La chicorée produit et accumule une panoplie originale d’esters d’acide caféique : les acides caftarique (CTA), chicorique (diCTA), isochlorogénique (diCQA) et chlorogénique (CQA). En plus de leurs multiples rôles physiologiques et écologiques pour la plante, ces composés phénoliques sont dotés de nombreuses propriétés nutritionnelles et thérapeutiques. La valorisation de ces composés nécessite, au préalable, une connaissance approfondie de leur métabolisme. Si la biosynthèse du CQA est bien documentée, celles des autres molécules ne sont que partiellement décrites. L’objectif de ce travail de thèse consistait en la caractérisation de la voie de biosynthèse du CQA et du diCQA. L’analyse détaillée des contenus en polyphénols a révélé une distribution tissulaire originale. Le CTA et le diCTA sont les composés majeurs dans les feuilles alors que le diCQA est le composé majeur dans les racines. Les contenus en CQA ne permettent pas de différencier ces organes. En vue d’une analyse transcriptomique, plusieurs systèmes expérimentaux ont été testés de manière à induire la production et l’accumulation des composés ciblés. Par une approche de génétique inverse, deux gènes codant des HCTs et trois des HQTs ont été identifiés et caractérisés. Ces protéines interviennent dans la synthèse du CQA. Une approche de biochimie a permis d’identifier une séquence protéique potentiellement impliquée dans la synthèse de diCQA chez la patate douce. Par homologie de séquence, un gène candidat a été identifié chez la chicorée. Les travaux présentés dans ce mémoire constituent une contribution significative au décryptage des voies de biosynthèse de ces molécules au fort potentiel. / Chicory synthesizes and accumulates an original combination of caffeic acid i.e. caftaric (CTA), chicoric (diCTA), isochlorogenic (diCQA) and chlorogenic (CQA) acids. In addition to their multiple physiological and ecological roles in plants, these compounds have many pharmaceutical and nutritional properties. A complete understanding of their biochemical pathways is required for optimization of their production. If CQA biosynthesis is well documented, the pathways involved in the synthesis of the other molecules are far to be fully understood. The goal of this PhD thesis was to characterize the pathways involved in CQA and diCQA synthesis.Detailed analysis of phenolic contents revealed an original tissue distribution. CTA and diCTA are mainly accumulated in shoots whereas diCQA was the main compound in roots. CQA is uniformly distributed. To anticipate a transcriptomic analysis, several experimental models have been used in order to modulate the synthesis and the accumulation of the compounds of interest. Through a reverse genetic approach we identified and characterized 2 genes encoding HCTs and 3 genes encoding HQTs. These proteins are involved in the synthesis of CQA. By a biochemical approach, we identify a peptide sequence putatively involved in diCQA synthesis in sweet potato. An homologous gene has been identified in chicory. Data reported here contribute to a better understanding of the biosynthesis of these high-value compounds.

Alors que les études effectuées sur la biosynthèse de l’amidon ont permis,depuis une vingtaine d’années, une compréhension approfondie de ce mécanisme,les travaux sur la dégradation sont aujourd’hui assez peu développés et restreintsessentiellement au modèle de l’amidon transitoire chez Arabidopsis thaliana chez quiune approche de génétique inverse est mise en oeuvre. Dans ce contexte, nousavons entrepris une démarche complémentaire de génétique formelle chezChlamydomonas reinhardtii, organisme modèle permettant l’étude du métabolismede l’amidon transitoire et de réserve, dans le but d’identifier de nouvelles fonctionsnotamment impliquées dans la régulation du processus catabolique. L’applicationd’un crible à l’iode en deux étapes a permis l’isolement de 62 souchespotentiellement déficientes pour la dégradation de l’amidon parmi plus de 32000transformants. L’identification des gènes touchés a mis en évidence des fonctionsdéjà caractérisées chez le modèle Arabidopsis, telles que les protéines Mex, Bam1et Dpe2, confirmant ainsi la force du crible et validant la démarche entreprise. Lacaractérisation d’autres mutants nous permet d’envisager l’identification de nouvellesfonctions impliquées dans la dégradation de l’amidon ou dans la régulation de ceprocessus chez les végétaux. En parallèle, la caractérisation de la granulométrie desamidons produits par nos mutants augure également de la découverte de fonctionsimpliquées dans le déterminisme de la taille des grains d’amidon. / Starch biosynthesis has been widely studied for more than twenty years andthe understanding of this process is now quite complete. Meanwhile, studies onstarch catabolism have mainly been restricted to one single organism, Arabidopsisthaliana, a plant model for transitory starch metabolism studies through reversegenetics. We then decided to apply a complementary forward genetics approach inthe unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii in order to decipher thecatabolism of both transitory and storage starches. Using random mutagenesis and atwo-step iodine screening, we were able to isolate 62 putative catabolic mutantsamong more than 32000 insertional transformants. The localization of the foreignDNA insertion sites allowed the identification of mutations for key catabolic activitiessuch as Mex, Bam1 and Dpe2, which were already described in Arabidopsis,revealing the strength of our phenotypic screening procedure. The preliminarycharacterizations performed on the other mutants defective for previouslyuncharacterized functions may define new functions affecting starch catabolism orregulation of this process in microalgae. . Some of these mutants are also harboringaltered size distributions of their starch granules and may represent a valuablematerial for understanding the mechanisms controlling the starch granule sizesdetermination in Chlamydomonas reinhardtii.

La maladie de Newcastle est une de deux pestes aviaires qui, comme l’influenza, impactent fortement les élevages d’oiseaux domestiques par leur incidence clinique et leurs conséquences économiques sur la filière (contrôle des mouvements d’animaux, abattages sanitaires et préventifs). Des vaccins contre cette maladie ont été développés il y a plusieurs décennies à base de souches virales isolées dans les années 60. Ils assurent normalement une excellente protection clinique. Toutefois, depuis une dizaine d’années, des observations de terrain, principalement en Afrique et en Asie, font état d’échecs partiels de vaccination avec occurrence de foyers réduits dans des élevages a priori correctement vaccinés. En parallèle, des essais in vivo en conditions contrôlées ont établi que les vaccins actuels protégeaient bien cliniquement contre une épreuve avec des souches virulentes récentes mais n’empêchaient pas leur excrétion par les animaux vaccinés. Pour résoudre cette problématique, l’objectif de ce travail a été de générer une souche vaccinale plus efficace contre les souches virulentes circulant actuellement à l’échelle du globe. Pour générer des virus atténués modifiés, nous avons dû dans un premier temps améliorer le système conventionnel de génétique inverse. Nous montrons que la réduction du nombre de plasmides à 2 dans le système, permet de générer plus de virus atténués que le système conventionnel basé sur 4 plasmides. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à étudier le comportement in vitro de virus atténués et virulents équipés de marqueurs fluorescents. Nous montrons que seuls les virus virulents induisent un effet cytopathique in vitro. En revanche, les deux types de virus induisent une infection persistante à long terme sans effet cytopathique. Les cellules infectées de façon persistante résistent à une surinfection par un autre virus. En revanche, lors de co-infections simultanées, nous établissons qu’une cellule infectée par un premier virus peut s’infecter par un second virus lors d’un transfert direct de matériel viral d’une cellule à une autre par des extensions membranaires. Cette observation est remise en perspective par rapport à la capacité de ces virus à se recombiner chez l’animal telle qu’identifiée par des analyses bioinformatiques comparatives de différents isolats. En effet, nous montrons que des cellules peuvent s’infecter avec plusieurs virus par contact direct. Dans un dernier travail, une nouvelle souche vaccinale a été générée consistant à insérer des antigènes immunoprotecteurs d’un virus original isolé à Madagascar en 2008, dans un génome d’une souche vaccinale conventionnelle utilisée depuis plus de 50 ans. Nous montrons que cette nouvelle souche protège efficacement contre trois génotypes viraux dont deux circulant actuellement en Afrique et en Asie. / In addition to influenza, Newcastle disease is one of the two major diseases of poultry that strongly impact the animal health and farming owing to animal bans and depopulations. Vaccines against Newcastle disease are available. They have been developed some decades ago from isolates collected in the 60’s. They usually provide an excellent clinical protection. However, field reports of the last decade, mainly from Africa and Asia, suggest partial vaccination failures in some farms despite proper vaccination. In parallel, in vivo trials have shown that current vaccines provide a good clinical protection against a challenge with recent field strains, but do not prevent shedding of the challenge virus from vaccinated birds. To address this issue, one of the objectives of this study was to generate a new vaccine prototype with improved efficacy against virulent strains circulating worldwide. To generate new engineered attenuated viruses, we first developed an improved reverse genetics system. We demonstrate that the reduction of the number of plasmids to 2 compared to the conventional system based on 4 plasmids does not affect the performances of reverse genetics for virulent strains but significantly increases the yield of attenuated viruses. In a second step, we focused on the behavior of the attenuated and virulent viruses generated by reverse genetics. The viruses were tagged with fluorescent reporter genes to make easier they follow up in cell culture. We show that only virulent strains produce cytopathic effects in vitro. However, both attenuated and virulent strains are able to establish persistent infection in cells without cytopathic effects. Persistently infected cells resist to a super-infection by another virus. In contrast, after co-infection by two different viruses, we show that a cell infected by one virus can be infected by a second one by direct virus trafficking between the cells through cell membrane extensions. This observation supports the possibility of recombination events in the field which are frequently claim in the literature from comparative bioinformatics of field isolates and vaccine strains. Indeed, we show that cells can be infected by multiple viruses through direct contacts between cells. In a last step, a new vaccine prototype has been produced consisting in the substitution of immune-protective antigens in the conventional LaSota vaccine by their homologues derived from an original isolate of Madagascar (2008). We show that this prototype is protective against challenges with three different viruses, including two recent isolates from Africa and Asia.

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Les systèmes de génétique inverse permettent de manipuler les génomes viraux et se sont révélés essentiels pour étudier les virus à ARN. Récemment, une méthode basée sur la PCR, la méthode ISA (Infectious Subgenomic Amplicons), a été développée. La première partie de cette thèse se concentre sur la simplification de la méthode ISA. La principale contrainte d'ISA est l'exigence de produire des fragments génomiques modifiés qui nécessite un promoteur de transcription à l’extrémité 5’ du premier fragment et un ribozyme du virus de l'hépatite delta, suivi du signal de polyadénylation du virus simien 40 (HDR / SV40pA) à l’extrémité 3’ du dernier fragment. Ici, nous proposons une nouvelle méthode simplifiée "Haiku", dans laquelle sont fournis ces deux séquences en tant qu'amplicons séparés. Cette technique améliorée a été appliquée avec succès à une large gamme de virus dans des cellules de moustiques et de mammifères. La deuxième partie de cette thèse est axée sur la caractérisation de la population virale issue de divers systèmes de génétique inverse en utilisant le HRV-B14 comme modèle.Nos résultats montrent que le choix de la méthode a influencé la diversité génétique des populations virales mais quelle que soit la méthode utilisée, la fitness réplicative était similaire. En outre, nos données ont révélé que le poly(A)25 est la longueur optimale pour récupérer le HRV-B14 avec une efficacité élevée. La dernière partie du présent travail a examiné le potentiel de la méthode «ISA» pour conserver le spectre mutant présent dans l'échantillon viral d'origine. Nous avons montré que cette méthode récapitule au moins partiellement les quasi-espèces de la population virale native. / Reverse genetics systems allow manipulating viral genomes and have proved to be essential for studying RNA viruses. Recently, a PCR-based method, named ISA (Infectious Subgenomic Amplicons), was developed to facilitate the study of single-stranded positive-sense RNA viruses. The first part of the present work focused on simplifying the ISA method. The main constraint of the canonic protocol of the ISA method is the requirement to produce modified genomic fragments encompassing the transcription promoter and the terminator. Here, we propose the ultimately simplified "Haiku" design in which the promoter and the terminator are provided as additional separate DNA amplicons. This improved procedure was successfully applied to the rescue of a wide range of viruses in mosquito and mammalian cells. The second part of this work assessed the viral population issued from different reverse genetics systems. Using HRV B-14 as a model, we compared the genetic diversity and the replicative fitness of viruses generated using the most commonly used reverse genetics methods. Our results showed that the choice of the method influenced the genetic diversity of viral populations but whatever the method used, the replicative fitness was similar. In addition, Our data revealed that poly(A)25 is the optimal length to recover HRV-B14 with high efficiency and could be used to recover polyadenylated RNA viruses other than HRV-B14. The last part of the present work investigated the potential of the “ISA” method to conserve the mutant spectrum present in the original viral sample. We have showed that this method recapitulate at least partially the quasispecies of the native viral population.

Le chloroplaste est un organite totalement intégré dans le métabolisme de la cellule végétale. Il possède des voies métaboliques qui lui sont propres comme la photosynthèse, la synthèse d'acides gras, la synthèse d'acides aminés. Le chloroplaste est limité par l'enveloppe, constituée de deux membranes distinctes et d'un espace intermembranaire. Par sa localisation, l'enveloppe du chloroplaste constitue un site privilégié de transport de métabolites, d'ions, de protéines et d'informations entre le stroma du chloroplaste et le cytosol de la cellule végétale. Ainsi, l'enveloppe doit renfermer de nombreux systèmes de transport permettant ces échanges. Malgré l'importance de ces transporteurs, très peu d'entre eux ont été totalement caractérisés. La limitation principale provient de la très faible représentation de ces protéines et de leur hydrophobicité. Afin de caractériser de nouveaux systèmes de transport, nous avons développé une nouvelle approche qui nous a permis d'identifier de nouvelles protéines. Nous avons ensuite poursuivi la caractérisation fonctionnelle de ces protéines.<br />L'approche que nous avons développée repose sur le caractère hydrophobe des transporteurs qui permet de les solubiliser dans des mélanges de solvants organiques, comme le chloroforme/méthanol. Cette approche permet l'extraction de protéines hydrophobes et mineures de l'enveloppe, elle est spécifique de la localisation subcellulaire. D'autre part, suivant leur hydrophobicité, les protéines peuvent être extraites de façon différentielle en fonction des rapports de solvants organiques. Les protéines extraites sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes, et analysées par microséquençage. Plusieurs protéines ont été identifiées dont les protéines IE16 et IE18.<br />Nous avons poursuivi la caractérisation fonctionnelle de IE16 et IE18 en analysant d'une part les homologies de séquences avec des protéines de fonction connue. D'autre part, nous avons obtenu des mutants de cyanobactéries et d'Arabidopsis thaliana dont les gènes correspondant aux protéines IE16 et IE18 ont été interrompus. L'analyse des phénotypes peut fournir des informations sur la fonction des protéines mutées. Notamment, la protéine IE18 pourrait être impliquée dans le transport des ions K+ et/ou H+. Afin d'effectuer des analyses biochimiques sur ces protéines, elles ont été exprimées dans des systèmes hétérologues. Ces protéines sont produites dans le système d'expression cellules d'insecte/baculovirus alors qu'aucune expression n'est détectée dans le système E. coli. Ces protéines forment des homodimères. Les analyses fonctionnelles par électrophysiologie sont en cours actuellement.<br />Lors des premiers séquençages des protéines extraites dans les solvants organiques, une séquence correspondant à une annexine a été obtenue. Nous avons poursuivi l'étude de cette protéine. Le sulfolipide, lipide spécifique du plaste, est un site à haute affinité permettant l'interaction de l'annexine avec l'enveloppe. L'annexine copurifie avec les chloroplastes et des vésicules d'enveloppe en présence de calcium. Cette protéine ne forme pas de canal ionique lorsqu'elle est insérée dans des bicouches lipidiques planes. Elle ne présente pas non plus d'activité péroxydase. La signification de son interaction avec l'enveloppe du chloroplaste reste à être déterminée.<br />L'approche que nous avons développée peut être utilisée de façon systématique pour l'étude des transports dans différents systèmes membranaires.

Réovirus, connu sous le nom REOLYSIN®, est présentement à l'étude à titre d'agent oncolytique. Or, la spécificité du virus pour les cellules cancéreuses pourrait être optimisée par une modification au niveau de la protéine d'attachement σ1. La présente étude vise à démontrer qu'une telle amélioration est possible par l'utilisation de la méthode nouvellement décrite de génétique inverse. Par cette technique, il est possible d'ajouter un polypeptide d'une longueur de quarante acides aminés à l'extrémité C-terminale de σ1. Il est aussi possible d'engendrer des virus mutés en leur site d'activité mucinolytique. Les virus nouvellement créés démontrent une efficacité de réplication diminuée, mais demeurent infectieux. Contrairement aux méthodes traditionnellement utilisées avec réovirus, la méthode de génétique inverse permet de conserver les mutations engendrées, par substitution ou addition, au cours des cycles de réplication. Une telle étude démontre qu'il serait possible de modifier le tropisme de réovirus. / Reovirus, also known under the tradename REOLYSIN®, is currently under clinical trial as an oncolytic agent. The specificity of the virus for transformed (cancerous) cells could be improved by modifications of the σ1 attachment protein. This study presents two ways to achieve this improvement by using a newly developed method of reverse genetics for double-stranded RNA viruses. As a proof of concept, we engineered the addition of an exogenous polypeptide of forty amino-acids to the C-terminal end of σ1. Subsequently, we created viruses with compromised mucinolytic activities by introducing amino-acids substitutions in the appropriate genetic sites. A decreased replicative efficacy was observed in all experimentally generated viruses, despite maintaining their infectious capacity. Reverse genetics allows the generation of viruses that retain their mutations throughout successive replicative cycles, which was impossible with traditionnal techniques. This project demonstrates the feasibility of tropism modification by using the reverse genetics method.

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Le virus de la paralysie chronique de l’abeille (CBPV) est responsable d’une maladie infectieuse et contagieuse de l’abeille domestique. c'est un virus anisométrique et non enveloppé. Les premières études ont décrit son génome étant constitué de cinq segments d’ARN simple brin de polarité positive : deux ARN majoritaires et trois ARN minoritaires. Cependant, ces derniers n’ont pas été observés lors de récentes études. L’ARN 1 coderait pour les protéines non structurales et L’ARN 2 coderait pour deux protéines structurales.Les ARN totaux du CBPV sont infectieux chez l’abeille par inoculation intra-thoracique. Toutefois, les éléments génétiques essentiels à la réplication du virus n’étaient pas encore déterminés. Néanmoins, cette information est cruciale pour la mise en place du système de génétique inverse pour le CBPV afin de mieux caractériser ce virus. Lors de ce travail, nous avons montré le pouvoir infectieux des ARN majoritaires du CBPV. Ces résultats nous ont permis d'accomplir la première étape de la mise du système de génétique inverse pour le CBPV: le clonage des ARN majoritaires. Les résultats préliminaires montrent que les ARN transcrits in vitro à partir des plasmides recombinants sont répliqués in vivo après leur inoculation aux abeilles, mais ne conduisaient à aucun signe clinique de la maladie. Le système de génétique inverse du CBPV développé offrira la possibilité, par mutagenèse dirigée, de définir les fonctions des ORF et des protéines voire de permettre la production de protéines purifiées nécessaires à la production d’anticorps monoclonaux afin de développer un test rapide de diagnostic de la paralysie chronique. / Chronic bee paralysis virus (CBPV) causes an infectious and contagious disease of adult honeybees. CBPV is an anisometric and non-enveloped virus. First studies described its genome as composed of five positive single-stranded RNAs: two major RNAs and three minor RNAs. However, these latest were not observed during recent studies. CBPV RNA 1 encodes for the non-structural proteins and RNA 2 encodes for two structural proteins. The total RNAs of CBPV are infectious by intra-thoracic inoculation of bees. However, the essential genetic elements for CBPV replication are still unknown. Besides, this information is crucial to develop a reverse genetic system in order to better characterize this virus.In this work, we showed the infectivity of CBPV major RNA. These results allowed us to accomplish the first step of the implementation of the reverse genetics system for CBPV: cloning of major RNA. Our preliminary results showed that RNA transcribed in vitro from recombinant plasmids replicated in vivo after inoculation to bees, but did not led to any clinical signs of the disease.The reverse genetics system developed for CBPV facilitate the study of CBPV genome, by site directed mutagenesis, the determination of its proteins functions. Moreover, it allows the expression of purified proteins necessary for production of monoclonal antibodies to develop a rapid diagnostic test for CBPV.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d’infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd’hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n’y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s’est articulé autour de deux axes principaux: (i) L’étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l’entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d’induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d’être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l’objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l’identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L’atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l’infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinaux. / Human metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since2001, this virus and its pathogenes is still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Live-attenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated.