L’hémochromatose est une maladie héréditaire caractérisée par une surcharge de fer dans l’organisme. Chez une personne saine, l’excès de fer est excrété au niveau des intestins, mais une personne souffrant d’hémochromatose accumule le fer au niveau de la circulation, du foie, du cœur, et également au niveau des autres organes. Ceci donne lieu à différents problèmes comme des maladies cardiaques et du foie, du diabète, de la fatigue chronique et également des douleurs articulaires. Deux traitements sont disponibles pour traiter l’hémochromatose. Le premier consiste à des saignées (phlébotomies) pouvant durer plusieurs mois (ou années) à des fréquences hebdomadaires. Il est également possible d’utiliser un agent chélatant du fer pour faciliter son élimination à l’extérieur de l’organisme. L’agent chélatant le plus utilisé est la déferoxamine (également connu sous le nom de desferrioxamine B) qui s’administre par injection sous-cutanée pendant plusieurs heures à une fréquence journalière. Ces deux traitements sont longs et très invasifs. C’est pourquoi notre groupe de recherche s’intéresse à la matriptase-2, une protéase à sérine transmembranaire de type II (TTSP), dont le rôle dans l’homéostasie du fer a préalablement été démontré. Dans une précédente étude, nous nous sommes intéressés à une autre TTSP, la matriptase. La matriptase est l’une des plus étudiées, notamment à cause de ses rôles dans le cancer,[indice supérieur 1–3] l’influenza[indice supérieur 4] et l’arthrose.[indice supérieur 5] Comme toutes les TTSP, la matriptase est synthétisée sous forme inactive (zymogène). Elle nécessite un premier clivage après l’acide aminé Gly[indice supérieur 149] et un second clivage autoprotéolytique après Arg[indice supérieur 614] pour libérer son domaine catalytique actif. Sa séquence d’autoactivation RQAR-VVGG a été le point de départ pour la synthèse du premier inhibiteur de la matriptase dans le laboratoire, soit RQAR. À ce peptide, un piège à sérine a été ajouté sous forme de cétobenzothiazole (Kbt).[indice supérieur 6] En 2014, après une étude de modélisation et plusieurs modifications en P4-P1, un inhibiteur sélectif et puissant sur la matriptase-2 a été obtenu, soit YYVR-Kbt.[indice supérieur 7] Le but de ma maîtrise était de remplacer les différents acides aminés aux positions P4, P3 et P2 sur YYVR-Kbt pour obtenir un inhibiteur encore plus puissant et plus sélectif pour la matriptase-2. Une librairie de 29 analogues a été produite dans le but de comprendre la relation structure-activité de cette classe d’inhibiteurs semi-peptidiques sur la matriptase-2. Pour ce faire, des acides aminés naturels et non-naturels ayant différentes fonctions (polaires, apolaires, aromatiques, etc.) ont été utilisés. Les composés ont été caractérisés selon leur constante d’inhibition (Ki) sur matriptase-2 et également sur matriptase. Les inhibiteurs les plus puissants ont été testés sur l’hepsine, une autre TTSP exprimée dans le foie, dans le but de comprendre la sélectivité pour matriptase-2. La sélectivité pour la matriptase-2 (vis-à-vis d’autres TTSP) est importante pour éviter de potentiels effets secondaires. Une recherche conformationnelle sur les composés synthétisés a été réalisée dans le but de comprendre les interactions importantes entre l’inhibiteur et les protéases. Les constantes cinétiques d’association/dissociation, le temps de résidence des trois meilleurs inhibiteurs ont été déterminés. La stabilité des meilleurs inhibiteurs dans du plasma de souris a été également testée. Cette étude a permis la rédaction d’un article scientifique intitulé « Modulating the Selectivity of Matriptase-2 Inhibitors with Unatural Amino Acids », soumis à l’European Journal of Medicinal Chemistry le 2 décembre 2016, qui est inclus dans ce mémoire.

Résumé: Chaque année, les épidémies saisonnières d’influenza causent de 3 à 5 millions de cas sévères de maladie, entraînant entre 250 000 et 500 000 décès mondialement. Seulement deux classes d’antiviraux sont actuellement commercialisées pour traiter cette infection respiratoire : les inhibiteurs de la neuraminidase, tels que l’oseltamivir (Tamiflu) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (adamantanes). Toutefois, leur utilisation est limitée par l’apparition rapide de résistance virale. Il est donc d’un grand intérêt de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’influenza. Le virus influenza dépend de l’activation de sa protéine de surface hémagglutinine (HA) pour être infectieux. L’activation a lieu par clivage protéolytique au sein d’une séquence d’acides aminés conservée. Ce clivage doit être effectué par une enzyme de l’hôte, étant donné que le génome du virus ne code pour aucune protéase. Pour les virus infectant l’humain, plusieurs études ont montré le potentiel de protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) à promouvoir la réplication virale : TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 et matriptase, identifiée récemment par notre équipe (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activent l’HA des virus influenza A (principalement H1N1 et H3N2). Toutefois, il existe peu d’information sur le clivage de l’HA des virus influenza B, et seulement TMPRSS2 et HAT ont été identifiées comme étant capables d’activer ce type de virus. Les travaux de ce projet de maîtrise visaient à identifier d’autres TTSP pouvant activer l’HA de l’influenza B. L’efficacité de clivage par la matriptase, hepsine, HAT et Desc1 a été étudiée et comparée entre ces TTSP. Ces quatre protéases s’avèrent capables de cliver l’HA de l’influenza B in vitro. Cependant, seul le clivage par matriptase, hepsine et HAT promeut la réplication virale. De plus, ces TTSP peuvent aussi supporter la réplication de virus influenza A. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de TTSP, développé en collaboration avec notre laboratoire, permet de bloquer significativement la réplication virale dans les cellules épithéliales bronchiques humaines Calu-3. Cet inhibiteur se lie de façon covalente et lentement réversible au site actif de la TTSP par un mécanisme slow tight-binding. Puisque cet inhibiteur cible une composante de la cellule hôte, et non une protéine virale, il n’entraîne pas le développement de résistance après 15 passages des virus en présence de l’inhibiteur dans les cellules Calu-3. L’inhibition des TTSP activatrices d’HA dans le système respiratoire humain représente donc une nouvelle stratégie thérapeutique pouvant mener au développement d’antiviraux efficaces contre l’influenza. / Abstract: Seasonal influenza epidemics cause between 3 and 5 millions severe cases of disease, leading to 250 000 to 500 000 deaths worldwide. Only two classes of drugs are currently available to treat influenza infections: neuraminidase inhibitors, such as oseltamivir (Tamiflu) and M2 channel inhibitors (adamantanes). However, the use of these antivirals is restricted by rapid emergence of viral resistance. It is therefore of great interest to develop new therapeutic strategies for the treatment of influenza disease. The influenza virus requires activation of its surface protein hemagglutinin (HA) to become infectious. This activation is achieved by proteolytic cleavage in a highly conserved amino acid sequence of the protein. Host cell proteases are responsible for this cleavage since the viral genome doesn’t encode any protease. For viruses that infect humans, many studies have shown the potential of type II transmembrane serine proteases (TTSP) to promote viral replication: TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 and matriptase, recently identified by our team (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activate HA of influenza A viruses (mainly H1N1 and H3N2). However, little is known about cleavage of influenza B virus HA, and only TMPRSS2 and HAT have been identified as being capable of activating this type of virus. This project aimed to identify other TTSPs able to activate influenza B HA. Cleavage efficacies of matriptase, hepsin, HAT and Desc1 were studied and compared. These four proteases were shown to be able to cleave influenza B HA using in vitro assays. However, only cleavage by matriptase, hepsin and HAT promoted viral replication. Moreover, these TTSPs also supported the replication of influenza A viruses. Thus, the use of a slow, tight-binding inhibitor (developed in collaboration with our laboratory) that binds to the TTSP active site, forming a covalent and reversible bond, significantly blocked viral replication in human bronchial epithelial Calu-3 cells. Since this inhibitor targets a host cell component, instead of a viral protein, viruses did not develop resistance after 15 passages in presence of the inhibitor in Calu-3 cells. Thus, inhibition of HA-activating TTSPs in the human respiratory tract represents a novel therapeutic strategy against influenza.