DNA is often damaged by environmental agents which lead to the up-regulation of several genes involved in different repair pathways. The regulation of DNA repair is important for cell survival following exposure to DNA-damaging agents. Schistosoma mansoni is a parasite that undergoes several modifications in its complex life cycle, being exposed to a subset of DNA-damaging agents, such as the environment and host immune response, and therefore, such as many other organisms, it is likely to be provided for efficient repair mechanisms. Recently, studies have shown that Nucleotide Excision Repair (NER) consists in an indispensable mechanism for removing a broad spectrum of DNA lesions. In the current study, it was analyzed the gene expression of Nucleotide Excision Repair Factor 2 (NEF2) - SmRad23 and SmRad4, in different developmental stages of S. mansoni, as well as the expression level of these genes in S. mansoni adult worms treated with DNA-damaging agents. Together, the results have confirmed the expression of these two proteins in all of the evolutive stages studied of the parasite, and shown a differential expression in front of the treatment with the different chemical agents. Furthermore, it was revealed the correlation of these genes with their orthologues in other eukaryotes. Therefore, the presence of SmRad23 and SmRad4 in all of the developmental stages of S. mansoni, as well as their differential expression following exposition to DNA-damaging agents, suggest that the NER is an important repair pathway during the complex life cycle of this parasite. / O DNA é freqüentemente danificado por agentes ambientais que levam à ativação de vários genes envolvidos em diferentes vias de reparo. A regulação do reparo do DNA é importante para a sobrevida da célula mediante exposição a agentes causadores de dano. Schistosoma mansoni é um parasito que passa por várias modificações em seu complexo ciclo de vida, estando exposto a uma série de agentes lesivos ao DNA, tais como aqueles presentes no meio ambiente e na própria resposta imune do hospedeiro, e, portanto, assim como muitos outros organismos, é provável que seja provido de eficientes mecanismos de reparo. Recentemente, estudos têm demonstrado que a via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) consiste em um mecanismo indispensável em eucariotos para a remoção de um amplo espectro lesões no DNA. No presente estudo, foi analisada a expressão gênica do fator de reparo por excisão de nucleotídeos 2 (NEF2) - SmRad23 e SmRad4, em diferentes estágios de desenvolvimento de S. mansoni, assim como o nível de expressão destes genes em vermes adultos tratados com agentes lesivos ao DNA. Em conjunto, os resultados confirmaram a expressão dessas duas proteínas em todos os estágios evolutivos estudados do parasito, e mostraram uma expressão diferencial destes genes mediante tratamento com os diferentes agentes químicos. Além disso, foi revelada a correlação destes genes com seus ortólogos em outros eucariotos. Portanto, a presença de SmRad23 e SmRad4, em todos os estágios de desenvolvimento de S. mansoni, bem como sua expressão diferencial mediante exposição a agentes lesivos ao DNA, sugere que NER constitui uma importante via de reparo durante o complexo ciclo de vida deste parasito. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

A esquistossomose mansônica é a segunda maior endemia parasitária do mundo em termos de extensão das áreas endêmicas e do número de pessoas infectadas com 200 milhões de pessoas acometidas. Esta doença é causada pelo parasito trematódeo Schistosoma mansoni, o qual apresenta adequados mecanismos de resposta ao estresse envolvendo a regulação da expressão gênica e proteica, reparo ou substituição de moléculas danificadas, recuperação do balanço redox, controle do ciclo celular e apoptose. O sistema ubiquitina- proteassoma é importante para manter a homeostase proteica durante o estresse celular. Inibidores do proteassoma podem interferir em processos como crescimento, progressão do ciclo celular e replicação, e os seus efeitos vem sendo caracterizados em muitos parasitos. Nosso laboratório demonstrou que MG132 reduz o número de esquistossômulos, a carga parasitária e a ovoposição em camundongos infectados com S. mansoni. Neste trabalho, são descritos os efeitos in vitro do estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico em vermes adultos de S. mansoni. Observou-se alteração no perfil de expressão proteica durante estresse oxidativo e térmico, sendo identificadas dezoito proteínas upreguladas nestas condições. Estas proteínas estão envolvidas em muitas vias intracelulares como dobramento de proteínas, proteólise, ligação a íons cálcio, regulação de proteínas e resposta a estresse. Além disso, o estresse oxidativo gerou mudanças em vermes adultos de S. mansoni em processos como produção de ovos, motilidade, morfologia do tegumento, viabilidade e pareamento dos vermes. O estresse químico induzido com Curcumina, IBMX e MG132 aumentou a produção de ROS intracelular e alterou o perfil de expressão de enzimas antioxidantes em S. mansoni. As enzimas SmGPx1 e SmPGx2 tiveram a expressão aumentada no estresse com Curcumina e IBMX, enquanto que SmSOD e SmTGR foram induzidas no estresse com Curcumina. As enzimas do proteassoma SmHul5 e SmUbp6 tiveram a expressão modulada durante o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico. Em adição, a análise de expressão no ciclo de vida de S. mansoni revelou que estes genes apresentam um nível alto de expressão em esporocistos, esquistossômulos e miracídios. Estes resultados sugerem que estas proteínas acessórias do proteassoma participam da resposta ao estresse e desenvolvimento do parasito. O nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6 foi cerca 9 e 16 vezes menor em relação ao controle no estresse químico induzido com IBMX, respectivamente, sugerindo a desmontagem do proteassoma. Por outro lado, Curcumina, MG132, estresse oxidativo e choque térmico aumentaram o nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6. Além disso, o nível de expressão da proteína de maturação do proteassoma (SmPOMP) aumentou no estresse com Curcumina, MG132 e estresse oxidativo, sugerindo a síntese de novas populações de proteassoma. Em relação ao estresse oxidativo, nós demonstramos o aumento no nível proteico de proteassoma 20S e da subunidade alfa-3 do proteassoma sugerindo que em S. mansoni as proteínas oxidadas são degradadas pelo proteassoma 20S. Além do mais, nós observamos que vermes adultos de S. mansoni parecem utilizar mecanismos de resposta similares para diferentes estresses. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico modificam o perfil de expressão de genes relacionados ao sistema ubiquitina-proteassoma e sugerem que o proteassoma é importante para as respostas celulares ao estresse neste parasito. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease caused by blood flukes (genus Schistosoma) and affecting 200 million people worldwide. This disease continues to rank, following malaria, at the second position of the world\'s parasitic diseases in terms of the extent of endemic areas and the number of infected people. There are different types of stress and the organisms have many mechanisms to respond to these stressor agents. The responses involve the regulation of gene and protein expression and consist in events such as repair or substitution of damaged molecules, recovery of redox balance, cell cycle control and apoptosis. The proteasomal system is important to support the protein homeostasis during the cellular stress. Effect of proteasome inhibitors has been described in many protozoans, either inhibiting growth or cell cycle progression, or blocking replication. Our laboratory\'s results have shown that MG132 reduces the number of lung stage schistosomula, the worm burden and consequently decreases oviposition in S. mansoni-infected mice. Here, we describe the in vitro effects of oxidative stress, heat shock and chemical stress in S. mansoni adult worms. We report that the oxidative stress and heat shock cause drastic changes in the protein profile of S. mansoni adult worms, and we identified a total of eighteen upregulated proteins in these conditions. These proteins are involved with many intracellular pathways as protein folding, proteolysis, calcium ion binding, regulator proteins and stress response. In addition, oxidative stress induced with H2O2 generated significative changes in the adult worms concerning process such as egg production, motor activity, tegument morphology, viability and pairing of worms. Chemical stress induced with Curcumin, IBMX and MG132 increases ROS production and changes the gene expression profile of antioxidant enzymes of S. mansoni adult worms. The enzymes SmGPx1 and SmGPx2 were upregulated in Curcumin and IBMXinduced chemical stress, and both SmSOD and SmTGR were upregulated- Curcumin. The proteasomal enzymes SmHul5 and SmUbp6 had their gene expression modified during oxidative stress, heat shock and chemical stress. Besides of, expression analyses in the S. mansoni life cycle indicate that genes are different express in sporocyst, schistosomula and miracidia. These results suggest these accessory proteins proteasome participates of stress response and parasite development. The expression level of SmHul5 and SmUbp6 were 16 and 9 times less than the control in chemical stress induced by IBMX, and we suggest that these results are due to the proteasome disassembling. On the other hand, Curcumin, MG132, oxidative stress e heat shock increases the expression of SmHul5 and SmUbp6. Furthermore, the expression level of maturation proteasome protein (SmPOMP) increases in stress induced by Curcumin, MG132 and oxidative stress suggesting new proteasome synthesis. In addition, we demonstrate increase the both 20S level and alpha-3 subunit proteasome in the oxidative stress, suggesting that in S. mansoni oxidized protein formed due to oxidative damage are degrade by proteasome 20S. We observed that S. mansoni adult worms utilize similar mechanisms to respond different stresses. Ours results demonstrate that oxidative stress, heat shock and chemical stress modified the expression profile of genes related with the ubiquitinproteasome system and suggest that the proteasome is important to responses the cellular stresses in the parasite.

O Controle de qualidade de proteína (CQP) consiste na supervisão e no processamento de proteínas danificadas por meio de processos catalíticos (proteassoma e autofagia). Nesse estudo, caracterizamos o CQP, bem como os benefícios da ativação β2-adrenérgica (β2-AR) modulador positivo do CQP, em modelo animal de disfunção/atrofia muscular induzida por constrição crônica do nervo isquiático (CCI). Observamos que, apesar de um aumento na atividade catalítica, a atrofia está associada à um CQP insuficiente, detectado por um acúmulo de proteínas citotóxicas nessa musculatura. O tratamento com Formoterol (agonista β2-AR) aumentou a atividade proteassomal e restaurou o fluxo de degradação via autofagia, resultando na melhora do CQP e da miopatia esquelética. A inibição da autofagia, mas não do proteassoma, foi capaz de abolir os efeitos do Formoterol na CCI. Nossos resultados sugerem uma nova contribuição da sinalização β2-AR no quadro de miopatia esquelética, no qual sua ativação foi capaz de restaurar o CQP, contribuindo para a melhora do trofismo e função muscular. / The protein quality control (PQC) detects, repairs and disposes cytotoxic proteins through different proteolytic systems (proteasome and autophagy). Here, we characterized the PQC profile as well as the benefits of sustained β2-adrenoceptor activation (β2-AR) a positive PQC modulator, during skeletal muscle atrophy in a rat model of sciatic nerve constriction (SNC). PQC is disrupted in SNC rats, demonstrated by elevated proteasomal and lysosomal activities along with accumulation of cytotoxic proteins and pro-apoptotic factors. The β2-AR activation (Formoterol) promotes a further increase in proteasomal activity, along with autophagic flux reestablishment. Of interest, sustained autophagy inhibition, but not proteasomal inhibition, is sufficient to abolish Formoterol effects on skeletal muscle PQC, mass and strength. These findings suggest a new contribution of β2-AR signalling pathway to the pathophysiology of skeletal muscle where β2-AR restores the impaired PQC, therefore contributing to a better skeletal muscle morphology and function.

O proteassoma 26S é uma estrutura em forma de barril com um núcleo catalítico 20S que é flanqueado por tampas 19S em ambos os lados. Nosso grupo tem demonstrado que o proteassoma 26S é crítico para o desenvolvimento e sobrevivência do Schistosoma mansoni, sendo que mais de 95% dos casais de vermes tratados com o inibidor de proteassoma MG132 apresentaram alteração na postura dos ovos e viabilidade. O tampão 19S é o complexo regulador e funciona no desdobramento e na desubiquitinação das proteínas, antes de sua entrada no complexo 20S, usando enzimas desubiquitinadoras (DUBS). Recentemente, foi demonstrado que a inibição das DUBS, UCHL5 e USP14, que estão reversivelmente ligadas à partícula 19S do complexo 26S, chamada b-AP15, resulta em autofagia, seguida de morte celular, pois leva uma variedade de células de mamíferos ao estresse oxidativo. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o efeito da droga sobre o desenvolvimento reprodutivo de S. mansoni e como possível alvo terapêutico, tendo como objetivos específicos determinar os seus efeitos: na inibição da oviposição in vitro de casais de parasitas Schistosoma mansoni através da contagem dos ovos e expressão do gene p14; avaliar se os órgãos reprodutores dos parasitas sofreram alguma modificação estrutural; se a substância utilizada leva a autofagia; se o tratamento dos casais de parasita com a droga leva a apoptose, ocasionada pela ativação de caspase-3. Este estudo é o primeiro a documentar o papel da droga b-AP15 como um agente esquistossomicida, pois desencadeia alterações ultraestruturais em casais de vermes de S. mansoni. Os seguintes métodos foram utilizados para analisar as alterações: Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), Varredura (MEV) e Confocal; ensaio quantitativo colorimétrico baseado no brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT), atividade do proteassoma através do substrato Suc-Leu-Le-Al-Tyr-AMC específico para atividade de quimotripsina-like; western blotting; Reação de Polimerase em Cadeia em tempo real e TUNEL. Foram testadas várias concentrações do fármaco (0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 até 50 µM), sendo que a partir de 1,6 µM de b-AP15 ocorreu a inibição da produção de ovos dos casais de parasitas tratados in vitro por 24 h, não havendo alteração da viabilidade, mas mostrou alterações a partir da dosagem de 3,2 µM. A partir de 1,6 µM ocorreram alterações celulares e tegumentares e vermes adultos tratados com 50 µM estavam mortos. O Western blotting mostrou acúmulo de proteínas poliubiquitinadas de alto peso molecular na presença de 1,6µM, havendo mudanças na atividade quimotripsina-like do proteassoma 20S. Os resultados mostraram que o b-AP15 altera a oviposição, a viabilidade e leva à morte de casais de parasitas, reforçando a hipótese de que o sistema ubiquitina/ proteassoma e que as enzimas deubiquitinadoras ligadas a partícula 19S são essenciais para a biologia de S. mansoni. / The 26S proteasome is a barrel structure with a catalytic core 20S that is flanked by 19S caps on both sides. Our group has been showed that 26S proteasomes are critical for Schistosoma mansoni development and survival, being that more than 95% of worms pairs treated with the proteasome inhibitor MG132 showed alteration on egg laying and viability. The 19S cap is the regulatory complex and functions in unfolding and deubiquitinating the proteins before their entry into the 20S complex using constitutive deubiquitinating enzymes (DUBS). Recently, it has been demonstrated that inhibition of the DUBS, UCHL5 and USP14, which are reversibly bound to the 19S particle of the 26S complex, called b-AP15 , results in cell death because it leads to autophagy, followed by cell death in a variety of mammalian cells. The general objective of this work was to evaluate the effect of the drug on the reproductive development of S. mansoni and as a possible therapeutic target. The specific objectives to determine its effects: in inhibiting the in vitro oviposition of couples of Schistosoma mansoni parasites by counting eggs and p14 gene expression; evaluate whether the reproductive organs of the parasites have undergone some structural modification; if the substance used leads to autophagy; if the treatment of the parasite couples with the drug leads to apoptosis, caused by the activation of caspase-3. This study is the first to document the role of the b-AP15 drug as a schistosomicidal agent, as it triggers ultrastructural changes in couples of S. mansoni worms. The following methods were used to analyze the changes: Transmission Electron Microscopy (MET), Scanning (SEM) and Confocal; Colorimetric assay based on 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), proteasome activity through Suc-Leu-Le-Al-Tyr-AMC substrate specific for chymotrypsin-like activity; western blotting; Polymerase chain reaction in real time and TUNEL. Various concentrations of the drug (0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 to 50 ?M) were tested. 1.6 ?M b-AP15 occurred the inhibition of egg production of couples of parasites treated in vitro for 24 h, with no change in viability, but showed changes from the dosage of 3.2 ?M. Cell and tegumentary changes occurred in 1.6 ?M and adult worms treated with 50 ?M were dead. Western blotting showed accumulation of high molecular weight polyubiquitinated proteins in the presence of 1.6?M, with changes in the chymotrypsin-like activity of the 20S proteasome. The results showed that b-AP15 alters the oviposition, viability and leads to the death of couples of parasites, reinforcing the hypothesis that the ubiquitin / proteasome system and the deubiquitinating enzymes bound to the 19S particle are essential for the biology of S. mansoni.

O proteassoma 26S é uma estrutura em forma de barril com um núcleo catalítico 20S que é flanqueado por tampas 19S em ambos os lados. Nosso grupo tem demonstrado que o proteassoma 26S é crítico para o desenvolvimento e sobrevivência do Schistosoma mansoni, sendo que mais de 95% dos casais de vermes tratados com o inibidor de proteassoma MG132 apresentaram alteração na postura dos ovos e viabilidade. O tampão 19S é o complexo regulador e funciona no desdobramento e na desubiquitinação das proteínas, antes de sua entrada no complexo 20S, usando enzimas desubiquitinadoras (DUBS). Recentemente, foi demonstrado que a inibição das DUBS, UCHL5 e USP14, que estão reversivelmente ligadas à partícula 19S do complexo 26S, chamada b-AP15, resulta em autofagia, seguida de morte celular, pois leva uma variedade de células de mamíferos ao estresse oxidativo. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o efeito da droga sobre o desenvolvimento reprodutivo de S. mansoni e como possível alvo terapêutico, tendo como objetivos específicos determinar os seus efeitos: na inibição da oviposição in vitro de casais de parasitas Schistosoma mansoni através da contagem dos ovos e expressão do gene p14; avaliar se os órgãos reprodutores dos parasitas sofreram alguma modificação estrutural; se a substância utilizada leva a autofagia; se o tratamento dos casais de parasita com a droga leva a apoptose, ocasionada pela ativação de caspase-3. Este estudo é o primeiro a documentar o papel da droga b-AP15 como um agente esquistossomicida, pois desencadeia alterações ultraestruturais em casais de vermes de S. mansoni. Os seguintes métodos foram utilizados para analisar as alterações: Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), Varredura (MEV) e Confocal; ensaio quantitativo colorimétrico baseado no brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT), atividade do proteassoma através do substrato Suc-Leu-Le-Al-Tyr-AMC específico para atividade de quimotripsina-like; western blotting; Reação de Polimerase em Cadeia em tempo real e TUNEL. Foram testadas várias concentrações do fármaco (0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 até 50 µM), sendo que a partir de 1,6 µM de b-AP15 ocorreu a inibição da produção de ovos dos casais de parasitas tratados in vitro por 24 h, não havendo alteração da viabilidade, mas mostrou alterações a partir da dosagem de 3,2 µM. A partir de 1,6 µM ocorreram alterações celulares e tegumentares e vermes adultos tratados com 50 µM estavam mortos. O Western blotting mostrou acúmulo de proteínas poliubiquitinadas de alto peso molecular na presença de 1,6µM, havendo mudanças na atividade quimotripsina-like do proteassoma 20S. Os resultados mostraram que o b-AP15 altera a oviposição, a viabilidade e leva à morte de casais de parasitas, reforçando a hipótese de que o sistema ubiquitina/ proteassoma e que as enzimas deubiquitinadoras ligadas a partícula 19S são essenciais para a biologia de S. mansoni. / The 26S proteasome is a barrel structure with a catalytic core 20S that is flanked by 19S caps on both sides. Our group has been showed that 26S proteasomes are critical for Schistosoma mansoni development and survival, being that more than 95% of worms pairs treated with the proteasome inhibitor MG132 showed alteration on egg laying and viability. The 19S cap is the regulatory complex and functions in unfolding and deubiquitinating the proteins before their entry into the 20S complex using constitutive deubiquitinating enzymes (DUBS). Recently, it has been demonstrated that inhibition of the DUBS, UCHL5 and USP14, which are reversibly bound to the 19S particle of the 26S complex, called b-AP15 , results in cell death because it leads to autophagy, followed by cell death in a variety of mammalian cells. The general objective of this work was to evaluate the effect of the drug on the reproductive development of S. mansoni and as a possible therapeutic target. The specific objectives to determine its effects: in inhibiting the in vitro oviposition of couples of Schistosoma mansoni parasites by counting eggs and p14 gene expression; evaluate whether the reproductive organs of the parasites have undergone some structural modification; if the substance used leads to autophagy; if the treatment of the parasite couples with the drug leads to apoptosis, caused by the activation of caspase-3. This study is the first to document the role of the b-AP15 drug as a schistosomicidal agent, as it triggers ultrastructural changes in couples of S. mansoni worms. The following methods were used to analyze the changes: Transmission Electron Microscopy (MET), Scanning (SEM) and Confocal; Colorimetric assay based on 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), proteasome activity through Suc-Leu-Le-Al-Tyr-AMC substrate specific for chymotrypsin-like activity; western blotting; Polymerase chain reaction in real time and TUNEL. Various concentrations of the drug (0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 to 50 ?M) were tested. 1.6 ?M b-AP15 occurred the inhibition of egg production of couples of parasites treated in vitro for 24 h, with no change in viability, but showed changes from the dosage of 3.2 ?M. Cell and tegumentary changes occurred in 1.6 ?M and adult worms treated with 50 ?M were dead. Western blotting showed accumulation of high molecular weight polyubiquitinated proteins in the presence of 1.6?M, with changes in the chymotrypsin-like activity of the 20S proteasome. The results showed that b-AP15 alters the oviposition, viability and leads to the death of couples of parasites, reinforcing the hypothesis that the ubiquitin / proteasome system and the deubiquitinating enzymes bound to the 19S particle are essential for the biology of S. mansoni.

A atrofia está associada ao aumento da degradação protéica em doenças sistêmicas, sendo o sistema proteolítico ubiquitina proteassoma (SUP) uma das principais vias envolvidas. Contudo, pouco é conhecido sobre a contribuição do SUP à atrofia desencadeada pela insuficiência cardíaca (IC). Sabendo dos benefícios do treinamento físico aeróbico (TFA) e que os mecanismos moleculares envolvidos na atrofia na IC ainda não estão esclarecidos, nessa dissertação investigamos: 1) a contribuição do SUP para a atrofia associada à IC em 2 modelos experimentais: um modelo genético de camundongos com hiperatividade simpática (HS), e um modelo de infarto do miocárdio (IM) em ratos e 2) o efeito do TFA sobre a atrofia associada à IC e sobre o SUP. Na HS verificamos aumento da expressão das E3 ligases, da deubiquitinase USP28, das proteínas ubiquitinadas e da atividade do proteassoma no sítio quimiotripsina, sendo que o TFA reduziu a expressão dos componentes alterados. No IM, observamos disfunção cardíaca não associada à IC, porém, com aumento da expressão de Atrogin-1; enquanto o TFA não produziu efeitos significantes. Dessa forma, os dados sugerem a participação do SUP na atrofia desencadeada pela IC na HS e, que o TFA previne a atrofia por reduzir a expressão/atividade de alguns componentes do SUP; e, que no IM, o aumento da expressão de Atrogin-1 precedeu a perda de massa muscular / Skeletal muscle atrophy is associated with increased protein degradation in systemic diseases, which seems to be mainly related to ubiquitin-proteasome system (UPS). However, little is known about UPS contribution to the heart failure-induced muscle atrophy (HF-MA). Likewise, aerobic exercise training (AET) has been established as an adjuvant therapy for HF and molecular mechanisms underlying HF-MA has not been clarified yet. The objectives of the study were: 1) to verify UPS contribution for HF-MA in 2 experimental models: sympathetic hyperactivity-induced HF (α2A/α2CARKO) in mice, and myocardial infarction model (MI) in rats and 2) AET effects on HF-MA and UPS. In α2A/α2C ARKO mice, we observed activation of UPS characterized by increased mRNA levels of E3 ligases Atrogin-1 and E3-a, deubiquitinating enzyme USP28, increased levels of ubiquitinated proteins and chymotrypsin-like proteasome activity. AET prevented HF-MA in the α2A/α2C ARKO by reducing of UPS activity. In MI model, rats displayed cardiac dysfunction and exercise intolerance with no signs of atrophy. However, Atrogin-1 mRNA and protein levels were increased. Therefore, alterations in Atrogin-1expression might precede atrophy and HF in this model. In conclusion, our data provide evidence for skeletal muscle anti-atrophic effect upon AET in α2A/α2C ARKO that is related, at least in part, to a reduced UPS

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-06-13T19:54:34Z No. of bitstreams: 1 VilsonLacerdaBrasileiroJunior_TESE.pdf: 4045888 bytes, checksum: 528e0e043da00edca077d9ec3116055e (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-19T11:30:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VilsonLacerdaBrasileiroJunior_TESE.pdf: 4045888 bytes, checksum: 528e0e043da00edca077d9ec3116055e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T11:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VilsonLacerdaBrasileiroJunior_TESE.pdf: 4045888 bytes, checksum: 528e0e043da00edca077d9ec3116055e (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / O c?ncer na cavidade oral ? uma das les?es malignas mais frequentes na popula??o mundial. Como o processo de desenvolvimento das neoplasias malignas remete a danos que promovem um desequil?brio na regula??o da divis?o e morte celular, nos ?ltimos anos, diversos estudos foram realizados com o intuito de verificar a influ?ncia desses danos no comportamento global das c?lulas e na evolu??o da doen?a. Nesse contexto, pesquisas recentes mostraram que altera??es na express?o de REGg podem desempenhar um importante papel na progress?o tumoral de v?rias neoplasias malignas, por interferir na regula??o da apoptose. Diante disso, o presente trabalho prop?e investigar a express?o imunoistoqu?mica dos marcadores REGg, p53, MDM-2, Bcl-2 e Bax em carcinomas epiderm?ides de l?ngua (CELs) oral, com a finalidade de promover uma an?lise comparativa da imunoexpress?o destas prote?nas com os par?metros cl?nico-patol?gicos de agressividade da les?o, no intuito de identificar se o REGg contribui para a progress?o do tumor e se interfere na express?o das prote?nas relacionadas a apoptose. Para tanto, foram coletadas informa??es cl?nicas de 58 pacientes acometidos por CELs. Em seguida, foi realizada an?lise histopatol?gica e imunoistoqu?mica dos marcadores supracitados, em amostras de material biol?gico parafinado da les?o. Os resultados mostraram que os tumores sem met?stase nodal e de baixo grau histopatol?gico de malignidade apresentavam percentuais significativamente maiores de REGg (p<0,05). Em adi??o, o confronto dos padr?es de express?o de p53, MDM-2 e Bax com os par?metros cl?nico-patol?gicos avaliados nesse trabalho, n?o revelou diferen?as significativas nos percentuais de imunopositividade desses marcadores. Com rela??o ao Bcl-2, foi visto que tumores de alto grau de malignidade e com ?bitos relacionados a doen?a apresentavam percentual significativamente menor de positividade dessa prote?na (p<0,05). Por fim, o teste de correla??o de Spearman demonstrou existir fraca correla??o positiva, estatisticamente significativa, entre os percentuais de REGg e das prote?nas MDM-2 e Bcl-2. Baseado nesses achados, pode-se concluir que o aumento da express?o de REGg n?o parece contribuir para a progress?o do CEL oral, todavia, pode influenciar na express?o das prote?nas relacionadas a regula??o da apoptose.

A atrofia está associada ao aumento da degradação protéica em doenças sistêmicas, sendo o sistema proteolítico ubiquitina proteassoma (SUP) uma das principais vias envolvidas. Contudo, pouco é conhecido sobre a contribuição do SUP à atrofia desencadeada pela insuficiência cardíaca (IC). Sabendo dos benefícios do treinamento físico aeróbico (TFA) e que os mecanismos moleculares envolvidos na atrofia na IC ainda não estão esclarecidos, nessa dissertação investigamos: 1) a contribuição do SUP para a atrofia associada à IC em 2 modelos experimentais: um modelo genético de camundongos com hiperatividade simpática (HS), e um modelo de infarto do miocárdio (IM) em ratos e 2) o efeito do TFA sobre a atrofia associada à IC e sobre o SUP. Na HS verificamos aumento da expressão das E3 ligases, da deubiquitinase USP28, das proteínas ubiquitinadas e da atividade do proteassoma no sítio quimiotripsina, sendo que o TFA reduziu a expressão dos componentes alterados. No IM, observamos disfunção cardíaca não associada à IC, porém, com aumento da expressão de Atrogin-1; enquanto o TFA não produziu efeitos significantes. Dessa forma, os dados sugerem a participação do SUP na atrofia desencadeada pela IC na HS e, que o TFA previne a atrofia por reduzir a expressão/atividade de alguns componentes do SUP; e, que no IM, o aumento da expressão de Atrogin-1 precedeu a perda de massa muscular / Skeletal muscle atrophy is associated with increased protein degradation in systemic diseases, which seems to be mainly related to ubiquitin-proteasome system (UPS). However, little is known about UPS contribution to the heart failure-induced muscle atrophy (HF-MA). Likewise, aerobic exercise training (AET) has been established as an adjuvant therapy for HF and molecular mechanisms underlying HF-MA has not been clarified yet. The objectives of the study were: 1) to verify UPS contribution for HF-MA in 2 experimental models: sympathetic hyperactivity-induced HF (&#945;2A/&#945;2CARKO) in mice, and myocardial infarction model (MI) in rats and 2) AET effects on HF-MA and UPS. In &#945;2A/&#945;2C ARKO mice, we observed activation of UPS characterized by increased mRNA levels of E3 ligases Atrogin-1 and E3-a, deubiquitinating enzyme USP28, increased levels of ubiquitinated proteins and chymotrypsin-like proteasome activity. AET prevented HF-MA in the &#945;2A/&#945;2C ARKO by reducing of UPS activity. In MI model, rats displayed cardiac dysfunction and exercise intolerance with no signs of atrophy. However, Atrogin-1 mRNA and protein levels were increased. Therefore, alterations in Atrogin-1expression might precede atrophy and HF in this model. In conclusion, our data provide evidence for skeletal muscle anti-atrophic effect upon AET in &#945;2A/&#945;2C ARKO that is related, at least in part, to a reduced UPS

O fator CIITA é a proteína responsável por controlar a transcrição de genes do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II) envolvidos na apresentação antigênica a linfócitos T CD4+. A expressão desta proteína é complexa e célula-específica, dependendo de mecanismos de regulação transcricionais e póstranscricionais. Com o intuito de investigar o potencial do fator CIITA como adjuvante molecular, no presente estudo desenvolvemos e validamos sistemas de transferência gênica capazes de promover a eficiente expressão de CIITA em vários tipos celulares. Além disso, investigamos a regulação pós-traducional deste fator em células não hematopoéticas. Desta forma, foram produzidos um vetor plasmidial e um vetor lentiviral, ambos carreando a sequência do fator CIITA humano desenhada in silico visando a eliminação de elementos cis-reguladores, e otimizada para eficiente expressão em células humanas. A transfecção/transdução de três linhagens de células humanas não hematopoéticas resultou na eficiente expressão de CIITA com localização nuclear apropriada. Células expressando CIITA apresentaram síntese de novo do MHC II, confirmando a funcionalidade da proteína e validando ambos os vetores para a análise futura da atividade adjuvante do CIITA em imunizações gênicas. Ensaios preliminares de inoculação de explantes de pele humana com o vetor lentiviral evidenciaram a eficiente transdução e expressão do CIITA exógeno em células primárias. Em seguida, células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos de indivíduos saudáveis ou infectados com HIV-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral para confirmar a expressão do CIITA em células primárias e avaliar a aplicação desse sistema adjuvante no aprimoramento da vacina de DCs anti-HIV. DCs de indivíduos saudáveis ou infectados foram transduzidas com sucesso pelo lentivírus, o qual induziu uma produção prolongada do mRNA codificando CIITA. Entretanto, os vetores lentivirais induziram um aumento inespecífico da expressão de marcadores fenotípicos das DCs, incluindo as moléculas do MHC II, o que impediu a avaliação indireta da expressão e atividade do fator CIITA através da detecção da expressão aumentada do MHC II. Ensaios futuros irão avaliar se o fator transcricional é expresso pelas DCs transduzidas ou se essas células apresentam um controle mais restrito da expressão do CIITA comparadas às linhagens celulares avaliadas. Interessantemente, ensaios de western blot comparativos entre as três linhagens de células humanas transfectadas/transduzidas, juntamente com ensaios de inibição da degradação protéica pelo inibidor do proteassoma, nos permitiu descrever um novo mecanismo de regulação pós-traducional do CIITA. Aqui, nós identificamos que cada tipo de célula não hematopoética mantém níveis específicos da proteína, e portanto, da sua atividade transcricional, através da regulação da degradação do CIITA pelo proteassoma. Essa regulação é mediada pela modulação dos níveis das proteínas da leucemia promielocítica (PML) acopladas a proteínas SUMO (modificadores pequenos similares à ubiquitina), modificação pós-traducional requerida para a interação PML-CIITA que impede a degradação pelo proteassoma. Esse novo mecanismo aqui descrito contribui para o entendimento ainda incipiente da regulação pós-traducional do fator CIITA em células não hematopoéticas e pode ter implicações importantes na aplicação dessa proteína como adjuvante molecular para imunoterapias / The CIITA factor is a protein responsible for controlling the transcription of major histocompatibility complex class II (MHC II) genes involved on antigen presentation to CD4+ T helper cells. The expression of this transcription factor is complex and differs in various cell types depending on transcriptional and post-transcriptional regulatory mechanisms. In order to investigate the CIITA factor potential as molecular adjuvant, here we developed and validated two gene delivery systems capable of promoting efficient CIITA expression in various human cell types. Additionally, we applied the delivery systems to investigate the post-translational regulation of this factor in nonimmune cells. A DNA plasmid and a lentiviral vector were produced, both carrying the human CIITA DNA sequence in silico designed to avoid cis-regulatory elements, and genetic optimized for expression efficacy in human cells. Transfection or transduction of three different non-immune human cell lines resulted in efficient CIITA expression with proper nuclear localization. The CIITA-expressing cells presented de novo MHC II molecules expression confirming the functionality of the exogenous protein, and validating both delivery systems for the future analysis of the CIITA adjuvant activity in genetic immunizations. Preliminary assays involving the inoculation of the lentiviral vector into human skin explants showed efficient transduction and expression of exogenous CIITA in primary cells. Next, monocyte-derived dendritic cells (DCs) from healthy individuals and HIV-1-infected patients were transduced with the lentiviral vector to confirm the exogenous CIITA expression in primary human cells and also evaluate the applicability of this adjuvant system to improve the DC-based vaccines against HIV. DCs from healthy and infected individuals were successfully transduced by the lentivirus, which induced a sustained CIITA mRNA production. However, the vector particles by themselves induced an unspecific upregulation of DC`s phenotypic surface markers, including the MHC II molecules, impairing our strategy to indirectly evaluate CIITA expression and activity through the detection of MHC II enhanced expression. Further investigations are necessary to confirm whether the transcription factor is efficiently expressed in transduced DCs or if these cells present a more restrict control of CIITA protein expression than the evaluated non-immune cells. Interestingly, western blot assays comparing the three human cell lines, transfected or transduced, along with inhibition of protein degradation by proteasome inhibitor treatments, allowed us to describe a new and intricate mechanism of CIITA post-translational regulation. Here we identified that each non-immune cell type maintain specific protein levels, and hence transcriptional activity, by modulating the rate of CIITA proteasomal degradation. This modulation is achieved by controlling the levels of Promyelocytic Leukemia (PML) proteins attached to Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) proteins, a post-translational modification required for the PML-CIITA interaction, which impairs the proteasomal degradation. This new mechanism described here contributes to the developing understanding of the CIITA post-translational regulation in non-immune cells, and might have important implications in the use of this transcription factor as a molecular adjuvant for immunotherapies

O fator CIITA é a proteína responsável por controlar a transcrição de genes do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II) envolvidos na apresentação antigênica a linfócitos T CD4+. A expressão desta proteína é complexa e célula-específica, dependendo de mecanismos de regulação transcricionais e póstranscricionais. Com o intuito de investigar o potencial do fator CIITA como adjuvante molecular, no presente estudo desenvolvemos e validamos sistemas de transferência gênica capazes de promover a eficiente expressão de CIITA em vários tipos celulares. Além disso, investigamos a regulação pós-traducional deste fator em células não hematopoéticas. Desta forma, foram produzidos um vetor plasmidial e um vetor lentiviral, ambos carreando a sequência do fator CIITA humano desenhada in silico visando a eliminação de elementos cis-reguladores, e otimizada para eficiente expressão em células humanas. A transfecção/transdução de três linhagens de células humanas não hematopoéticas resultou na eficiente expressão de CIITA com localização nuclear apropriada. Células expressando CIITA apresentaram síntese de novo do MHC II, confirmando a funcionalidade da proteína e validando ambos os vetores para a análise futura da atividade adjuvante do CIITA em imunizações gênicas. Ensaios preliminares de inoculação de explantes de pele humana com o vetor lentiviral evidenciaram a eficiente transdução e expressão do CIITA exógeno em células primárias. Em seguida, células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos de indivíduos saudáveis ou infectados com HIV-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral para confirmar a expressão do CIITA em células primárias e avaliar a aplicação desse sistema adjuvante no aprimoramento da vacina de DCs anti-HIV. DCs de indivíduos saudáveis ou infectados foram transduzidas com sucesso pelo lentivírus, o qual induziu uma produção prolongada do mRNA codificando CIITA. Entretanto, os vetores lentivirais induziram um aumento inespecífico da expressão de marcadores fenotípicos das DCs, incluindo as moléculas do MHC II, o que impediu a avaliação indireta da expressão e atividade do fator CIITA através da detecção da expressão aumentada do MHC II. Ensaios futuros irão avaliar se o fator transcricional é expresso pelas DCs transduzidas ou se essas células apresentam um controle mais restrito da expressão do CIITA comparadas às linhagens celulares avaliadas. Interessantemente, ensaios de western blot comparativos entre as três linhagens de células humanas transfectadas/transduzidas, juntamente com ensaios de inibição da degradação protéica pelo inibidor do proteassoma, nos permitiu descrever um novo mecanismo de regulação pós-traducional do CIITA. Aqui, nós identificamos que cada tipo de célula não hematopoética mantém níveis específicos da proteína, e portanto, da sua atividade transcricional, através da regulação da degradação do CIITA pelo proteassoma. Essa regulação é mediada pela modulação dos níveis das proteínas da leucemia promielocítica (PML) acopladas a proteínas SUMO (modificadores pequenos similares à ubiquitina), modificação pós-traducional requerida para a interação PML-CIITA que impede a degradação pelo proteassoma. Esse novo mecanismo aqui descrito contribui para o entendimento ainda incipiente da regulação pós-traducional do fator CIITA em células não hematopoéticas e pode ter implicações importantes na aplicação dessa proteína como adjuvante molecular para imunoterapias / The CIITA factor is a protein responsible for controlling the transcription of major histocompatibility complex class II (MHC II) genes involved on antigen presentation to CD4+ T helper cells. The expression of this transcription factor is complex and differs in various cell types depending on transcriptional and post-transcriptional regulatory mechanisms. In order to investigate the CIITA factor potential as molecular adjuvant, here we developed and validated two gene delivery systems capable of promoting efficient CIITA expression in various human cell types. Additionally, we applied the delivery systems to investigate the post-translational regulation of this factor in nonimmune cells. A DNA plasmid and a lentiviral vector were produced, both carrying the human CIITA DNA sequence in silico designed to avoid cis-regulatory elements, and genetic optimized for expression efficacy in human cells. Transfection or transduction of three different non-immune human cell lines resulted in efficient CIITA expression with proper nuclear localization. The CIITA-expressing cells presented de novo MHC II molecules expression confirming the functionality of the exogenous protein, and validating both delivery systems for the future analysis of the CIITA adjuvant activity in genetic immunizations. Preliminary assays involving the inoculation of the lentiviral vector into human skin explants showed efficient transduction and expression of exogenous CIITA in primary cells. Next, monocyte-derived dendritic cells (DCs) from healthy individuals and HIV-1-infected patients were transduced with the lentiviral vector to confirm the exogenous CIITA expression in primary human cells and also evaluate the applicability of this adjuvant system to improve the DC-based vaccines against HIV. DCs from healthy and infected individuals were successfully transduced by the lentivirus, which induced a sustained CIITA mRNA production. However, the vector particles by themselves induced an unspecific upregulation of DC`s phenotypic surface markers, including the MHC II molecules, impairing our strategy to indirectly evaluate CIITA expression and activity through the detection of MHC II enhanced expression. Further investigations are necessary to confirm whether the transcription factor is efficiently expressed in transduced DCs or if these cells present a more restrict control of CIITA protein expression than the evaluated non-immune cells. Interestingly, western blot assays comparing the three human cell lines, transfected or transduced, along with inhibition of protein degradation by proteasome inhibitor treatments, allowed us to describe a new and intricate mechanism of CIITA post-translational regulation. Here we identified that each non-immune cell type maintain specific protein levels, and hence transcriptional activity, by modulating the rate of CIITA proteasomal degradation. This modulation is achieved by controlling the levels of Promyelocytic Leukemia (PML) proteins attached to Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) proteins, a post-translational modification required for the PML-CIITA interaction, which impairs the proteasomal degradation. This new mechanism described here contributes to the developing understanding of the CIITA post-translational regulation in non-immune cells, and might have important implications in the use of this transcription factor as a molecular adjuvant for immunotherapies