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Le virus de la paralysie chronique de l’abeille (CBPV) est responsable d’une maladie infectieuse et contagieuse de l’abeille domestique. c'est un virus anisométrique et non enveloppé. Les premières études ont décrit son génome étant constitué de cinq segments d’ARN simple brin de polarité positive : deux ARN majoritaires et trois ARN minoritaires. Cependant, ces derniers n’ont pas été observés lors de récentes études. L’ARN 1 coderait pour les protéines non structurales et L’ARN 2 coderait pour deux protéines structurales.Les ARN totaux du CBPV sont infectieux chez l’abeille par inoculation intra-thoracique. Toutefois, les éléments génétiques essentiels à la réplication du virus n’étaient pas encore déterminés. Néanmoins, cette information est cruciale pour la mise en place du système de génétique inverse pour le CBPV afin de mieux caractériser ce virus. Lors de ce travail, nous avons montré le pouvoir infectieux des ARN majoritaires du CBPV. Ces résultats nous ont permis d'accomplir la première étape de la mise du système de génétique inverse pour le CBPV: le clonage des ARN majoritaires. Les résultats préliminaires montrent que les ARN transcrits in vitro à partir des plasmides recombinants sont répliqués in vivo après leur inoculation aux abeilles, mais ne conduisaient à aucun signe clinique de la maladie. Le système de génétique inverse du CBPV développé offrira la possibilité, par mutagenèse dirigée, de définir les fonctions des ORF et des protéines voire de permettre la production de protéines purifiées nécessaires à la production d’anticorps monoclonaux afin de développer un test rapide de diagnostic de la paralysie chronique. / Chronic bee paralysis virus (CBPV) causes an infectious and contagious disease of adult honeybees. CBPV is an anisometric and non-enveloped virus. First studies described its genome as composed of five positive single-stranded RNAs: two major RNAs and three minor RNAs. However, these latest were not observed during recent studies. CBPV RNA 1 encodes for the non-structural proteins and RNA 2 encodes for two structural proteins. The total RNAs of CBPV are infectious by intra-thoracic inoculation of bees. However, the essential genetic elements for CBPV replication are still unknown. Besides, this information is crucial to develop a reverse genetic system in order to better characterize this virus.In this work, we showed the infectivity of CBPV major RNA. These results allowed us to accomplish the first step of the implementation of the reverse genetics system for CBPV: cloning of major RNA. Our preliminary results showed that RNA transcribed in vitro from recombinant plasmids replicated in vivo after inoculation to bees, but did not led to any clinical signs of the disease.The reverse genetics system developed for CBPV facilitate the study of CBPV genome, by site directed mutagenesis, the determination of its proteins functions. Moreover, it allows the expression of purified proteins necessary for production of monoclonal antibodies to develop a rapid diagnostic test for CBPV.

Le virus de la paralysie chronique de l'abeille (Chronic bee paralysis virus, CBPV) est l'agent étiologique d'une maladie infectieuse et contagieuse des abeilles adultes (Apis mellifera L.), appelée la paralysie chronique. Le CBPV est un virus à ARN simple brin positif qui contient 2 fragments d'ARN majoritaires. L'ARN 1 (3674 nt) et l'ARN 2 (2305 nt) codent respectivement 3 et 4 cadres ouverts de lecture (ORF). La séquence d'acides aminés de l'ORF 3 de l'ARN 1 partage des similitudes avec l'ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) des virus des familles Nodaviridae et Tombusviridae. Par analogie avec ces familles virales, il a été suggéré que l'ARN 1 coderait les protéines non-structurales tandis que l'ARN 2 coderait les protéines structurales. Cependant, la réalité de ces protéines virales doit être démontrée expérimentalement afin d'étudier leurs fonctions, de mieux décrire ce virus et sa position taxonomique ainsi que d'améliorer les outils de diagnostic. Dans ce but, différentes approches expérimentales ont été utilisées. Une comparaison des protéomes d'hémolymphe d'abeilles non-infectées et infectées par le CBPV a été effectuée. Les protéines différentiellement exprimées ont été identifiées par empreinte peptidique massique (peptide mass fingerprint, PMF). Cette étude a permis d'identifier des protéines de l'abeille dont certaines contribueraient à une réponse immunitaire antivirale, mais aucune protéine virale n'a été identifiée par cette approche. Les ARN extraits du CBPV ont été utilisés dans des expériences de traduction in vitro. Malgré plusieurs essais réalisés en faisant varier les conditions expérimentales, cette approche s'est révélée infructueuse. / Chronic bee paralysis virus (CBPV) is the etiological agent that causes an infectious and contagious disease in adult bees (Apis mellifera L.), called chronic paralysis. CBPV is a positive single-stranded fragmented RNA virus which contains 2 major viral RNA fragments. RNA 1 (3674 nt) and RNA 2 (2305 nt) encode 3 and 4 putative open reading frames (ORFs), respectively. The amino acid sequence of ORF 3 on RNA 1 shares similarities with the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of virus families Nodaviridae and Tombusviridae. By analogy with these viral families, it has been suggested that RNA 1 encodes non-structural proteins and RNA 2 encodes structural proteins. However, the reality of viral proteins needs to be experimentally demonstrated in order to study theirs functions, to describe CBPV biology and its taxonomic position and to improve diagnostic tools. With this aim, different experimental strategies have been used.A comparison of hemolymph proteomes between uninfected bees and bees infected with CBPV was performed. Differentially expressed proteins have been identified using peptide mass fingerprint method (PMF). This study allowed only identifying proteins of bees which could contribute to an antiviral immune response but viral proteins were not identified using this approach. Extracted CBPV RNAs were used for in vitro translation experiments. Despite several assays in varying experimental conditions, this approach has been unsuccessful. Another approach was to generate antibodies directed against different proteins or parts of viral proteins.

4 Summary Altogether, the six most common bee viruses which infect the honey bee (Apis mellifera) were monitored in the territory of the Czech Republic between 2006 and 2009. Parallel infections of viruses (DWV, ABPV and BQCV) in bee adults and parallel co- infection of viruses with fungal diseases caused by Nosema apis and Nosema ceranae were confirmed by PCR tests. A new sensitive method of detection of the originator of the American foulbrood (Paenibacillus larvae) from bee debris was developed for the practical use of detection of AFB disease in bee populations. Various approaches for the extraction of spores from bee debris and lyses of spores were compared. The sensitivity of PCR tests for the presence of Paenibacillus larvae in debris was compared with the classic cultivation method. The PCR method for the detection American foulbrood was further studied and developed to be more efficient. A new method, based on a matrix-like sample re-arrangement and a use of pooled samples, has been developed for testing 1000 samples in 35 PCR reactions. Another goal was to develop a robust and fast screening method for American foulbrood based on the cultivation test using paper sheets RIDA®COUNT with a specific cultivation medium, specific selection conditions for Paenibacillus larvae and chromogen visualization...