Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Réovirus, connu sous le nom REOLYSIN®, est présentement à l'étude à titre d'agent oncolytique. Or, la spécificité du virus pour les cellules cancéreuses pourrait être optimisée par une modification au niveau de la protéine d'attachement σ1. La présente étude vise à démontrer qu'une telle amélioration est possible par l'utilisation de la méthode nouvellement décrite de génétique inverse. Par cette technique, il est possible d'ajouter un polypeptide d'une longueur de quarante acides aminés à l'extrémité C-terminale de σ1. Il est aussi possible d'engendrer des virus mutés en leur site d'activité mucinolytique. Les virus nouvellement créés démontrent une efficacité de réplication diminuée, mais demeurent infectieux. Contrairement aux méthodes traditionnellement utilisées avec réovirus, la méthode de génétique inverse permet de conserver les mutations engendrées, par substitution ou addition, au cours des cycles de réplication. Une telle étude démontre qu'il serait possible de modifier le tropisme de réovirus. / Reovirus, also known under the tradename REOLYSIN®, is currently under clinical trial as an oncolytic agent. The specificity of the virus for transformed (cancerous) cells could be improved by modifications of the σ1 attachment protein. This study presents two ways to achieve this improvement by using a newly developed method of reverse genetics for double-stranded RNA viruses. As a proof of concept, we engineered the addition of an exogenous polypeptide of forty amino-acids to the C-terminal end of σ1. Subsequently, we created viruses with compromised mucinolytic activities by introducing amino-acids substitutions in the appropriate genetic sites. A decreased replicative efficacy was observed in all experimentally generated viruses, despite maintaining their infectious capacity. Reverse genetics allows the generation of viruses that retain their mutations throughout successive replicative cycles, which was impossible with traditionnal techniques. This project demonstrates the feasibility of tropism modification by using the reverse genetics method.

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Les virus sont les causes principales d’encéphalites et plus d’une centaine d’entre eux sont impliquées dans ces pathologies. Cependant, plus de 50% des encéphalites restent sans étiologie, dû en partie à des techniques de diagnostic mal adaptées ou à une méconnaissance de l’agent infectieux impliqué. Nous rapportons les cas de deux enfants d’une même famille qui ont développé une encéphalite nécrosante aiguë (ANE) conduisant à une hospitalisation de plusieurs semaines en soin intensif. Les virus communément recherchés dans les cas d’encéphalites n’ont pas été retrouvés chez ces patients. Par contre, la culture réalisée à partir des prélèvements d’urine des enfants et d’un prélèvement de gorge pour l’un des deux, a permis d’isoler un nouveau réovirus nommé MRV2Tou05. L’analyse moléculaire des 10 segments du génome viral a indiqué qu’un nouveau réovirus de sérotype 2 avait été isolé chez ces patients et qu’il s’agissait d’un virus réassortant entre une souche isolée de porc et une souche humaine. Le virus se réplique dans des cellules neuronales humaines et a été retrouvé par amplification de gène dans les prélèvements d’urine et dans certains prélèvements de sérum des deux enfants. De plus, une réponse anticorps spécifique dirigée contre MRV2Tou05 a été détectée dans les sérums des patients de l’étude alors qu’aucune réponse anticorps n’a été observée dans 40 sérums de donneurs sains. Toutes ces données sont en faveur de l’implication du nouveau réovirus isolé dans l’encéphalopathie observée. Des études supplémentaires réalisées in vivo dans un modèle animal permettront de mieux comprendre le rôle étiologique de ce nouveau réovirus dans les cas d’encéphalites / Viruses remain the main cause of Acute Encephalitis and more hundred of them are implicated in these pathologies. However, the etiologic agent is not determined in approximately 50% of cases, owed partially to not well adapted techniques of diagnosis or to misunderstanding of the involved infectious agent. We report the cases of two children in a same family who developed an acute necrotizing encephalopathy (ANE) leading to hospitalization in intensive care unit. Viruses commonly found in encephalitis were not detected in cerebrospinal fluid of these patients. However, a new reovirus strain of serotype 2, MRV2Tou05 was isolated from urine and throat swab samples on epithelium cells and was identified by electron microscopy and genome sequencing. Molecular characterization of its segmented genome indicates that MRV2Tou05 is a reassortant issued from swine and human strains. This new reovirus strain was directly detected by a specific sensitive molecular test in urine and serum samples from the two children. A specific antibody response directed against this new reovirus strain was detected in patient sera, whereas no response was observed in 38 healthy adult sera. Both its isolation and molecular detection from samples of the patients and the specific immune response toward this strain suggest an etiologic role of this reovirus in the ANE cases described herein. The reproduction of symptoms in an animal model will help understanding the exact role of this strain in ANE cases

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Le réovirus de mammifères est un virus oncolytique à l’étude pour sa capacité à infecter et détruire préférentiellement les cellules cancéreuses. Les liens entre le potentiel oncolytique du réovirus et son induction des voies de signalisation de l’interféron méritent des éclaircissements. Encore à ce jour, les déterminants viraux et les composantes cellulaires impliqués dans la réponse interféron lors de l’infection par ce virus demeurent à être mieux caractérisés. Des virus mutants ont préalablement été générés à partir d’un virus fortement inducteur d’interféron (T3DK) dans le fond génétique d’un virus faiblement inducteur d’interféron (T3DS) afin d’étudier les effets de certains polymorphismes. Cependant, les mécanismes de ces déterminants viraux et comment leurs polymorphismes les modifient pour amplifier ou restreindre l’induction d’interféron sont encore incertains. Notre approche a permis de révéler que les protéines μ2 et λ1 du réovirus modulent les événements précoces menant à la reconnaissance virale et à la réponse interféron. Nous avons découvert que le phénotype d’induction d’interféron sous l’effet de μ2, λ1 ou μ2 et λ1 provenant de T3DK était corrélé entre les niveaux protéiques et transcriptionnels. De plus, la présence simultanée de μ2 et λ1 (de T3DK) avait un effet synergique provoquant des niveaux d’interféron plus qu’additifs par rapport à la présence de μ2 ou de λ1 seuls. D’autre part, la transfection d’ARN extrait tôt de cellules infectées (mais pas celle d’ARN extrait tardivement) provoque une induction d’interféron qui suit cette même tendance. Par conséquent, les résultats démontrent que plusieurs protéines du réovirus pourraient s’acquitter de rôles multiples qui convergent vers la modulation de la réponse interféron. Cela laisse paraître les rôles envisageables de μ2 et λ1 dans le désassemblage, la participation à l’exposition du génome viral et/ou dans la contribution au sein du complexe de transcription viral. L’analyse comparative de virus mutants conçus par génétique inverse et qui sont à même de contrôler la réponse interféron semble une piste intéressante pour mieux appréhender les implications des polymorphismes dont ils sont porteurs. Cette approche pourrait fournir une meilleure compréhension du réovirus et être utile dans la perspective d’optimisation du potentiel oncolytique du réovirus. / The mammalian reovirus is an oncolytic virus under study for its ability to preferentially infect and destroy cancer cells. The links between the oncolytic potential of reovirus and its induction of interferon signaling pathways require clarification. Still to this day, the viral determinants and cellular components involved in the interferon response upon infection with this virus remain to be better characterized. Mutant viruses were previously generated from a high interferon-inducing virus (T3DK) in the genetic background of a low interferon-inducing virus, (T3DS) to study the effect of certain polymorphisms. However, the mechanisms of these viral determinants and how their polymorphism modify them to amplify or limit interferon induction are still unclear. Our approach revealed that the μ2 and λ1 proteins modulate early events leading to viral recognition and interferon response. We found that the phenotype of interferon induction under the effect of μ2, λ1 or μ2 and λ1 from T3DK showed a correlation between protein and transcriptional levels. Furthermore, the simultaneous presence of μ2 and λ1 (from T3DK) had a synergistic effect causing more than additive interferon levels compared with the presence of μ2 or λ1 alone. On the other hand, transfection of RNA extracted from early-infected cells (but not RNA extracted from late-infected cells) caused interferon induction following this same trend. Therefore, the results demonstrate that several proteins from reovirus could have multiple roles that converge to modulate the interferon response. This suggests potential roles for μ2 and λ1 in disassembly, participation in viral genome exposure, and/or contribution within the viral transcription complex. The comparative analysis of mutant viruses engineered by reverse genetics, and which are able to modulate the interferon response, would be an interesting avenue to better understand the implications of the polymorphisms they carry. This approach could provide a better understanding of the reovirus and be useful in the perspective of optimizing the oncolytic potential of this virus.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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