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Biologie cellulaire et moléculaire / Cell and molecular biology

L’assemblage et la propagation du Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) met en jeu des évènements moléculaires et cellulaires impliquant des interactions entre protéines virales et co-facteurs cellulaires, tels que les régulateurs du trafic vésiculaire des protéines. Le virus doit notamment échapper aux mécanismes de défense de l’hôte afin de se disséminer dans l’organisme. La protéine BST2 « Bone marrow STromal antigen 2 » (Tetherin/CD317/HM1.24) appartient à une famille de médiateurs de l’immunité intrinsèque de l’hôte : les facteurs de restriction. BST2 inhibe la libération des particules virales néo-formées en les séquestrant à la surface des cellules infectées. La protéine virale Vpu permet de lever cette restriction en excluant BST2 des zones de bourgeonnement viral. Les mécanismes exacts par lesquels Vpu contrecarre l’activité anti-virale de BST2 au site de bourgeonnement ne sont pas complètement élucidés, mais résultent d’une altération du trafic intra-cellulaire du facteur de restriction. Une caractérisation précise des fonctions cellulaires de BST2, encore mal définies, et des mécanismes moléculaires et cellulaires régulant cette protéine et son activité permettrait de mieux appréhender son rôle au cours de l’infection, ainsi que les mécanismes développés par Vpu pour contrecarrer son activité anti-virale. Dans cette optique, nous avons entrepris un crible protéomique dans le but d’identifier des co-facteurs cellulaires de BST2. Compte tenu de l’importance des machineries de régulation du trafic intra-cellulaire dans la biogenèse virale et les contre-mesures par lesquelles Vpu contrecarre BST2, nous nous sommes essentiellement focalisés sur deux protéines de la famille EHD (Eps15 Homology Domain) : EHD4 et EHD1, deux GTPases impliquées dans la régulation du trafic vésiculaire des protéines au niveau des endosomes précoces et de recyclage respectivement. EHD4 en particulier a précédemment été décrite comme étant un régulateur de la biogenèse de virions VIH-1 infectieux selon des modalités qui restent à définir. Les objectifs de mon projet de thèse ont été (i) d’analyser / valider le rôle d’EHD4 dans la régulation du trafic intra-cellulaire de BST2 en conditions non-infectieuses, (ii) d’évaluer le rôle d’EHD4 dans l’activité anti-virale de BST2 et son antagonisme par la protéine virale Vpu, et finalement (iii) de documenter la contribution des protéines EHD4 et EHD1 dans le de cycle de réplication du VIH-1. Nous avons pu montrer qu’EHD4 interagit avec BST2 et régule son trafic intra-cellulaire au niveau des endosomes précoces. La déplétion d’EHD4 induit une altération majeure du trafic de BST2, caractérisée par une rétention de BST2 au niveau des endosomes précoces, associée à un ralentissement de son adressage vers les compartiments de dégradation lysosomale. Dans un contexte infectieux, EHD4 ne semble pas requise pour la dégradation de BST2 induite par Vpu, ni pour l’antagonisme de son activité anti-virale par la protéine virale. Cependant, nous avons révélé une implication majeure d’EHD4 et d’EHD1 dans le cycle de réplication du VIH-1 : en effet, leur déplétion respective aboutit à un ralentissement drastique de la propagation virale. EHD4 et EHD1 favorisent le déroulement d’une étape précoce de l’infection antérieure à la rétro-transcription du génome virale dans la cellule nouvellement infectée. De plus, EHD4 et EHD1 contribuent à la biogenèse de virus infectieux : leur déplétion respective perturbe le trafic intra-cellulaire des constituants viraux, l’intégrité des zones de bourgeonnement viral et l’incorporation de la glycoprotéine d’enveloppe dans les virions nouvellement produits. Ces altérations se traduisent par une diminution de l’infectivité des virions produits en l’absence des protéines EHD4 et EHD1. / Assembly and egress of Human Immunodeficiency Virus (HIV) involve a highly orchestrated series of interactions between proteins encoded by the virus and cellular cofactors, such as regulators of intra-cellular vesicular trafficking. One key challenge for the virus is to overcome several levels of host defence mechanisms to propagate. The cellular protein BST2 (Bone marrow STromal cell antigen-2), also called Tetherin, was recently identified as a cellular restriction factor that retains viral particles at the surface of infected cells, thereby considerably reducing viral release. The accessory protein Vpu encoded by the HIV-1 counteracts this restriction by reducing BST2 expression at the viral budding sites. This process comes along with a diminished global expression of BST2 in the cells. The mechanisms underlying Vpu-mediated BST2 down-regulation at the viral budding sites are not fully understood. Studies performed in the laboratory, along with others published by international research groups, showed that this activity relies on interference with BST2’s intra-cellular trafficking. A deeper caraterization of BST2’s cellular functions and modes of regulation would allow for a better understanding of its role against HIV-1 infection and the viral countermeasures antagonizing its antiviral activity. To this aim, we performed a protemic screening in order to identify new BST2 cofactors. As HIV-1 hijacks the cellular machineries involved in the regulation of vesicular intra-cellular traffcking to promote virion biogenesis and BST2 antagonism, we focused our investigations on two hits belonging to the EHD family (Eps15 Homology Domain) : EHD4 and EHD1. Both proteins are GTPases that regulate the intra-cellular vesicular trafficking, respectively at early and recycling endosomes. EHD4 has previously been involved in the regulation of the biogenesis of infectious HIV-1 viral particles, the underlying mecanisms remaining unclear to date. The goals of the research project constituting my Ph.D were to (i) analyze / validate the implication of EHD4 in the regulation of BST2’s intra-cellular trafficking in a non-infectious context, (ii) decipher the role of EHD4 in the regulation of BST2’s antiviral activity and its Vpu-mediated antagonism, and (iii) assess the invovlment of EHD4 and EHD1 in the replication cycle of HIV-1. We showed here that EHD4 interacts with BST2 and regulates its intra-cellular trafficking at early endosomes in a non-infectious context. EHD4 depletion induces a major alteration of BST2 trafficking, as internalized BST2 seem to be retained at an early endosomal level and unefficiently targeted towards the lysosomal degradation pathway. In the context of HIV-1 infection, EHD4 does not seem to be required in the Vpu-mediated BST2 degradation, nor in the antagonism of BST2’s antiviral activity. Nevertheless, we unveiled a major involvment of both EHD4 and EHD1 in the HIV-1 replication cycle : their respective depletion leads to a severe impairment of viral propagation. EHD4 and EHD1 seem to facilitate an early step of the viral cycle prior to reverse transcription. Moreover, EHD4 and EHD1 participate in the biogenesis of infectious virions : their respective depletion alters the intra-cellular trafficking of viral components, the viral budding sites organization and the incorporation of the viral envelope glycoprotein into nascent particles. Thoses phenotypes combined result in a drastic decrease of the infectivity of virions produced in the absence of either EHD4 or EHD1.

Ο καρκίνος αποτελεί μια από τις μεγαλύτερες μάστιγες της σύγχρονης ζωής. Η ιστολογική εξέταση των νεοπλασμάτων (τόσο στις πρωτοπαθείς εστίες όσο και στις δευτεροπαθείς εναποθέσεις) αποκαλύπτει ότι οι όγκοι αποτελούν ένα ετερογενές σύνολο άμορφων και έμμορφων στοιχείων. Η νεοπλασματική μάζα εκτός από τα καρκινικά κύτταρα, περιλαμβάνει ποικίλα κύτταρα (ινοβλάστες, κύτταρα αγγείων, μακροφάγα, φλεγμονώδη κύτταρα, λιποκύτταρα) και στοιχεία της εξωκυτταρίου ουσίας (κολλαγόνο, ελαστικές ίνες, πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας) τα οποία στη μεγάλη πλειοψηφία τους προσελκύονται, άμεσα ή έμμεσα, από τα κακοήθη κύτταρα. Τα κύτταρα του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος δεν αποτελούν αδρανείς παρατηρητές της καρκινικής διεργασίας αλλά συμμετέχουν ενεργά σε αυτή καθώς αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό, καταστέλλουν την απόπτωση, ευνοούν την επιβίωση, διευκολύνουν τη μετανάστευση και εξασφαλίζουν την επαρκή θρέψη και οξυγόνωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Η μελέτη των ποικίλων αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται στο καρκινικό μικροπεριβάλλον ανάμεσα στα καρκινικά κύτταρα και τα στοιχεία του ξενιστή αποκαλύπτει καινούργιους θεραπευτικούς στόχους στην αντικαρκινική θεραπεία και βοηθάει στην κατανόηση του μηχανισμού των μεταστάσεων, δημιουργώντας την ελπίδα της αποτελεσματικότερης αντιμετώπισης του καρκίνου. Στην παρούσα εργασία γίνεται μια συνολική αναφορά της συμμετοχής όλων των στοιχείων του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος στη νεοπλασματική εξεργασία. Επίσης καταβάλλεται προσπάθεια να τονιστούν οι σύνθετες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα καρκινικά κύτταρα και το μικροπεριβάλλον. / Cancer is a devastating disease. Histologic examination of neoplasms (in the primary sites and their metastases as well) reveals that tumors are composed of a heterogeneous population of cells (fibroblast, vascular cells, macrophages, inflammatory cells, lipocytes) and extracellular matrix proteins (ECM) (collagen, elastin fibers, other ECM proteins). Recruitment of non-neoplastic tissue (stromal cells and ECM) to the tumor microenvironment is mostly mediated, directly or indirectly, by the malignant cells. Stromal cells are not quiescent bystanders of the neoplastic process. Instead they have an active role since they promote the proliferation, growth and migration of the tumor cells, inhibit their apoptosis and support tumor supply of oxygen and nourishment. In addition, stromal cells and ECM network protect cancer cells from the host defense. Research on the evolving crosstalk between the different cell types and ECM molecules within the tumor mass can disclose new therapeutic targets and help elucidate the pathogenetic mechanisms underlying metastasis, thus leading to a more effective anticancer therapy. This study discusses the potential role of the different stromal compartments in cancer initiation and progression and emphasizes the complex crosstalk between cancer cells and their microenvironment.

Dans l’organisme, le fer assure le transport d’oxygène jusqu’à tous les organes, via l’hémoglobine des globules rouges. L’hepcidine, une hormone hépatique hyposidérémiante, contrôle le taux de fer sérique mis à disposition pour la synthèse de nouveaux globules rouges. La régulation de l’hepcidine implique un grand nombre de protéines, dont l’expression et l’activité répondent à la charge en fer de l’organisme. Récemment, la sérine protéase membranaire Matriptase-2 (MT2), synthétisée par le foie, a été identifiée comme actrice clé dans l’inhibition de la synthèse d’hepcidine. En effet, des mutations du gène Tmprss6 causent la synthèse de MT2 inactives, chez l’Homme et la souris, menant à une hyperhepcidinémie ; cet excès d’hormone génère une anémie de cause génétique, résistante à l’apport en fer (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Suite à des expériences in vitro, il a été proposé que MT2 inhibe l’expression de l’hepcidine en dégradant l’hémojuvéline (HJV), une protéine appartenant à la voie principale activant la synthèse de l’hormone ; le clivage d’HJV par MT2 bloquerait ainsi le signal passant par cette voie. Toutefois, des études in vivo ont montré que la protéine HJV exprimée par le foie diminue en absence de MT2. Le rôle de la protéase dans l’inhibition de l’hepcidine ne semble donc pas se limiter à l’interaction et au clivage de HJV par MT2. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de MT2 pour réguler l’homéostasie du fer, nous avons donc étudié son rôle in vivo, en absence de Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), l’activateur principal de la voie de régulation de l’hepcidine (double knock-out Bmp6 Tmprss6), et durant le développement embryonnaire et post-natal. L’analyse de ces modèles murins nous a ensuite incités à observer la conséquence d’une surexpression de MT2 in vivo et in vitro : l’excès d’activité catalytique dans ces conditions montre l’importance cruciale de réguler finement l’expression et l’activité des protéases. La synthèse de MT2 s’effectuant presque exclusivement au niveau des hépatocytes, nous avons finalement cherché à identifier les partenaires et cibles potentielles de MT2 dans ces cellules exclusivement, en isolant des hépatocytes primaires de souris WT pour les comparer à ceux de souris Tmprss6-/-, par transfection, mais également en utilisant différentes techniques de protéomique. Ces études ont permis de préciser l’importance de MT2 dans la régulation de l’hepcidine, mais aussi à quel point il est nécessaire de contrôler l’expression et l’activité catalytique de cette protéase, et donc que ses partenaires sont indispensables à sa fonction. / In the organism, iron takes care of oxygen transport until every organ, via haemoglobin of red blood cells. Hepcidin, a hepatic hyposideremic hormone, controls plasmatic iron levels at diposal for new erythroblasts synthesis. Hepcidin regulation implies a huge amount of proteins, whose activity and expression answer to iron body. Recently, membrane serine protease Matriptase-2 (MT2), synthetised by liver, has been identified as a key factor in hepcidin synthesis inhibition. Indeed, mutations of the Tmprss6 gene lead to synthesis of inactive MT2, in human and mouse, and result in hyperhepcidinemia: this excess of hormone generates an anemia of genetic cause, that resists to iron oral therapy (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Following in vitro experiments, it was suggested that MT2 inhibits hepcidin expression by degrading hemojuvelin (HJV), a protein part of the main signaling pathway positively regulating hepcidin synthesis; HJV cleavage by MT2 would then stop the signal. However, in vivo studies have shown that HJV expressed by the liver decreases in case of MT2 loss. The protease role in hepcidin inhibition seems to not be limited to HJV-MT2 interaction and cleavage. In order to better understand MT2 function in iron metabolism, we studied its role in vivo, when Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), the main activator of hepcidin regulatory pathway, is missing (double knock-out Bmp6 Tmprss6 mice), and during embryonic and postnatal development. Analysis of these mice models incited us to study the consequences of MT2 overexpression, in vivo and in vitro: excess of catalytic activity in these conditions show how crucial it is to tightly regulate proteases expression and activity. MT2 expression is almost exclusively restricted to hepatocytes; we then decided to identify its potential partners and targets in these cells, by isolating primary hepatocytes from WT mice, to compare them to Tmprss6-/- ones. These cells were transfected, and analysed by proteomic. These studies allowed us to precise MT2 importance in hepcidin regulation, but also how crucial it is to regulate expression and catalytic activity of this protease, and how its partners are essential for its role.

Les capacités de cicatrisation de la gencive en font un modèle de régénération tissulaire naturelle. Ces capacités sont liées en grande partie à l’activité des fibroblastes. Composante cellulaire principale du tissu conjonctif gingival, ils sont au cœur de la régulation des réponses inflammatoires et des processus de cicatrisation. Nous avons supposé que ce tissu pouvait contenir des cellules souches, pouvant expliquer en partie, ces capacités de réparation. Au cours de cette thèse, nous avons pu mettre en évidence la présence de cellules souches mésenchymateuses aux propriétés communes avec les cellules souches adultes dérivées des crêtes neurales. Ces cellules expriment des marqueurs spécifiques des cellules souches et des crêtes neurales. Par ailleurs, elles présentent des capacités d’auto-renouvellement et de multipotence. Elles sont, en effet, capables de se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la différenciation chondro/endochondrale. La culture des cellules, sous forme de sphères en suspension, a permis de mettre en évidence leurs capacités de différenciation en tissus cartilagineux et articulaires. Elles s’organisent spontanément en plusieurs types cellulaires différents, générant notamment des chondrocytes hypertrophiques et des synoviocytes selon leur localisation au sein des sphères et du milieu de culture utilisé. Le comportement de ces cellules soumises à ces conditions a permis de montrer leurs facultés à reproduire, in vitro, des processus proches de ceux retrouvés au cours du développement. Ces résultats permettent une meilleure compréhension des phénomènes de différenciation des cellules souches adultes, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour des applications en thérapie cellulaire articulaire et osseuse. / The healing capacity of the gingiva makes it a model of natural tissue regeneration. These capabilities are largely related to the fibroblast activity. They are the main cellular component of the gingival connective tissue and they regulate inflammatory responses and healing process. We hypothesized that this tissue could contain stem cells, which could explain, in part, these repair capabilities. In this thesis, we were able to demonstrate the presence of mesenchymal stem cells with properties shared with the neural crest-derived adult stem cells. These cells express specific markers of stem cells and neural crest. Moreover, they do have the capacity to self-renew and multipotency. They are, indeed, able to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteocytes. We have particularly focused on the chondro / endochondral differentiation. When cultivated as micromasses cultures in suspension, cells were able to differentiate into cartilage and joint tissues. They organize themselves spontaneously into several different cell types, including hypertrophic chondrocytes and synoviocytes depending on their location within the micromasses and the culture medium used. The behavior of these cells under these conditions has shown their ability to replicate in vitro, close to those found during the development process. These results allow a better understanding of adult stem cells differentiation, opening new perspectives for applications in joint and bone cell therapy.

PiT1/SLC20A1 a été identifiée pour la première fois comme récepteur rétroviral, puis de nombreuses autres études réalisées in vitro ont permis de révéler ces différentes fonctions. PiT1 est notamment un transporteur de phosphate-sodium dépendant. Par le biais de cette activité de transporteur de phosphate inorganique (Pi), PiT1 est impliqué dans plusieurs processus cellulaires comme la minéralisation osseuse, la calcification vasculaire (dans certaines pathologies), et la réabsorption rénale et intestinale de Pi. Dans notre laboratoire, afin de mieux caractériser les fonctions physiologiques de PiT1, un Knock Out (KO) total pour cette protéine a été généré. Les souris présentent un phénotype létal embryonnaire et une atteinte hépatique. Au vu de ces résultats, d’autres études, réalisées dans le laboratoire, ont mis en évidence l’implication de PiT1 dans la prolifération et l’apoptose cellulaire. Ces fonctions nouvellement décrites sont spécifiques à PiT1 et indépendantes de sa fonction de transporteur de Pi.Les objectifs majeurs de mon travail de thèse ont consisté à mieux comprendre le rôle de PiT1 dans les mécanismes apoptotiques déclenchés par le TNF-α. Pour cela, j’ai étudié la cascade d’activation du TNF-α dans les cellules Hela exprimant de manière stable un shPiT1 ou un shScramble. En effet, mes résultats suggèrent que l’association de TRAF2 ; un élément clé de l’activation de la voie des MAPKs ; à PiT1 par le bisais de sa large boucle intracellulaire, permettrait la dissociation des kinases en amont de la voie des MAPKs, GCK (MAP4K) et MLK3 (MAP3K), induisant leur désactivation et ainsi la régulation négative de JNK. La désactivation de JNK induit à son tour à l’inhibition des caspases et donc la signalisation apoptotique. Par ailleurs, j’ai montré que la suractivation de JNK dans les cellules invalidées pour PiT1 corrèle avec la dissocition antérieur du complexe TRAF2-cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (cIAPs). Ainsi, le complexe pro-apoptotique formé de la caspase-8, la protéine FAS-Associated via Death Domaine (FADD) et du Receptor Interactinf Protein 1 (RIP1) était plus actif.Par ailleurs, la boucle PiT1 et la boucle PiT2 ; son homologue ; ont été échangées, permettant ainsi l’obtention des protéines chimères P2-BclP1 et P1-BclP2. Celles-ci représenteraient des outils intéressants pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires engagés dans cette voie apoptotique. Enfin, le rôle de PiT1 dans l’apoptose induite par le TNF-α étudié dans des modèles cellulaires a été confirmé dans deux modèles murins faisant ainsi et pour la première fois un lien entre PiT1 et une pathologie inflammatoire, l’hépatite fulminante. Ces résultats montrent que l’absence de PiT1 sensibilise le foie à l’apoptose; à l’appui d’autres résultats ; PiT1 pourrait être considéré comme une cible thérapeutique dans des pathologies inflammatoires et cancéreuses. / PiT1/SLC20A1 was identified for the first time as retroviral receptor then phosphate inorganic-dependent sodium transporter activity. Through this more a function of phosphate inorganic (Pi) transporter, PiT1 is involved in multiple cellular processes such as bone mineralization, vascular calcification, renal and intestinal reabsorption of Pi. In our laboratory, a total mice Knock Out (KO) for this gene encoding for PiT1 was generated to characterize its physiological functions. The embryonic mice PiT1 KO have a lethal phenotype through liver damage. We have previously found that additional transport-independent functions. PiT1 is involeved in proliferation and in the regulation of tumour necrosis factor (TNF)-induced apoptosis. Modulated cells was mediated by an increased activation of c-Jun N-terminal Kinase (JNK).The aim of my study was to define the role of PiT1 in apoptotic mechanisms of TNF-α signaling. For that, I have studied the regulation cascade of TNF-α pathway in Hela cells expressing shPiT1 or shScramble. My results suggest that intra-cytoplasmic loop domain of PiT1 was interact with TRAF2 ; a key element in the MAPK pathway activation. Furthermore, we also have shown that TNF-induced association of two JNK upstream kinases (Germinal Centre Kinase (GCK or MAP4K) and Mixed Lineage Kinase 3 (MLK3 or MAP3K) to PiT1 suggesting that PiT1 inducing their deactivation and thus down-regulation of JNK. Furthermore, we have shown that JNK increased signalling in PiT1-depleted cells correlates with the earlier dissociation of TRAF2 – cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (cIAPs) complexes. Thus, the apoptotic complex formed by caspase-8, Fas-Associated protein via Death Domain (FADD) and Receptor Interacting Protein 1 (RIP1) was more effectively activated. Moreover, PiT1 and PiT2 loops, were exchanged, thus allowing obtaining chimeric proteins BclP1-P2 and P1-BclP2. These proteins represent valuable tools to explore the mechanisms involved in the apoptotic pathway. Finally, we confirmed the relevance of these observations in vitro and showed that PiT1 gene conditional deletion in the liver of adult mice increases their sensitivity to fulminant hepatitis TNF-induced. These results are the first report of the involvement of PiT1 in a fatal pathology.

La prééclampsie est une maladie humaine qui affecte 3-8 % des grossesses dans le monde, cliniquement définie par l’apparition de novo d’une hypertension et d’une protéinurie. La cause initiale de la maladie semble être liée à un défaut de vascularisation placentaire, ce qui entraine des cycles d'hypoxie – ré-oxygénation, une ischémie placentaire et la libération de débris placentaires dans la circulation maternelle. Ces derniers sont responsables d'une activation endothéliale généralisée, exacerbée par un état pro-coagulant et pro-inflammatoire. Pour mieux caractériser la réponse des cellules endothéliales aux facteurs plasmatiques présent dans la circulation maternelle des femmes prééclamptiques , nous avons choisi une approche à l’échelle du génome entier pour évaluer le profil d'expression génique (grâce à des puces d’expression) de la lignée de cellules endothéliales humaines de la veine ombilicale (HUVEC) cultivée avec du plasma prééclamptique, comparée au profil de cellules cultivées avec du plasma humain provenant de grossesses normales. Cette étude nous a permis d'identifier différents gènes modulés dont celui codant la protéine de dimérisation Jun 2 (JDP2, diminué près de trois fois) qui pourrait être responsable d'une partie des modifications transcriptomiques trouvées. De façon intéressante en effet, inhiber JDP2 par une approche de siRNA régule significativement à la baisse (entre autres) l'expression du VEGF, imitant ainsi les effets du plasma prééclamptique sur les HUVEC. Dans la dernière partie de mon projet, nous nous sommes particulièrement concentrés sur l'impact de l’inhibition de JDP2 sur des gènes induits par l'hypoxie. La tension partielle basse en oxygène modifie l'expression génique par l'intermédiaire de la stabilisation du facteur de transcription HIF- 1a. En fait, dans un état hypoxique, HIF- 1a échappe à la dégradation par le protéasome, il forme alors des hétérodimères avec ARNT (HIF- 1ß) et induit l'expression de gènes ayant un élément de réponse à l’hypoxie (HRE) dans leur promoteur. L'induction de l'expression du VEGF dans des conditions d’hypoxie constitue un des premiers modèles de l’effet de l’hypoxie sur l’expression génique et c’est également un des mieux caractérisés. Afin d'évaluer le rôle de JDP2 sur l'expression du VEGF, et plus généralement sur des gènes cible de l’hypoxie, nous avons cultivé des cellules HUVEC dans des conditions de normoxie et d’hypoxie. Les mêmes conditions ont été utilisées en association avec la transfection de siRNA contre JDP2. En conclusion, dans des conditions d’hypoxie, l’inhibition de JDP2 a un impact négatif sur l'expression du VEGF. De plus, JDP2 semble être un médiateur essentiel de l'expression génique induite par l'hypoxie, car il est nécessaire à une activité complète de promoteur contenant des HRE (démontré dans des essais luciférase). / Preeclamspia is a unique human disorder which affects 3-8% of pregnancies worldwide, clinically defined as the new onset of hypertension and proteinuria. The root cause of the disease seems to be linked to a defect of placental vascularization, which enhances cycles of hypoxia –reoxygenantion, placental ischemia and the release of placental debris into maternal circulation. The latter ones are responsible for a widespread endothelial activation, exacerbated pro-coagulable and pro-inflammatory state. To best characterize the response of endothelial cells to the plasma factors present in maternal circulation of preeclamptic women, we chose a genome –wide approach in order to evaluate the gene expression profile of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) line cultivated with preeclamptic plasma, compared to cells cultivated with human plasma coming from normal pregnancies. This study allows us to identify the gene Jun Dimerization Protein2 (JDP2) which could be responsible for part of transcriptomic modifications. Interestingly inhibiting JDP2 by the use of siRNA significantly down- regulates VEGF expression, thus mimicking the effects of preeclamptic plasma on HUVEC. In the last part of my project we focus specifically on the impact of JDP2 knock down on hypoxia- induced genes. Low oxygen tension modifies gene expression via the stabilization of the transcription factor HIF-1a. In fact under hypoxic condition, HIF-1a escapes from proteasomal degradation, it forms heterodimers with ARNT (HIF- 1ß) and induces the expression of genes having a Hypoxia Responsive Element (HRE) in their promoter. One of the first and best characterized models of the effect of hypoxia on gene expression is the induction of VEGF expression under hypoxic condition. In order to evaluate the contribution of JDP2 to VEGF expression, and more generally to hypoxia target genes, we cultivate HUVEC in normoxic and hypoxic condition. The same conditions were used in association with transfection of siRNA against JDP2. In conclusion, under hypoxic condition, JDP2 down- regulation has a negative impact on VEGF expression. Moreover, JDP2 seems to be an essential mediator of hypoxia –induced gene expression, since it is necessary for a full HRE promoter activity (demonstrated by Luciferase assays).

Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif spécialisé recouvrant les surfaces osseuses et assurant, avec d’autres tissus comme la membrane synoviale, le bon fonctionnement des articulations. Le cartilage est composé d'un type cellulaire, le chondrocyte, qui assure la synthèse et la dégradation d’une matrice extracellulaire essentielle à ses propriétés mécaniques. Les articulations, en conditions physiologique et pathologique, sont soumises à deux stress principaux agissant sur l’homéostasie du cartilage : le stress mécanique et le stress inflammatoire. Le premier objectif de ma thèse était d’étudier l’effet d’un stress mécanique de type étirement sur le profil d’expression des gènes dans des chondrocytes articulaires de lapin en culture primaire en utilisant une approche à grande échelle (micro‐arrays). Nous avons identifié 36 et 57 transcrits répertoriés dans le génome de lapin et dont les taux d’expression sont respectivement augmentés et diminués par un étirement équibiaxial cyclique (5%, 1Hz, 20h). Certains gènes sont connus pour leur implication dans l’inflammation, la mort cellulaire et la dégradation matricielle. Parmi eux, celui de la relaxine (RLN) était le gène le plus induit par l’étirement. La relaxine, hormone peptidique de la superfamille de l’insuline/relaxine, est connue pour son implication dans la reproduction et la grossesse. En revanche son rôle dans le cartilage articulaire restait à étudier. Le deuxième objectif de ma thèse était, par conséquent, de caractériser la fonction de la RLN dans le cartilage. Mes résultats de RT‐PCR quantitative montrent pour la première fois que la quantité des transcrits de la RLN est augmentée par le stress mécanique et le stress inflammatoire (traitement par l’interleukine‐1) dans des chondrocytes articulaires de lapin. De plus, la quantité des transcrits de la RLN est diminuée au cours de la dédifférenciation des chondrocytes. Dans un modèle de gonarthrose induite chez la souris par déstabilisation du ménisque médial, j’ai montré par immunofluorescence que la RLN est principalement présente au niveau des couches superficielles du cartilage de genou et que son expression diminue dans le cartilage arthrosique par rapport au cartilage normal. De plus, le traitement par de la RLN de chondrocytes de lapin augmente l’activité de la métalloprotéinase MMP‐9 impliquées dans la dégradation du cartilage. En conclusion, cette étude montre que la RLN est sensible aux stress mécanique et inflammatoire et la dédifférenciation des chondrocytes. Elle suggère que cette hormone pourrait moduler l’homéostasie du cartilage. La RLN est donc une cible potentielle d’intérêt dans les pathologies ostéoarticulaires. / The articular cartilage is a specialized conjunctive tissue covering bone surfaces. It ensures, together with other tissues like the synovial membrane, the right functioning of the articulations. The cartilage is formed of one cellular type, the chondrocyte, which is responsible for the synthesis and degradation of the extracellular matrix required for its mechanical properties. The joints, under physiological and pathological conditions, are subjected to two main types of stress that affect cartilage homeostasis: mechanical stress and inflammatory stress. The first objective of my PhD thesisis is to study the effect of stretching, one type of mechanical stress, on the gene expression profile in rabbit articular chondrocytes in culture using a large scale approach (micro‐arrays). 36 and 57 transcripts of the rabbit genome which are up‐regulated and down‐regulated by equibiaxial cyclic tensile stretching (5%, 1Hz, 20h) respectively were identified. Some of these genes are known for their implication in inflammation, cell death and matrix degradation. Among them, the relaxin (RLN) gene is the most induced by stretching. RLN is a peptide hormone that belongs to the insulin/relaxin superfamily. It is known for its implication in reproduction and pregnancy. However, the role of RLN in cartilage is still to be studied. The second objective of my PhD thesis is, consequently, to characterize the function of RLN in cartilage. My qRT‐PCR results show, for the first time, that the RLN transcript levels increase upon mechanical and inflammatory (interleukin ‐1treatment) stress in rabbit articular chondrocytes. Moreover, RLN transcript levels decrease during cell dedifferentiation. In a model of gonarthrosis induced in mice by destabilization of the medial meniscus, I showed by immunofluorescence that RLN is mainly present in the superficial layers of the knee cartilage and that its expression decreases in osteoarthritic cartilage as compared to normal cartilage. Furthermore, treatment of rabbit chondrocytes with RLN increases the activity of the metalloproteinase MMP‐9 involved in cartilage degradation. In conclusion, this study shows that RLN is sensitive to mechanical and inflammatory stress and to chondrocyte dedifferentiation. It also suggests that this hormone could modulate cartilage homeostasis. Therefore, RLN is a potential target in osteoarticular pathologies.

La dérégulation de la signalisation Wnt est impliquée dans les anomalies du développement et dans la pathogenèse de nombreuses maladies, y compris l'arthrose. Au cours de ce travail, nous avons étudié l'effet de Wnt-3a sur l’ADAMTS-4 dans les explants de cartilage et les chondrocytes primaires humains. Nous avons observé que Wnt-3a régule négativement l'expression de cette agrecanase et avons démontré que cette inhibition est médiée par Frizzled-8 via l’activation de la voie canonique et inhibition de l'activité de NFκB. En outre, nous avons montré que Wnt-3a est capable de s’opposer à l'induction de l’expression de l’ADAMTS-4 par l'IL-1ß, indiquant que la voie Wnt/ß-caténine peut jouer un rôle protecteur dans l'arthrose. D'autre part, la signalisation non canonique de Wnt induit une perte de la stabilité phénotypique des chondrocytes articulaires qui représente un événement précoce dans l'arthrose, cependant les mécanismes impliqués restent à élucider. Au cours de ce travail, nous avons identifié la cascade Wnt/CaMKII/B-raf/ERK1/2 comme voie de signalisation non-canonique modulant le phénotype chondrocytaire et avons montré que le syndécane4 est un composant essentiel. Nous avons démontré qu’en réponse à Wnt-3a, Frizzled-6 active la voie ERK1/2 en induisant la fixation de la kinase CaMKIIα au syndécane4 et celle de B-Raf à DVL-2 conduisant à l'activation de B-Raf. Dans une boucle de rétrocontrôle, Wnt-3a inhibe l’expression du syndécane4. Ce travail révèle le rôle du syndécane4 dans la régulation du phénotype chondrocytaire et met en évidence de nouvelles cibles qui peuvent avoir un potentiel thérapeutique contre l'arthrose / Dysregulation of Wnt signaling has been implicated in developmental defects and in the pathogenesis of many diseases, including osteoarthritis. Here, we studied the effect of Wnt-3a on ADAMTS-4 in human cartilage explants and primary chondrocytes and found that Wnt-3a negatively regulates the expression of this aggrecanase. We demonstrated that Wnt-3a inhibition of ADAMTS-4 expression is mediated by Frizzled-8 through activation of the canonical Wnt/ß-catenin pathway leading to inhibition of NFκB activity and down-regulation of ADAMTS-4. Furthermore, we showed that Wnt-3a is able to counteract the induction of ADAMTS-4 by IL-1ß, therefore indicating that Wnt/ß-catenin pathway may play a protective role in osteoarthritis. On the other hand, Non-canonical Wnt signaling induces loss of phenotypic stability of articular chondrocytes which represents an early event in osteoarthritis, but the underlying mechanisms are poorly understood. In this thesis, we identify Wnt/CaMKII/B-raf/ERK1/2 cascade as non-canonical signaling pathway that modulates chondrocyte phenotype and revealed that syndecan4 is an essential component of this pathway. We show that in response to Wnt-3a, Fz-6 activates non-canonical signaling by triggering the docking of CaMKIIα to syndecan4 and that of B-raf to DVL-2 leading to the activation of B-raf that transduces signals to ERK1/2 MAPK. In a feedback loop, non-canonical Wnt down-regulates the expression of syndecan4 to negatively regulate the signaling. Our finding uncovers a previously unanticipated role of syndecan4 as a regulator of chondrocyte differentiation. This study also provides new targets which may have therapeutic potential in osteoarthritis