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BAP1 (BRCA-Associated Protein1) is a tumor suppressor gene encoding a deubiquitinating enzyme (DUB) that regulates many facets of cellular biology. Genetic studies have demonstrated that somatic BAP1 mutations occur in numerous cancer types and that germline BAP1 mutations lead to a cancer susceptibility disorder that predisposes individuals to various tumors, in particular malignant mesothelioma (MM) and both uveal melanoma (UM) and cutaneous melanoma (CM). The Testa laboratory has identified several families (including one in Louisiana, designated Lou) with germline BAP1 mutations, in which there were recurrent cases of MM, UM, and CM. We generated a Bap1 mutant mouse model with a knockin mutation identical to that observed in the Lou family (Bap1+/Lou ) to test whether this mutation alone confers susceptibility to ultraviolet (UV) light-induced melanomagenesis either alone or in combination with a mutation found in a well-established Hepatocyte Growth Factor (HGF)/Scatter Factor transgenic mouse model. Neither Bap1+/Lou, HGF, nor Bap1+/Lou;HGF mice showed a significantly higher incidence or shorter latency of UV light-induced melanoma than wild type (WT) mice. The study also suggests that germline mutation of Bap1 alone does not cause an increased incidence of UV-induced melanomas under the conditions used in this investigation. Recent evidence indicates that BAP1 participates in the DNA damage repair response, suggesting that BAP1’s role in tumorigenesis could be particularly important in cancers associated with environmental carcinogens such as ultraviolet irradiation (UVR). To further investigate the role of BAP1 (Bap1 in the mouse) in DNA damage, we first knocked down BAP1 in human melanocytes as well as Melan-A and Melan-C mouse melanocytes and then exposed the cells to UVR, followed by analysis of DNA damage repair. UVR-induced and steady state levels of DNA damage were higher in BAP1-knockdown cells compared to shGFP-control cells. Levels of UVR-related DNA damage markers such as p53, γH2AX and CPD (cyclobutane pyrimidine dimers) were increased following BAP1 loss and UVR treatment. Cell cycle analysis by flow cytometry demonstrated that cells with knockdown of BAP1 and post UVR treatment showed a higher proportion of cells in S/G2 phase. Such an effect could be due to BAP1 loss and consequent inability to repair DNA damage and/or cell cycle progression. These data are consistent with a role for BAP1 in UVR-induced DNA damage repair. In MM, it is unclear to what extent BAP1 mutations cooperate tumorigenically with mutations of other tumor suppressor genes (TSGs) implicated in MM, such as CDKN2A and NF2. While germline mutations of BAP1 clearly predispose to MM, whether somatic mutations of BAP1 drive a more aggressive, metastatic tumor phenotype may depend on the disease type. For such studies, we used conditional knockout (CKO) mice along with intrathoracic (IT) or intraperitoneal (IP) injection of adenovirus expressing Cre recombinase (Adeno-Cre) to excise critical homozygously floxed TSGs in the mesothelial lining. These labor-intensive experiments demonstrated that while homozygous deletion of Bap1, Cdkn2a, or Nf2 alone in the pleural cavity (IT) of genetically engineered mouse (GEM) models gave rise to few or no MMs, inactivation of Bap1 cooperated with loss of either Nf2 or Cdkn2a to drive development of MM in ~20% of double CKO mice, and a high incidence (22/26, 85%) of MMs with short latency (12 weeks) was observed in Bap1;Nf2;Cdkn2a (triple)-CKO mice. The same trend was confirmed when the same gene combinations were homozygously deleted IP in these same GEM models, except that a much higher incidence of MM was observed in homozygously floxed Bap1 (Bap1f/f) mice injected IP versus IT, which may be due to a larger cell surface area of the peritoneum. Adeno-Cre treatment of normal mesothelial cells from Bap1f/f;Nf2 f/f;Cdkn2 f/f mice, but not from mice with knockout of one or any two of these tumor suppressor genes, resulted in robust spheroid formation in vitro, suggesting that homozygous deletion of all three of these TSGs is sufficient to drive a cancer stem cell-like potential. RNA-seq analysis of pleural MMs from triple-CKO mice revealed enrichment of many genes transcriptionally regulated by the polycomb repressive complex 2 (PRC2). Other genes upregulated in MMs from triple-CKO mice included Vegfd and Pak3, which encode proteins involved in angiogenic and cell motility pathways. In conclusion, we hypothesize that inherited mutations of BAP1 may increase susceptibility to certain environmental factors that may induce DNA damage and contribute to cancer development. Our data also indicate that cooperative somatic inactivation of Bap1, Nf2, and Cdkn2a results in rapid, highly aggressive MMs, and that deletion of Bap1 contributes to tumorigenesis, in part, by loss of PRC2-mediated gene repression of tumorigenic target genes and by acquisition of stem-cell potential. Thus, our studies suggest a potential avenue for therapeutic intervention. / Biomedical Sciences

Les schwannomes sont des tumeurs bénignes se développant à partir d’une hyper-prolifération des cellules de Schwann suite à l’inactivation bi-allélique du gène NF2. Signe pathogonomique d’une pathologie rare et héréditaire, la Neurofibromatose de type 2 (NF2), ils peuvent aussi apparaître de façon sporadique. Hormis la chirurgie ou la radiothérapie, peu d’options pharmacologiques sont proposées aux patients porteurs de schwannomes, principalement à cause du peu de cibles thérapeutiques identifiées. Dans les cellules de Schwann, le phénotype cellulaire associé à la perte NF2 est une perte d’inhibition de la prolifération par le contact. Deux fonctions majeures de Merlin, produit de NF2, ont émergé au cours de ces dix dernières années. La première, démontrée par notre groupe, concerne la régulation de l’expression membranaire des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) qui s’accumulent à la membrane plasmique des schwannomes humains. Le second implique Merlin dans la régulation de la voie de signalisation Hippo. Cette dernière, activée par le contact cellulaire réprime l’activité de deux co-facteurs de transcription, Yap et Taz, et régule ainsi et aussi l’inhibition de contact. Les mécanismes moléculaires par lesquels Merlin inhibe l’activité de Yap/Taz sont toutefois méconnus. Le but de nos études a été de déterminer une signature moléculaire associée à la croissance des schwannomes humains et l’importance relative de Yap/Taz. Dans une analyse protéomique à grande échelle sur des biopsies humaines, nous avons identifié à la fois l’activation spécifique de cinq RTKs que sont le PDGFRβ, Her2, Her3, Axl et Tie2 ainsi qu’une accumulation nucléaire spécifique de Yap. Nous montrons que sur la totalité des protéines étudiées, seules Yap, le PDGFRβ et P-Her3 corrèlent avec la prolifération des cellules de schwannomes humain. De plus, Yap induit la transcription des RTK activés (à l’exception de Tie2). Nous plaçons donc Yap au centre des mécanismes de régulation de la croissance des schwannomes humains et proposons que son inhibition pourrait représenter une nouvelle et prometteuse stratégie thérapeutique pour réduire la croissance de ces tumeurs. Nous apportons une nouvelle lecture des fonctions de Merlin, qui, par une potentielle interaction directe avec Yap, inhibe spécifiquement sa translocation dans le noyau indépendamment d’une régulation par la densité cellulaire ou par la voie Hippo. Par ailleurs, Merlin ne semble pas essentiel à l’activation de la voie Hippo dans les cellules de Schwann soulignant une fonction nouvelle et inattendue de Merlin dans la régulation de Yap et de la voie Hippo. Enfin nous avons étudié le rôle d’AmotL1, un puissant partenaire de Merlin et membre de la voie Hippo, dans la migration et la progression des cancers du sein. Nous mettons en évidence une fonction antagoniste de Merlin et AmotL1 dans la promotion de ces mécanismes soulignant une autre fonction nouvelle de Merlin en tant que suppresseur de la progression de cancers non associés à NF2. / Schwannomas are benign tumors arising from Schwann cell hyper-proliferation under NF2 bi-allelic inactivation. They appear in the context of a rare hereditary disease called Neurofibromatosis type 2 (NF2) or in sporadic cases. To this day, surgery and radiotherapy remain the only options to treat these patients, mainly due to the lack of therapeutical targets identified. The NF2 loss associated cellular phenotype is the loss of cell contact inhibition. Two main functions of Merlin, the NF2 product, have emerged in the last decade. The first was shown by our group and consists in the accumulation of tyrosine kinase receptors (RTK) at the plasma membrane in schwannomas. The second involves Merlin in the regulation of the Hippo signaling pathway. This pathway is activated by cell contact and inactivates a couple of transcription co-factors, Yap and Taz, then participating in cell contact inhibition of proliferation. However, the mechanisms by which Merlin inactivates Yap and Taz remain unknown. In our studies, we aimed to determine both the molecular signature of human schwannomas taking advantage of a large proteomic study, and the relative importance of Yap in the tumor suppressor function of Merlin. We could show both a specific activation of five RTKs : PDGFRβ, Her 3, Her2, Axl and Tie2 and a specific nuclear accumulation of Yap in human schwannoma. Among all the protein studied, Yap, PDGFRβ and P-Her3 are the only ones to correlate with the proliferation of human schwannoma cells. Furthermore, the activated RTK (excepted Tie2) are transcriptional targets of Yap. Hence, we found Yap as a pivotal regulator of schwannoma growth and proposed its inhibition as a new and promising therapeutical target to reduce human schwannoma growth. In addition, we show that Merlin specifically inhibits Yap nuclear translocation into the nucleus of Schwann cells by a direct interaction which is independent from the regulation by cell density and by the Hippo pathway. Moreover, Merlin expression seems not to be essential for Hippo activation in Schwann cells which brings a new and unexpected role of Merlin in Yap and Hippo regulation. In the end, we studied the role of AmotL1, a strong Hippo partner of Merlin in the migration and progression of breast cancer. We could show an antagonist function of Merlin and AmotL1 in the promotion of these mechanisms highlighting a new progression suppressor function of Merlin in cancer which are not linked to NF2 mutations.

Spinale Meningeome machen ca. 30% von allen intradural-extramedullären Läsionen aus. Die Literatur, die sich mit spinalen Meningeomen beschäftigt hat, ist rar. Bisher ist nur wenig über das molekulare Profil von spinalen Meningeomen und seine klinischen Auswirkungen bekannt. Fragestellung: 1. Was sind die Prädilektionsstellen für spinale Meningeome und korrelieren diese mit dem postoperativen neurologischen Status? 2. Was sind die Risikofaktoren für die Entstehung eines Tumorrezidivs? 3. Welche Faktoren minimieren die Wahrscheinlichkeit einer vollständigen Resektion der spinalen Meningeome? 4. Lassen sich Meningeome anhand ihres molekularen Profils klassifizieren? Material und Methoden: Diese retrospektive Arbeit befasste sich mit Patienten, welche an einem spinalen Meningeom im Zeitraum von 1993 bis 2020 in der Klinik für Neurochirurgie am Universitätsklinikum „Carl Gustav Carus“ operiert wurden. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die klinischen und genomischen Merkmale der spinalen Meningeome gelegt. Insgesamt wurden 101 Patienten mit 104 spinalen Meningeomen in diese Untersuchung eingeschlossen. Deren Krankenakten systematisch erfasst und statistisch ausgewertet wurden. Klinisch, bildmorphologische sowie histopathologische Daten wurden analysiert. Des Weiteren wurden klinische Parameter mit Sequenzierungsergebnissen in einer gut charakterisierten Kohorte von 47 Patienten korreliert. Ergebnisse: Das mediane Alter aller Patienten in dieser Arbeit betrug 69 Jahre. Die Mehrheit der Tumore in dieser Studie war in der Brustwirbelsäule lokalisiert (56,7%). Die häufigsten neurologischen Symptome waren sensomotorische Defizite und Gangstörungen. Meningeome der BWS gingen am häufigsten mit präoperativen neurologischen Defiziten einher (p=0,005). Lediglich bei einem Patienten (0,9 %) wurde eine permanente, chirurgisch-bedingte, neurologische Verschlechterung beobachtet. Es ließ sich feststellen, dass Foramen magnum-Meningeome im Vergleich mit Meningeomen anderer Lokalisationen am häufigsten mit postoperativen neurologischen Defiziten assoziiert waren (p=0,01). Insgesamt konnte eine Verbesserung des funktionellen Outcomes durch die chirurgische Intervention gezeigt werden (67 von 104, p=0,00001). Damit profitieren die Patienten von einer Operation. Unabhängig vom präoperativen Status ist postoperativ mit einer Verbesserung des Outcomes zu rechnen. Es ließ sich in dieser Arbeit kein Einfluss von Resektionsgrad, histologischen Grad und Subtyp sowie Lokalisation des Tumors auf das Rezidiv nachweisen. Ein Ki-67-Index > 5% hat sich in dieser Untersuchung als einziger Prädiktor für ein Rezidiv spinaler Meningeome bewährt (p=0,0436). Die molekulare Untersuchung von 47 Patienten mit verfügbarem Material zeigt, dass AKT1-Mutationen ein häufiges genomisches Ereignis bei spinalen Meningeomen darstellen. Die Mehrzahl der AKT1-mutierten Meningeome trat bei männlichen Patienten auf (p=0,0175), war in der Halswirbelsäule, ventral des Rückenmarks lokalisiert (p=0,0304 bzw. p=0,0044) und wies eine meningotheliale Histologie auf (p=0,0339). Bezüglich der NF2-mutierten spinalen Meningeome konnte gezeigt werden, dass diese vor allem in der Brustwirbelsäule lokalisiert sind. Sie waren alle AKT1-Wildtyp-Meningeome und traten ausschließlich bei weiblichen Patienten auf. Ein bisher nicht beschriebenes Merkmal ist, dass alle verkalkten Meningeome in unserer Kohorte eine NF2-Mutation aber keine AKT1-Mutation aufwiesen (p=0,0061). Diese Ergebnisse zeigen abermals eine starke Korrelation zwischen den klinischen und genomischen Parametern spinaler Meningeome. Schlussfolgerung: Die Prognose der Patienten mit spinalen Meningeomen nach vollständiger Resektion ist sehr gut. Die Resektion spinaler Meningeome geht mit niedrigen Komplikationsraten sowie einem guten langfristigen funktionellen Ergebnis einher. Diese Studie verbessert unser Verständnis der Pathobiologie spinaler Meningeome und kann das Design klinischer Studien optimieren. Darüber hinaus kann die ungünstige Lokalisation und Konsistenz häufig die vollständige Resektion behindern, was bei einigen Autoren als ein unabhängiger Risikofaktor für ein Tumorrezidiv gilt. Angesichts dieser chirurgischen Herausforderungen könnte die Aufnahme betroffener Patienten in Studien, in denen die Wirksamkeit von AKT-Inhibitoren (z.B. Afuresertib, ClinicalTrials.gov NCT02523014) untersucht wird, sinnvoll sein. Ein solcher Ansatz erfordert das Screening spinaler Meningeomen auf AKT1-Mutationen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Großteil spinaler Meningeome eine AKT1-Mutation und eine weitere, noch größere Gruppe, eine NF2-Mutation aufweisen und daher möglicherweise einer zielgerichteten Therapie zugänglich sind. Weitere Studien sind erforderlich, um den Einfluss relevanter Mutationen auf das Rezidivverhalten zu untersuchen und Meningeompatienten zu identifizieren, die den größtmöglichen Nutzen aus gezielten Therapiestrategien ziehen können.:INHALTSVERZEICHNIS III 1 EINLEITUNG 9 1.1 Definition 9 1.2 Epidemiologie 9 1.3 Lokalisation und Ursprung 9 1.4 Ätiologie 11 1.5 Klinisches Erscheinungsbild 11 1.6 Bildgebung 13 1.7 Klassifizierung und Subtypen 14 1.7.1 WHO-Grad 1 15 1.7.2 WHO-Grad 2 15 1.7.3 WHO-Grad 3 16 1.8 Meningeomwachstum und -rezidiv 16 1.9 Therapie spinaler Meningeome 17 1.9.1 Chirurgische Therapie 17 1.9.2 Radiotherapie 18 1.9.3 Chemotherapie 18 1.10 Verlaufskontrolle 18 1.11 Molekulare Alterationen in Meningeomen 19 1.11.1 NF2-Mutation 20 1.11.2 AKT1E17K-Mutation 20 2 ZIELSETZUNG UND BEDEUTUNG DER STUDIE 22 3 METHODIK 23 3.1 Studientyp 23 3.2 Patientenpopulation und Gewebeproben 23 3.3 Diagnostik und Klassifizierung 23 3.4 Prä- und postoperativer klinischer Zustand 24 3.5 Operation 24 3.6 Nachsorge 25 3.7 Neuropathologische Untersuchung 25 3.8 DNA-Sequenzierung und molekulare Charakterisierung 25 3.9 Statistische Analyse 27 4 ERGEBNISSE 28 4.1 Beschreibung der Patientenkohorte 28 4.2 Demographische Daten 28 4.2.1 Geschlechtsverteilung 28 4.2.2 Patientenzahl / Alter 29 4.2.3 Nebenerkrankungen 30 4.3 Bildgebung 32 4.4 Tumorlokalisation 33 4.4.1 Lokalisation nach Wirbelsäulenabschnitten 33 4.4.2 Lokalisation in Bezug auf das Myelon 34 4.4.3 Lokalisation in Bezug auf die Dura 34 4.5 Beispiele von spinalen Meningeomen 34 4.5.1 Fall 1 35 4.5.2 Fall 2 36 4.5.3 Fall 3 37 4.6 Chirurgische Therapie 37 4.6.1 Zugangsarten 38 4.6.2 Resektionsgrad 39 4.7 Histologie 39 4.8 Perioperative Komplikationen und Mortalität 40 4.9 Prä- und postoperativer neurologischer Zustand 41 4.9.1 Klinischer Zustand in Korrelation mit der Lokalisation des Meningeoms 43 4.10 Follow-up 49 4.10.1 Einfluss der Meningeomlokalisation auf das progressionsfreie Überleben (PFS) 51 4.10.2 Einfluss der Operationsradikalität und der Histologie auf die Rezidivrate 53 4.10.3 Einfluss des Proliferationsindex Ki-67 auf das Rezidiv 56 4.11 AKT1-Mutation 60 4.12 NF2-Mutation 62 5 DISKUSSION 65 5.1 Klinische Analyse 65 5.2 Molekulare Analyse 72 6 ZUSAMMENFASSUNG 76 7 SUMMARY 79 8 LITERATURVERZEICHNIS 81 9 DANKSAGUNG 91 / Spinal meningiomas account for approximately 30% of all intradural extramedullary lesions. The literature dealing with spinal meningiomas is scarce. Little is known about the molecular profile of spinal meningiomas and its clinical implications. This retrospective study describes the clinical and genomic characteristics of patients with spinal meningioma. Particular attention was given to the clinical and genomic characteristics of spinal meningiomas. Question: 1. What are the predilection sites for spinal meningiomas and how do they correlate with the postoperative neurological status? 2. What are the risk factors for tumor recurrence? 3. What factors minimize the likelihood of complete resection of spinal meningiomas? 4. Can NF2 and AKT1 mutant meningiomas be distinguished from each other on the basis of clinical or histological features? Material and Methods: A total of 101 patients with 104 spinal meningiomas, who underwent surgery in the period from 1993 to 2020 in the Department of Neurosurgery at the University Hospital 'Carl Gustav Carus' were included in this study. Their medical records were systematically reviewed and statistically evaluated. Clinical, image morphological and histopathological data were analyzed. Furthermore, clinical parameters were correlated with sequencing results in a well-characterized cohort of 47 patients. Results: The median age of all patients in this work was 69 years. The majority of tumors in this study were located in the thoracic spine (56.7%). The most common preoperative neurological symptoms were sensorimotor deficits and gait disturbances. Meningiomas of the thoracic spine were most frequently associated with preoperative neurological deficits (p=0.005). Consequently, permanent surgery-related neurological deterioration was rarely observed in this series (0.9% of cases), while surgical intervention significantly improved patients’ functional outcome (67 out of 104 patients p=0.00001). Regardless of the preoperative status, an outcome improvement can be expected postoperatively. In this work, neither the degree of resection, nor the histological degree or tumor localization influenced tumor recurrence, while a Ki-67 index of > 5% was the only predictor for recurrence in spinal meningiomas (p=0.0436). Furthermore, we correlated clinical parameters with the molecular status in a subset of 47 patients. Herein we show that AKT1 mutations are a common genomic event in spinal meningiomas (21.2%). The majority of AKT1-mutated meningiomas occurred in male patients (p=0.0175), were located in the cervical spine and anterior to the spinal cord (p=0.0304 and p=0.0044, respectively), and had meningothelial histology (p=0.0339). In contrast, NF2-mutated spinal meningioma were all located in the thoracic spine and occurred only in female patients. Moreover, all calcified meningiomas were NF2-mutant (p=0.0061). Our results show a significant correlation between the AKT1/NF2 mutation status with the histological subtype and the meningioma localization. Conclusion: The prognosis of a spinal meningioma patients treated with complete resection is very good, with low complication rates and a good long-term functional outcome. This study improves our understanding of the pathobiology of spinal meningiomas and may optimize designing clinical trials. In addition, the unfavorable location and consistency can often impede complete resection, which some authors consider to be an independent risk factor for tumor recurrence. Given these surgical challenges, enrolling affected patients in trials evaluating the efficacy of AKT inhibitors (e.g. afuresertib, ClinicalTrials.gov NCT02523014) of clinical interest. Such an approach requires the screening of spinal meningiomas for AKT1 and NF2 mutations. Taken together, we have identified two predominant molecular subgroups in WHO-grade 1 SM, characterized by AKT1 and NF2 mutations. Both mutations are mutually exclusive and are associated with distinct patient characteristics and tumor features. AKT1-mutant meningiomas originate in the cervical spine ventrally to the spinal cord, are almost exclusively associated with meningothelial histology and exhibit no calcifications on imaging. In contrast, NF2-mutant meningiomas show strong female gender predominance, arise with a wider anatomic distribution, although most frequently in the thoracic spine dorsally to the spinal cord, and can be calcified while displaying variable histologic subtypes. Further studies are needed to investigate the impact of relevant mutations on recurrence and to identify patients who can derive maximum benefit from targeted therapy strategies.:INHALTSVERZEICHNIS III 1 EINLEITUNG 9 1.1 Definition 9 1.2 Epidemiologie 9 1.3 Lokalisation und Ursprung 9 1.4 Ätiologie 11 1.5 Klinisches Erscheinungsbild 11 1.6 Bildgebung 13 1.7 Klassifizierung und Subtypen 14 1.7.1 WHO-Grad 1 15 1.7.2 WHO-Grad 2 15 1.7.3 WHO-Grad 3 16 1.8 Meningeomwachstum und -rezidiv 16 1.9 Therapie spinaler Meningeome 17 1.9.1 Chirurgische Therapie 17 1.9.2 Radiotherapie 18 1.9.3 Chemotherapie 18 1.10 Verlaufskontrolle 18 1.11 Molekulare Alterationen in Meningeomen 19 1.11.1 NF2-Mutation 20 1.11.2 AKT1E17K-Mutation 20 2 ZIELSETZUNG UND BEDEUTUNG DER STUDIE 22 3 METHODIK 23 3.1 Studientyp 23 3.2 Patientenpopulation und Gewebeproben 23 3.3 Diagnostik und Klassifizierung 23 3.4 Prä- und postoperativer klinischer Zustand 24 3.5 Operation 24 3.6 Nachsorge 25 3.7 Neuropathologische Untersuchung 25 3.8 DNA-Sequenzierung und molekulare Charakterisierung 25 3.9 Statistische Analyse 27 4 ERGEBNISSE 28 4.1 Beschreibung der Patientenkohorte 28 4.2 Demographische Daten 28 4.2.1 Geschlechtsverteilung 28 4.2.2 Patientenzahl / Alter 29 4.2.3 Nebenerkrankungen 30 4.3 Bildgebung 32 4.4 Tumorlokalisation 33 4.4.1 Lokalisation nach Wirbelsäulenabschnitten 33 4.4.2 Lokalisation in Bezug auf das Myelon 34 4.4.3 Lokalisation in Bezug auf die Dura 34 4.5 Beispiele von spinalen Meningeomen 34 4.5.1 Fall 1 35 4.5.2 Fall 2 36 4.5.3 Fall 3 37 4.6 Chirurgische Therapie 37 4.6.1 Zugangsarten 38 4.6.2 Resektionsgrad 39 4.7 Histologie 39 4.8 Perioperative Komplikationen und Mortalität 40 4.9 Prä- und postoperativer neurologischer Zustand 41 4.9.1 Klinischer Zustand in Korrelation mit der Lokalisation des Meningeoms 43 4.10 Follow-up 49 4.10.1 Einfluss der Meningeomlokalisation auf das progressionsfreie Überleben (PFS) 51 4.10.2 Einfluss der Operationsradikalität und der Histologie auf die Rezidivrate 53 4.10.3 Einfluss des Proliferationsindex Ki-67 auf das Rezidiv 56 4.11 AKT1-Mutation 60 4.12 NF2-Mutation 62 5 DISKUSSION 65 5.1 Klinische Analyse 65 5.2 Molekulare Analyse 72 6 ZUSAMMENFASSUNG 76 7 SUMMARY 79 8 LITERATURVERZEICHNIS 81 9 DANKSAGUNG 91

L’objectif était de mieux définir les relations entre l’exposition à certaines fibres minérales et les anomalies génétiques somatiques associées à la transformation tumorale de cellules de l’appareil respiratoire. Deux études indépendantes ont été conduites à partir du modèle murin Nf2+/- de mésothéliome malin (MM) développé dans le laboratoire, exposé par inoculation intrapéritonéale à des fibres d’amiante crocidolite (souris abs-Nf2+/- et abs-Nf2+/+) et à des fibres céramiques réfractaires (FCR) (souris ceram-Nf2+/-).Ce choix a été fondé selon une stratégie raisonnée à partir de la connaissance des anomalies génétiques observées dans le MM. La validité de ce modèle a été vérifiée en comparant les MM murins et humains. Des MM ont été induits par le crocidolite chez des souris abs-Nf2+/- et abs-Nf2+/+. Les souris abs-Nf2+/- ont significativement développé plus de MM que les souris abs-Nf2+/+. Les caractéristiques histologiques des MM murins sont analogues aux MM humains, avec des altérations génétiques similaires, en terme de fréquence et de mécanismes d’inactivation (mutations ponctuelles pour le gène TP53, délétions pour les gènes NF2 et P16/CDKN2A). Ce modèle murin a été ensuite utilisé pour évaluer la toxicité de FCR. Les souris ceram-Nf2+/- ont développé des MM similaires aux MM humains du point de vue histologique et moléculaire. Ainsi, le profil des altérations génétiques des MM murins ceram-Nf2+/- est semblable à celui des MM murins abs-Nf2+/- et abs-Nf2+/+, et humains. Les cellules mésotheliales des souris exposées aux FCR et à l’amiante semblent suivre les mêmes voies de transformation néoplasique. Une étude à la recherche d’altérations génétiques de ces 3 gènes et des gènes Ki-ras et EGFr fréquemment mutés dans le cancer broncho-pulmonaire (CBP) a été conduite à partir de cas de CBP sélectionnés (50 sujets exposés à l’amiante (E+) et 50 sujets non exposés (E-) appariés sur l’âge, le sexe, le type histologique et le tabagisme) provenant d’une série de cas opérés. A l’instar du MM, l’analyse du gène P16/CDKN2A suggère que le mécanisme d’inactivation pourrait être différent chez les sujets E+ (par délétion) par rapport aux sujets E- (par hyperméthylation du promoteur), indépendamment de l’âge et du tabagisme. Deux SNP (rs12947788 et rs12951053) du gène TP53 sont plus fréquemment retrouvés chez les sujets E+. En revanche, aucune différence significative n’est retrouvée pour les autres gènes entre ces 2 groupes. Ainsi, les mutations du gène NF2 dans le MM seraient plus liées à une spécificité cellulaire et à une fonction particulière de la protéine nf2 dans ces cellules / Résumé en anglais non communiqué

Merlin is a tumour suppressor protein that is frequently mutated or downregulated in cancer. Biallelic Merlin inactivation is causative of tumour formation, including schwannoma, meningioma and ependymoma. These tumours can occur sporadically or as part of the genetic condition Neurofibromatosis type 2 (NF2) and cause significant morbidity. The current treatment options are restricted to surgery and radiotherapy, which are invasive and may cause further tumour development. The activity of both the E3 ubiquitin ligase complex Cullin 4 really interesting new gene (RING) E3 ubiquitin ligase- DNA damage binding protein (DDB1) and Cullin 4 associated factor 1 (CRL4-DCAF1) and Kinase suppressor of RAS 1 (KSR1) have been shown to be upregulated in schwannoma to drive tumour growth. KSR1 has also been shown to interact with components of the CRL4-DCAF1 complex. We investigated the expression, interaction and therapeutic potential of targeting these proteins in Merlin deficient schwannoma and meningioma using a primary human cell model and relevant cell lines. We found that DCAF1 and KSR1 protein were overexpressed in schwannoma and meningioma and confirmed that targeting both DCAF1 and KSR1 in meningioma had additive effects on proliferation. We also identified that CRL4-DCAF1 facilitates KSR1 dependent RAF/Mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ Extracellular signal regulated kinase (ERK) kinase (MEK)/ERK pathway activity. We showed MLN3651, a neddylation inhibitor that targets ubiquitin ligase activity, reduced proliferation and activated apoptosis in Merlin-deficient tumours. We also showed that Merlin-positive tumours were less sensitive to MLN3651 than Merlin-deficient tumours; therefore, MLN3651 sensitivity may be CRL4-DCAF1-dependent. Finally, combination of MLN3651 and the MEK1/2 inhibitor AZD6244 had additive effects, particularly in meningioma. Combinatorial therapy activated the Hippo pathway, inhibited RAF/MEK/ERK pathway activity and proliferation demonstrating that targeting the activity and downstream pathways of both DCAF1 and KSR1 represents an attractive novel therapeutic strategy in Merlin-deficient tumours.

<p>Monogenic disorders offer a possibility for studies of genetic disturbances in hearing impairment—a knowledge which could be essential for development of future treatment options. In this thesis, the underlying genetic disturbances in neurofibromatosis 2 (NF2) and familial Meniere’s disease (FMD) were evaluated, and familial X-linked hearing impairment was described from a clinical point of view. </p><p>In paper I, constitutional DNA from 116 individuals with NF2 of variable severity was studied using the array-CGH method focusing on a 7.6-Mb area surrounding the NF2 gene on chromosome 22q. Deletions were found in 20.7% of samples. In mild NF2, the deletions were small, but variable sizes of deletions were found in cases that were moderately or severely affected. Disease phenotype could not be predicted from the size of the deletions.</p><p>In papers II and III, a single five-generation family with autosomal dominant FMD was described. Anticipation concerning age of onset was observed. Genome scan revealed five candidate gene regions with a LOD score of > 1. Two additional families with autosomal dominant MD were analyzed for linkage to these five regions. A cumulative Zmax of 3.46 was obtained for a single 463-kb region on chromosome 12p12.3, containing only one known gene: PIK3C2G. This encodes a protein with a proposed role in hair cell regeneration in mammalian ears. No mutations were found in protein-coding sequences or exon-intron borders. In two of the three families, a shared haplotype, suggested common ancestry, was found to extend over 1.7 Mb, which could be a genomic region of importance for FMD.</p><p>In paper IV, a family in which five males displayed progressive low- and mid-frequency hearing impairment from the first or second decade was described. Female carriers were affected by a high-frequency hearing impairment from the fourth decade. The family could represent a novel X-linked dominant audiophenotype.</p>