the dystrophin and associated proteins and improvement of histopatologycal phenotype. In this research, were analyzed five GRMD dogs, two dogs were treated with Bortezomib and three dogs were control. Muscle biopsies were collected before the treatment and after the treatment to histology, ultrastructure and immunohistochemical muscle analysis. Biochemistry analyses were made once a week and measurement of proteasome inhibition was analysed in each cycle of Bortezomib administration. In the first byopsy, all the dogs showing closed histophatological morphology of muscle fibers. At the end of treatment, the treated dogs had lower connective tissue deposition and inflammatory cells infiltration than untreated dogs by histology, collagen morphometry and ultrastructural analysis. We noted by ultrastructural analysis macrophages inside the fibers, degenerated products, activated fibroblasts and connective tissue deposition in edomisium and perimisium of the fibers. The dystrophin immunohistochemistry was not presence in sarcoplasmatic membrane in both groups. However, the treated dogs showing bigger expression of α and β-dystroglycan, this fact means improved of disease histopathology phenotype. The untreated dogs had bigger expression of phospho-NFκB and TGF-β1, suggesting bigger activation of pro-apoptotic factors, inflammatory molecules and bigger connective tissue deposition respectively. The proteasome inhibition tests indicated bigger inhibition in the blood cells one hour post doses of bortezomib and was dose-dependent pathway. In conclusion, the proteasome inhibitors may improve the appearance of GRMD muscle fibers, lowered the connective tissue deposition and infiltration of inflammatory cells, likewise to rescue the dystrophin- associated proteins in the muscle fiber membrane.

Nas células eucariotas a maioria das proteínas citoplasmáticas não são degradadas nos lisossomas, mas em organelas altamente conservadas encontradas em humanos, arquibactérias, plantas e leveduras, os proteassomas. Esta estrutura multicatalítica é constituída por componentes menores, cujo núcleo funcional é o componente 20S, que contém várias atividades proteolíticas (tríptica, quimotríptica, de peptidilglutamil peptidase, BrAAP e SNAAP). Esse componente 20S, associado ao complexo regulatório 19S, que é composto de múltiplas ATPases, forma o complexo 26S, responsável pela degradação de proteínas conjugadas com a ubiquitina. Estas estruturas citosólicas certamente desempenham papel importante no desenvolvimento de protozoários parasitas e na sua interação com células dos hospedeiros permissivos. Nesta dissertação, apresentamos um estudo sobre o papel do proteassoma na interação e desenvolvimento de promastigotas de Leishmania chagasi em macrófagos murinos. Inicialmente, purificamos e caracterizamos parcialmente o proteassoma de promastigotas de L. chagasi. Observamos que o complexo presente na L. chagasi possui atividades proteolíticas frente a pelo menos dois substratos sintéticos, LLVY-AMC e LRR-AMC, que avaliam, respectivamente, as atividades quimiotripsina-símile e tripsina-símile. A atividade tripsina-simile é maior que a atividade quimiotripsina-simile; e além disso, esta última é totalmente inibida pela lactacistina, um inibidor específico do proteassoma, enquanto a atividade tripsina-simile é apenas parcialmente inibida. Utilizando a lactacistina foi possível analisar o papel desse complexo proteolítico durante a infecção e desenvolvimento intracelular da L. chagasi. Promastigotas mantidas em cultura na presença de 50μM de lactacistina tiveram seu crescimento bloqueado. Essas promastigotas eram capazes de infectar macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, mas não conseguiam sobreviver dentro desses macrófagos. Esta incapacidade de sobrevivência foi específica para os parasitas tratados com a lactacistina, não sendo observado nos parasitas tratados com outros inibidores de proteases. Estes resultados sugerem que o proteassoma pode ter um papel importante no desenvolvimento intracelular e na replicação das promastigotas de L. chagasi no hospedeiro vertebrado. / Proteasomes are multicatalitic and multisubunit endopeptidase complexes widely distributed in eukaryotic cells. These enzymes are central proteases in the cytosol and nucleus and are involved in removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, in processing and degradation of transcriptional regulators in stress response and in the processing of protein antigens. This multicatalytic proteinase complex is composed of a catalytic core, 20S proteasome, which have multiple proteolytic activities (trypsin-like, chymotrypsin-like, peptidylglutamtyl-peptide hydrolyzing, BrAAP and SNAAP). The 20S proteasome associates with the multisubunit complex 19S to produce the 26S proteasome. The 26S proteasome has specificity for ubiquitinylated protein substrates and hydrolyses ATP during proteolysis of ubiquitinylated proteins. In the present work we have purified a 20S form of proteasome from Leishmania chagasi and partially characterized it. The purified 20S proteasome has activity towards fluorogenic substrates that are cleaved by trypsin or chymotrypsin, and is sensitive to lactacystin, a specific inhibitor of the proteasome. We show that the L.chagasi proteasome the trypsin-like activity is higher than the chymotrypsin-like. Therefore the chymotrypsin-like activity is inhibited by lactacystin and the trypsin-like it is only partially inhibited. We show here that lactacystin blocks in vitro L chagasi promastigote replication at a final concentration of 50 µM. To evaluate the effect of proteasome inhibition on the infectivity and intracellular development of L. chagasi, murine macropages were challenged with promastigotes from early stationary phase treated with lactacystin. Infectivity of macrophages was the same in lactacystin-treated parasites as in the untreated ones. Contrarywise, the intracellular development of the parasite is impaired by pretreating promastigotes with lactacystin. These promastigotes were able to infect BALB/c peritoneal macrophages but they did not survive inside macrophages. These data indicate the important role of the proteasomes of L. chagasi promastigotes on the intracellular development and replication in host cells in vitro.

A distrofia muscular progressiva no cão Golden Retriever (GRMD) é uma miopatia genética homóloga à Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) que acomete humanos. A utilização do modelo canino é considerada ideal uma vez que a progressão da doença, as manifestações clínicas e a massa corporal se assemelham às apresentadas por meninos doentes. Sabe-se que a degradação de proteínas musculares e atrofia muscular estão intimamente relacionadas com a atuação do sistema catalítico ubiquitina-proteassoma. Estudos utilizando camundongos com distrofia muscular e músculos de humanos DMD (in vitro) tratados com inibidores de proteassoma (MG-132 e bortezomibe) apresentaram restauração da distrofina e das proteínas associadas à distrofina e melhora do fenótipo histopatológico. Nesta pesquisa, foram avaliados cinco cães GRMD, dois tratados com Bortezomibe e três controles. Coletou-se biopsia muscular antes de iniciar o tratamento e ao término do mesmo, para os testes de histologia, ultraestrutura e imunohistoquímica. Foram realizados semanalmente testes bioquímicos e em cada ciclo de aplicação do bortezomibe foi mensurada a taxa de inibição do proteassoma. Na primeira biopsia todos os cães apresentaram morfologia histopatológica das fibras musculares semelhantes. Ao final do tratamento, os cães tratados apresentaram menor deposição de tecido conjuntivo e infiltração de células inflamatórias que os cães não tratados julgados por meio da histologia, morfometria do colágeno e ultraestrutura. Na ultraestrutura observamos infiltração de macrófagos nas fibras, material degenerado, fibroblastos ativados e deposição e tecido conjuntivo em endomísio e perimísio das fibras. Pela análise de imunohistoquímica, não constatamos presença de distrofina na membrana sarcoplasmática de ambos os grupos avaliados. Entretanto, os cães tratados apresentaram maior expressão das proteínas α e β distroglicano, o que sugere uma melhora no fenótipo histopatológico da doença. Nos cães não tratados observou-se maior expressão de phospho- NFκB e TGF-β1 sugerindo maior ativação de fatores pró-apoptóticos e moléculas inflamatórias, e maior deposição de tecido conjuntivo, respectivamente. Os testes de inibição do proteassoma indicaram maior inibição nas células sanguíneas uma hora após a aplicação do bortezomibe e estes de comportaram de forma dose-dependente. Concluímos que os inibidores de proteassoma podem melhorar a morfologia das fibras musculares dos cães GRMD tratados, diminuindo a deposição de colágeno e infiltração de células inflamatórias, bem como restaurar parte das proteínas associadas à distrofina na membrana sarcoplasmática das fibras musculares. / The Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) is a genetic myopathy homologue to Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) in human. Use of canine model is the better because the disease development, clinical signs and body mass are closed to the sick children. It has been known muscle protein proteolysis and muscle atrophy are related with ubiquitin-proteasome pathway. Researches using mdx mice and human muscle (in vitro) treated with proteasome inhibitor (MG-132 and bortezomib) showing rescue of the dystrophin and associated proteins and improvement of histopatologycal phenotype. In this research, were analyzed five GRMD dogs, two dogs were treated with Bortezomib and three dogs were control. Muscle biopsies were collected before the treatment and after the treatment to histology, ultrastructure and immunohistochemical muscle analysis. Biochemistry analyses were made once a week and measurement of proteasome inhibition was analysed in each cycle of Bortezomib administration. In the first byopsy, all the dogs showing closed histophatological morphology of muscle fibers. At the end of treatment, the treated dogs had lower connective tissue deposition and inflammatory cells infiltration than untreated dogs by histology, collagen morphometry and ultrastructural analysis. We noted by ultrastructural analysis macrophages inside the fibers, degenerated products, activated fibroblasts and connective tissue deposition in edomisium and perimisium of the fibers. The dystrophin immunohistochemistry was not presence in sarcoplasmatic membrane in both groups. However, the treated dogs showing bigger expression of α and β-dystroglycan, this fact means improved of disease histopathology phenotype. The untreated dogs had bigger expression of phospho-NFκB and TGF-β1, suggesting bigger activation of pro-apoptotic factors, inflammatory molecules and bigger connective tissue deposition respectively. The proteasome inhibition tests indicated bigger inhibition in the blood cells one hour post doses of bortezomib and was dose-dependent pathway. In conclusion, the proteasome inhibitors may improve the appearance of GRMD muscle fibers, lowered the connective tissue deposition and infiltration of inflammatory cells, likewise to rescue the dystrophin- associated proteins in the muscle fiber membrane.

Disfunções da glândula tireóide são, frequentemente, associadas a manifestações cardiovasculares e, em situações de hipertireoidismo, o coração hipertrofia. A hipertrofia cardíaca (HC) consiste em uma resposta adaptativa caracterizada pelo aumento de síntese de proteínas estruturais. O Sistema Ubiquitina Proteassoma (UPS) corresponde ao principal mecanismo de proteólise intracelular e crescentes evidências sugerem seu envolvimento no desenvolvimento da HC. O objetivo do presente estudo foi avaliar a modulação do UPS no tecido cardíaco de animais submetidos ao hipertireoidismo. Os resultados referentes ao aumento da atividade e expressão do proteassoma (PT) cardíaco apresenta-se mais contundente no grupo tratado por 7 dias, período em que a HC já encontra-se estável. Ao término de 14 e 21 dias, a modulação desse sistema tende à normalização. Os resultados obtidos atestam evidências da literatura que sugerem o aumento da atividade do PT cardíaco como resposta compensatória ao aumento de síntese proteica. / Thyroid gland disorders are often associated with cardiovascular events and hyperthyroidism state promotes cardiac hypertrophy (CH). CH consists in adaptive response characterized by increased synthesis of structural proteins. The Ubiquitin Proteasome System (UPS) is the major mechanism of intracellular proteolysis and increased evidences suggest its involvement in the development of CH. The aim of this study was to evaluate the modulation of UPS in cardiac tissue of animals subjected to hyperthyroidism. The results related to the increased proteasome (PT) activity and expression in the heart was more accentuated in the group treated for 7 days, when the CH process finds stable. At the end of 14 and 21 days of hyperthyroidism, the modulation of cardiac UPS achieves standard values. These results suggest an increased activity of cardiac PT as a compensatory response to protein synthesis induced by thyroid hormones.

Disfunções da glândula tireóide são, frequentemente, associadas a manifestações cardiovasculares e, em situações de hipertireoidismo, o coração hipertrofia. A hipertrofia cardíaca (HC) consiste em uma resposta adaptativa caracterizada pelo aumento de síntese de proteínas estruturais. O Sistema Ubiquitina Proteassoma (UPS) corresponde ao principal mecanismo de proteólise intracelular e crescentes evidências sugerem seu envolvimento no desenvolvimento da HC. O objetivo do presente estudo foi avaliar a modulação do UPS no tecido cardíaco de animais submetidos ao hipertireoidismo. Os resultados referentes ao aumento da atividade e expressão do proteassoma (PT) cardíaco apresenta-se mais contundente no grupo tratado por 7 dias, período em que a HC já encontra-se estável. Ao término de 14 e 21 dias, a modulação desse sistema tende à normalização. Os resultados obtidos atestam evidências da literatura que sugerem o aumento da atividade do PT cardíaco como resposta compensatória ao aumento de síntese proteica. / Thyroid gland disorders are often associated with cardiovascular events and hyperthyroidism state promotes cardiac hypertrophy (CH). CH consists in adaptive response characterized by increased synthesis of structural proteins. The Ubiquitin Proteasome System (UPS) is the major mechanism of intracellular proteolysis and increased evidences suggest its involvement in the development of CH. The aim of this study was to evaluate the modulation of UPS in cardiac tissue of animals subjected to hyperthyroidism. The results related to the increased proteasome (PT) activity and expression in the heart was more accentuated in the group treated for 7 days, when the CH process finds stable. At the end of 14 and 21 days of hyperthyroidism, the modulation of cardiac UPS achieves standard values. These results suggest an increased activity of cardiac PT as a compensatory response to protein synthesis induced by thyroid hormones.

Câncer se destaca no contexto de patologias por ser uma das doenças que mais acometem mortes por ano, sendo caracterizada como um conjunto de doenças multifatoriais que tem em comum o crescimento desordenado de células que invadem tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo, dando origem às metástases. Uma importante etapa da cascata metastática é a transição epitélio-mesenquimal (EMT), um processo bem orquestrado que resulta na perda do fenótipo epitelial e aquisição do fenótipo mesenquimal pelas células tumorais, que adquirem carácter invasivo e migratório, além de se tornarem mais resistentes às drogas. Durante este processo, ocorrem inúmeras alterações celulares que modificam a estabilidade proteica e/ou promovem sua translocação subcelular, o transporte de proteínas para a membrana, alterações no citoesqueleto e incluindo o envio de proteínas para degradação pelo proteassoma. A desregulação de fatores de transcrição e modificação pós traducional de proteínas são fatores que podem levar à EMT. Após a eficiente indução da EMT in vitro utilizando o inibidor de histonas deacetilase (SAHA) em células de adenocarcinoma de mama MCF-7, foram realizadas análises proteômicas envolvimento os inibidores relacionados ao sistema ubiquitina proteassoma, MG132 e P5091. A modulação por inibição de USP7 resultou em variação da expressão de diversas proteínas biomarcadoras da EMT (SNAIL, ?-Catenina, CDK1) e proteínas envolvidas no ciclo celular (P53 e CDK1). O estudo proteômico permitiu a correlação do processo da EMT por SAHA com as vias de modificações pós traducionais relacionadas ao sistema ubiquitina proteassoma, e ainda propõe USP7 como alvo de estudos detalhados para EMT com potencial proposta terapêutica / Cancer stands out in the context of pathologies because it is one of the diseases that most affect deaths per year, being characterized as a set of multifactorial diseases that has in common the disordered growth of cells that invade tissues and organs, being able to spread to other regions of the body, giving rise to metastases. An important step in the metastatic cascade is the epithelial-mesenchymal transition (EMT), a well-orchestrated process that results in the loss of the epithelial phenotype and acquisition of the mesenchymal phenotype by the tumor cells that acquire a more invasive and migratory character, and become more resistant to drugs. During this process, numerous cellular alterations occur that modify the protein stability and/or promote its subcellular translocation, the transport of proteins to the membrane, changes in the cytoskeleton and including the sending of proteins for degradation by the proteasome. Deregulation of transcription factors and posttranslational modification of proteins are factors that can lead to EMT. After an efficient induction of EMT using the histone deacetylase inhibitor (SAHA) in MCF-7 breast adenocarcinoma cells, proteomic analyzes were performed involving inhibitors related to the ubiquitin proteasome system, MG132 and P5091. Modulation by inhibition of USP7 resulted in varying expression of various EMT biomarker proteins (SNAIL, ?-Catenina, CDK1) and cell cycle (P53 e CDK1). The proteomic study allowed the correlation of the SAHA EMT process with the posttranslational modifications pathways related to the ubiquitin proteasome system and also proposes USP7 as the target of detailed studies for EMT with potential therapeutic proposal

A esquistossomose mansônica é a segunda maior endemia parasitária do mundo em termos de extensão das áreas endêmicas e do número de pessoas infectadas com 200 milhões de pessoas acometidas. Esta doença é causada pelo parasito trematódeo Schistosoma mansoni, o qual apresenta adequados mecanismos de resposta ao estresse envolvendo a regulação da expressão gênica e proteica, reparo ou substituição de moléculas danificadas, recuperação do balanço redox, controle do ciclo celular e apoptose. O sistema ubiquitina- proteassoma é importante para manter a homeostase proteica durante o estresse celular. Inibidores do proteassoma podem interferir em processos como crescimento, progressão do ciclo celular e replicação, e os seus efeitos vem sendo caracterizados em muitos parasitos. Nosso laboratório demonstrou que MG132 reduz o número de esquistossômulos, a carga parasitária e a ovoposição em camundongos infectados com S. mansoni. Neste trabalho, são descritos os efeitos in vitro do estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico em vermes adultos de S. mansoni. Observou-se alteração no perfil de expressão proteica durante estresse oxidativo e térmico, sendo identificadas dezoito proteínas upreguladas nestas condições. Estas proteínas estão envolvidas em muitas vias intracelulares como dobramento de proteínas, proteólise, ligação a íons cálcio, regulação de proteínas e resposta a estresse. Além disso, o estresse oxidativo gerou mudanças em vermes adultos de S. mansoni em processos como produção de ovos, motilidade, morfologia do tegumento, viabilidade e pareamento dos vermes. O estresse químico induzido com Curcumina, IBMX e MG132 aumentou a produção de ROS intracelular e alterou o perfil de expressão de enzimas antioxidantes em S. mansoni. As enzimas SmGPx1 e SmPGx2 tiveram a expressão aumentada no estresse com Curcumina e IBMX, enquanto que SmSOD e SmTGR foram induzidas no estresse com Curcumina. As enzimas do proteassoma SmHul5 e SmUbp6 tiveram a expressão modulada durante o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico. Em adição, a análise de expressão no ciclo de vida de S. mansoni revelou que estes genes apresentam um nível alto de expressão em esporocistos, esquistossômulos e miracídios. Estes resultados sugerem que estas proteínas acessórias do proteassoma participam da resposta ao estresse e desenvolvimento do parasito. O nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6 foi cerca 9 e 16 vezes menor em relação ao controle no estresse químico induzido com IBMX, respectivamente, sugerindo a desmontagem do proteassoma. Por outro lado, Curcumina, MG132, estresse oxidativo e choque térmico aumentaram o nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6. Além disso, o nível de expressão da proteína de maturação do proteassoma (SmPOMP) aumentou no estresse com Curcumina, MG132 e estresse oxidativo, sugerindo a síntese de novas populações de proteassoma. Em relação ao estresse oxidativo, nós demonstramos o aumento no nível proteico de proteassoma 20S e da subunidade alfa-3 do proteassoma sugerindo que em S. mansoni as proteínas oxidadas são degradadas pelo proteassoma 20S. Além do mais, nós observamos que vermes adultos de S. mansoni parecem utilizar mecanismos de resposta similares para diferentes estresses. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico modificam o perfil de expressão de genes relacionados ao sistema ubiquitina-proteassoma e sugerem que o proteassoma é importante para as respostas celulares ao estresse neste parasito. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease caused by blood flukes (genus Schistosoma) and affecting 200 million people worldwide. This disease continues to rank, following malaria, at the second position of the world\'s parasitic diseases in terms of the extent of endemic areas and the number of infected people. There are different types of stress and the organisms have many mechanisms to respond to these stressor agents. The responses involve the regulation of gene and protein expression and consist in events such as repair or substitution of damaged molecules, recovery of redox balance, cell cycle control and apoptosis. The proteasomal system is important to support the protein homeostasis during the cellular stress. Effect of proteasome inhibitors has been described in many protozoans, either inhibiting growth or cell cycle progression, or blocking replication. Our laboratory\'s results have shown that MG132 reduces the number of lung stage schistosomula, the worm burden and consequently decreases oviposition in S. mansoni-infected mice. Here, we describe the in vitro effects of oxidative stress, heat shock and chemical stress in S. mansoni adult worms. We report that the oxidative stress and heat shock cause drastic changes in the protein profile of S. mansoni adult worms, and we identified a total of eighteen upregulated proteins in these conditions. These proteins are involved with many intracellular pathways as protein folding, proteolysis, calcium ion binding, regulator proteins and stress response. In addition, oxidative stress induced with H2O2 generated significative changes in the adult worms concerning process such as egg production, motor activity, tegument morphology, viability and pairing of worms. Chemical stress induced with Curcumin, IBMX and MG132 increases ROS production and changes the gene expression profile of antioxidant enzymes of S. mansoni adult worms. The enzymes SmGPx1 and SmGPx2 were upregulated in Curcumin and IBMXinduced chemical stress, and both SmSOD and SmTGR were upregulated- Curcumin. The proteasomal enzymes SmHul5 and SmUbp6 had their gene expression modified during oxidative stress, heat shock and chemical stress. Besides of, expression analyses in the S. mansoni life cycle indicate that genes are different express in sporocyst, schistosomula and miracidia. These results suggest these accessory proteins proteasome participates of stress response and parasite development. The expression level of SmHul5 and SmUbp6 were 16 and 9 times less than the control in chemical stress induced by IBMX, and we suggest that these results are due to the proteasome disassembling. On the other hand, Curcumin, MG132, oxidative stress e heat shock increases the expression of SmHul5 and SmUbp6. Furthermore, the expression level of maturation proteasome protein (SmPOMP) increases in stress induced by Curcumin, MG132 and oxidative stress suggesting new proteasome synthesis. In addition, we demonstrate increase the both 20S level and alpha-3 subunit proteasome in the oxidative stress, suggesting that in S. mansoni oxidized protein formed due to oxidative damage are degrade by proteasome 20S. We observed that S. mansoni adult worms utilize similar mechanisms to respond different stresses. Ours results demonstrate that oxidative stress, heat shock and chemical stress modified the expression profile of genes related with the ubiquitinproteasome system and suggest that the proteasome is important to responses the cellular stresses in the parasite.

Os produtos do metabolismo secundário, também conhecidos por produtos naturais, representam uma fonte inexplorada de compostos com atividade biológica. Os micro-organismos, entre eles os endófitos, são fontes promissoras de obtenção dessas substâncias. Assim sendo, essa pesquisa visou obter compostos de importância biotecnológica produzidos por fungos endofíticos isolados de folhas das plantas Anthurium alcatrazense, Begonia venosa e B. fischeri. Para isso, 5 linhagens de fungos endofíticos isolados dessas plantas (códigos P7BDA1F2, P8BDA1F1, AM29, D28 e D29) foram estudadas. A identificação desses micro-organismos foi realizada por meio de análises morfológicas e moleculares, revelando serem estas linhagens Hymenochaete-like, Trichoderma sp., Neopestalotiopsis sp., Aspergillus sp. e Diaporthe sp., respectivamente. A partir do extrato bruto de Hymenochaete-like (código P7BDA1F2) foram isolados os compostos 5,7-dimetoxiftalida e metil orselinato, os quais foram testados contra Leishmania (L.) infantum e alvo do proteassoma e não apresentaram atividade. A partir do extrato bruto de Trichoderma sp. (código P8BDA1F1) foram isolados os compostos trilongins BI-BIV. Estes apresentaram atividade inibitória ao fitopatógeno C. gloeosporioides, com MIC de 40, 320, 160 e 310 μM, respectivamente. As trilongins BI-BIV foram testadas contra a subunidade ChTL do proteassoma e apresentaram os valores de IC50 de 6,5 ± 2,7; 4,7 ± 1,8; 6,3 ± 2,2; e 2,7 ± 0,5 μM. Os compostos também foram testados ex vivo contra os amastigotas intracelulares de Leishmania (L.) infantum, mas não apresentaram seletividade. A partir do extrato bruto de Neopestalotiopsis sp. (código AM29), foi isolado um composto de massa molecular 366,0570 Da (que pode ser inédito na literatura), o qual apresentou atividade inibitória ao fitopatógeno P. sojae, com MIC de 312 μg mL-1. A partir dos extratos brutos de Aspergillus sp. e Diaporthe sp. foram isolados 9 compostos, cujas frações precursoras apresentaram atividade contra as bactérias formadoras de biofilme S. aureus e P. aeruginosa. Para a identificação desses compostos, análises adicionais precisam ser realizadas. Este é o primeiro relato do isolamento dos compostos 5,7-dimetoxiftalida e metil orselinato do basidiomiceto Hymenochaete-like. Também está sendo relatada pela primeira vez a atividade antifúngica das trilongins a C. gloeosporioides e contra o alvo do proteassoma, assim como o isolamento de um possível novo composto de Neopestalotiopsis sp. e sua atividade contra P. sojae. / Secondary metabolism products, also known as natural products, represent an unexplored source of compounds with biological activity. Microorganisms, including endophytes, are promising sources of these substances. Thus, this research aimed to obtain compounds with biotechnological importance produced by endophytic fungi isolated from leaves of the plants Anthurium alcatrazense, Begonia venosa and B. fischeri. To this end, 5 endophytic fungal strains isolated from these plants (codes P7BDA1F2, P8BDA1F1, AM29, D28 and D29) were studied. The identification of these microorganisms was carried out by morphological and molecular analyzes, revealing that these strains are Hymenochaete-like, Trichoderma sp., Neopestalotiopsis sp., Aspergillus sp. and Diaporthe sp., respectively. From the crude extract of Hymenochaete-like (code P7BDA1F2) the compounds 5,7-dimethoxyphthalide and methyl orselinate were isolated, which were tested against Leishmania (L.) infantum and proteasome target and showed no activity. From the crude extract of Trichoderma sp. (code P8BDA1F1) the trilongins BI-BIV were isolated. These compounds presented inhibitory activity to the plant pathogen C. gloeosporioides, with MIC of 40, 320, 160 and 310 μM, respectively. The trilongins BI-BIV were tested against the ChTL subunit of the proteasome and showed IC50 values of 6.5 ± 2.7, 4.7 ± 1.8, 6.3 ± 2.2, 2.7 ± 0, 5 μM. The compounds were also tested ex vivo against the intracellular amastigotes of Leishmania (L.) infantum, but did not show selectivity. From the crude extract of Neopestalotiopsis sp. (code AM29), a compound with molecular mass 366.0570 Da (which can be unpublished in the literature) was isolated, which presented inhibitory activity to the plant pathogen P. sojae, with MIC of 312 μg mL-1. From the crude extracts of Aspergillus sp. and Diaporthe sp. 9 compounds were isolated, whose precursor fractions showed activity against the biofilm forming bacteria S. aureus and P. aeruginosa. For the identification of these compounds, additional analyzes need to be performed. This is the first report of the isolation of the compounds 5,7-dimethoxyphthalide and methyl orselinate from the basidiomycete Hymenochaete-like. The antifungal activity of trilongins to C. gloeosporioides and against the proteasome target is also being reported for the first time, as well as the isolation of a possible new compound from Neopestalotiopsis sp. and its activity against P. sojae.

Os produtos do metabolismo secundário, também conhecidos por produtos naturais, representam uma fonte inexplorada de compostos com atividade biológica. Os micro-organismos, entre eles os endófitos, são fontes promissoras de obtenção dessas substâncias. Assim sendo, essa pesquisa visou obter compostos de importância biotecnológica produzidos por fungos endofíticos isolados de folhas das plantas Anthurium alcatrazense, Begonia venosa e B. fischeri. Para isso, 5 linhagens de fungos endofíticos isolados dessas plantas (códigos P7BDA1F2, P8BDA1F1, AM29, D28 e D29) foram estudadas. A identificação desses micro-organismos foi realizada por meio de análises morfológicas e moleculares, revelando serem estas linhagens Hymenochaete-like, Trichoderma sp., Neopestalotiopsis sp., Aspergillus sp. e Diaporthe sp., respectivamente. A partir do extrato bruto de Hymenochaete-like (código P7BDA1F2) foram isolados os compostos 5,7-dimetoxiftalida e metil orselinato, os quais foram testados contra Leishmania (L.) infantum e alvo do proteassoma e não apresentaram atividade. A partir do extrato bruto de Trichoderma sp. (código P8BDA1F1) foram isolados os compostos trilongins BI-BIV. Estes apresentaram atividade inibitória ao fitopatógeno C. gloeosporioides, com MIC de 40, 320, 160 e 310 μM, respectivamente. As trilongins BI-BIV foram testadas contra a subunidade ChTL do proteassoma e apresentaram os valores de IC50 de 6,5 ± 2,7; 4,7 ± 1,8; 6,3 ± 2,2; e 2,7 ± 0,5 μM. Os compostos também foram testados ex vivo contra os amastigotas intracelulares de Leishmania (L.) infantum, mas não apresentaram seletividade. A partir do extrato bruto de Neopestalotiopsis sp. (código AM29), foi isolado um composto de massa molecular 366,0570 Da (que pode ser inédito na literatura), o qual apresentou atividade inibitória ao fitopatógeno P. sojae, com MIC de 312 μg mL-1. A partir dos extratos brutos de Aspergillus sp. e Diaporthe sp. foram isolados 9 compostos, cujas frações precursoras apresentaram atividade contra as bactérias formadoras de biofilme S. aureus e P. aeruginosa. Para a identificação desses compostos, análises adicionais precisam ser realizadas. Este é o primeiro relato do isolamento dos compostos 5,7-dimetoxiftalida e metil orselinato do basidiomiceto Hymenochaete-like. Também está sendo relatada pela primeira vez a atividade antifúngica das trilongins a C. gloeosporioides e contra o alvo do proteassoma, assim como o isolamento de um possível novo composto de Neopestalotiopsis sp. e sua atividade contra P. sojae. / Secondary metabolism products, also known as natural products, represent an unexplored source of compounds with biological activity. Microorganisms, including endophytes, are promising sources of these substances. Thus, this research aimed to obtain compounds with biotechnological importance produced by endophytic fungi isolated from leaves of the plants Anthurium alcatrazense, Begonia venosa and B. fischeri. To this end, 5 endophytic fungal strains isolated from these plants (codes P7BDA1F2, P8BDA1F1, AM29, D28 and D29) were studied. The identification of these microorganisms was carried out by morphological and molecular analyzes, revealing that these strains are Hymenochaete-like, Trichoderma sp., Neopestalotiopsis sp., Aspergillus sp. and Diaporthe sp., respectively. From the crude extract of Hymenochaete-like (code P7BDA1F2) the compounds 5,7-dimethoxyphthalide and methyl orselinate were isolated, which were tested against Leishmania (L.) infantum and proteasome target and showed no activity. From the crude extract of Trichoderma sp. (code P8BDA1F1) the trilongins BI-BIV were isolated. These compounds presented inhibitory activity to the plant pathogen C. gloeosporioides, with MIC of 40, 320, 160 and 310 μM, respectively. The trilongins BI-BIV were tested against the ChTL subunit of the proteasome and showed IC50 values of 6.5 ± 2.7, 4.7 ± 1.8, 6.3 ± 2.2, 2.7 ± 0, 5 μM. The compounds were also tested ex vivo against the intracellular amastigotes of Leishmania (L.) infantum, but did not show selectivity. From the crude extract of Neopestalotiopsis sp. (code AM29), a compound with molecular mass 366.0570 Da (which can be unpublished in the literature) was isolated, which presented inhibitory activity to the plant pathogen P. sojae, with MIC of 312 μg mL-1. From the crude extracts of Aspergillus sp. and Diaporthe sp. 9 compounds were isolated, whose precursor fractions showed activity against the biofilm forming bacteria S. aureus and P. aeruginosa. For the identification of these compounds, additional analyzes need to be performed. This is the first report of the isolation of the compounds 5,7-dimethoxyphthalide and methyl orselinate from the basidiomycete Hymenochaete-like. The antifungal activity of trilongins to C. gloeosporioides and against the proteasome target is also being reported for the first time, as well as the isolation of a possible new compound from Neopestalotiopsis sp. and its activity against P. sojae.