Hepatitis C virus (HCV) is a serious global health problem with an estimate of 170 million carriers worldwide. Most individuals exposed to this blood-borne pathogen develop chronic infection, which may result in severe liver complications as well as end-stage liver diseases including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Current treatment options are suboptimal with no effective vaccines available to date. Development of a readily accessible mouse model that is permissive to natural HCV infection is important to facilitate drug and vaccine discovery, and also to better understand the viral pathogenesis. The inherent difficulty is that HCV displays very limited tropism, infecting only livers from humans or chimpanzees. An attempt was made to elucidate the key determinants in rendering the murine intracellular environment permissive to HCV replication. The results revealed that deletion of the interferon regulatory factor-3 and overexpression of microRNA-122 can independently enhance viral subgenomic replication in murine fibroblasts, with microRNA-122 being the stronger determinant. Interestingly, the phenotype established by these genetic manipulations was insufficient to support full-length HCV genome replication. Murine hepatic cell lines, with or without microRNA-122 expression, were also non-permissive to genomic HCV replication, despite the fact that translation of viral RNA was observed. These results suggest that additional host-specific factor(s) are required to support replication of full-length HCV RNA. These studies provide insight on the essential factors capable of influencing permissiveness of rodent cells to HCV replication, and also suggest genetic modifications to be considered when modeling the complete viral life cycle in a rodent animal model.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第22595号 / 生博第428号 / 新制||生||57(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 藤田 尚志, 教授 松田 道行, 教授 杉田 昌彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

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Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche / Durant ces quatre dernières années, le champ de recherche concernant l’immunité innée a grandement été influencé par la découverte des IKK-related kinases, TBK1 et IKKi, deux kinases régulant l’activité des facteurs de transcription IRF-3/IRF-7 et NF-κB. Les kinases TBK1 and IKKi furent notamment démontrées comme étant responsables de la phosphorylation en C-terminal de IRF-3. Toutefois, l’identité des sites phosphoaccepteurs ciblés par ces kinases restait un sujet de controverse. En combinant la spectrométrie de masse aux essais de phosphorylation in vitro de His-IRF-3 par la kinase recombinante TBK1, nous démontrons que les sérines 396 et 402 sont directement phosphorylées par cette kinase. Nos analyses biochimiques révèlent également que la mutation S396A, localisée dans le cluster II, abolit l’homodimérisation, l’association à CBP et l’accumulation nucléaire de IRF-3. De façon intéressante, la mutation de la sérine 339, impliquée dans la stabilité de IRF-3, provoque également une perte d’association à CBP et de la dimérisation du facteur de transcription sans toutefois affecter la transactivation des gènes antiviraux en autant que la sérine 396 soit disponible pour accepter un événement de phosphorylation. Nos expériences de complémentation de MEFs IRF-3 KO révèlent la présence d’un mécanisme compensatoire impliquant la sérine 339 et la sérine 396 dans l’induction des IFN-stimulated genes (ISGs), ISG56 and ISG54. Globalement, les données présentées dans cette étude nous ont permis de reconsidérer le modèle d’activation du facteur de transcription IRF-3 actuellement proposé et d’y ajouter certaines subtilités. TRAF3 est également un médiateur central impliqué dans l’induction de la réponse interféron de type I. Cette fois, en couplant la spectrométrie de masse à la technique de purification protéique par affinité, nous avons identifié Sec16A et p115, deux protéines du système de transport vésiculaire ER-Golgi , comme étant des nouveaux partenaires protéiques de Flag-TRAF3. Nos expériences démontrent la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau du système de transport vésiculaire. De plus, la diminution des niveaux d’expression de p115 ou Sec16A provoque une redistribution cellulaire de TRAF3 et affecte la réponse interféron suivant une stimulation par de l’ARN double brin. Nos résultats démontrent également une colocalisation de TRAF3 et TRADD au niveau du cis-Golgi ainsi qu’une interaction avec la protéine du translocon Sec61β médiée par l’intermédiaire de Sec5. De façon générale, nos données suggèrent que la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau des compartiments de transport vésiculaire est requise afin d’obtenir une réponse antiviral optimale par la voie de signalisation cellulaire associée aux RIG-I-like RNA helicases, RIG-I et MDA5. Nos données appuient également le rôle potentiel précédemment suggéré de l’exocyste dans l’établissement d’une réponse antivirale. / Over the past four years, the field of the innate immune response has been highly influenced by the discovery of the IκB kinase (IKK)-related kinases, TBK1 and IKKi, which regulate the activity of IRF-3/IRF-7 and NF-κB transcription factors. The IKK-related kinases, TBK1 and IKKi, were recently shown to be responsible for the C-terminal phosphorylation of IRF-3. However, the identity of the phosphoacceptor site(s) targeted by these two kinases remains unclear. By combining mass spectrometry analysis to in vitro kinase assays using full length His-IRF3 as a substrate, we have demonstrated that serine 402 and serine 396 were directly targeted by TBK1. Analysis of Ser/Thr to Ala mutants revealed that S396A mutation, located in cluster II, abolished IRF-3 homodimerization, CBP association and nuclear accumulation. Interestingly, mutation of serine 339, which is involved in IRF-3 stability, also abrogated CBP association and dimerization without affecting gene transactivation as long as serine 396 remained available for phosphorylation. Complementation of MEFs IRF-3 KO also reveals a compensatory mechanism of serine 339 and serine 396 in the ability of IRF-3 to induce IFN-stimulated genes (ISGs) ISG56 and ISG54 expression. These data lead us to reconsider the current model of IRF-3 activation. TRAF3 is also a central mediator that is important for inducing type I interferon production in response to intracellular double-stranded RNA. By combining Flag-Affinity purification using Flag-TRAF3 as a bait to mass spectrometry, we have identified Sec16A and p115, two proteins of the ER-to-Golgi vesicular transport system, as novel TRAF3 interactors. We found that TRAF3 localizes to the ER-to-Golgi vesicular pathway and behaves like a cis-Golgi protein. Depletion of p115 or Sec16A disrupts the cis-Golgi cellular localization of TRAF3 and affects type I Interferon response following double-stranded RNA treatment. Furthermore, we demonstrate that TRAF3 colocalizes with TRADD at the cis-Golgi and also interacts with the translocon protein Sec61β in a Sec5 dependent manner. Together, our data suggest that the cellular localization of TRAF3 to the ER-to-Golgi transport compartments is required for an optimal RIG-I-like Helicases (RLH)-Cardif-dependent antiviral immune response. Our findings also highlight the potential role of the exocyst in the innate immune response.

Durant ces quatre dernières années, le champ de recherche concernant l’immunité innée a grandement été influencé par la découverte des IKK-related kinases, TBK1 et IKKi, deux kinases régulant l’activité des facteurs de transcription IRF-3/IRF-7 et NF-κB. Les kinases TBK1 and IKKi furent notamment démontrées comme étant responsables de la phosphorylation en C-terminal de IRF-3. Toutefois, l’identité des sites phosphoaccepteurs ciblés par ces kinases restait un sujet de controverse. En combinant la spectrométrie de masse aux essais de phosphorylation in vitro de His-IRF-3 par la kinase recombinante TBK1, nous démontrons que les sérines 396 et 402 sont directement phosphorylées par cette kinase. Nos analyses biochimiques révèlent également que la mutation S396A, localisée dans le cluster II, abolit l’homodimérisation, l’association à CBP et l’accumulation nucléaire de IRF-3. De façon intéressante, la mutation de la sérine 339, impliquée dans la stabilité de IRF-3, provoque également une perte d’association à CBP et de la dimérisation du facteur de transcription sans toutefois affecter la transactivation des gènes antiviraux en autant que la sérine 396 soit disponible pour accepter un événement de phosphorylation. Nos expériences de complémentation de MEFs IRF-3 KO révèlent la présence d’un mécanisme compensatoire impliquant la sérine 339 et la sérine 396 dans l’induction des IFN-stimulated genes (ISGs), ISG56 and ISG54. Globalement, les données présentées dans cette étude nous ont permis de reconsidérer le modèle d’activation du facteur de transcription IRF-3 actuellement proposé et d’y ajouter certaines subtilités. TRAF3 est également un médiateur central impliqué dans l’induction de la réponse interféron de type I. Cette fois, en couplant la spectrométrie de masse à la technique de purification protéique par affinité, nous avons identifié Sec16A et p115, deux protéines du système de transport vésiculaire ER-Golgi , comme étant des nouveaux partenaires protéiques de Flag-TRAF3. Nos expériences démontrent la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau du système de transport vésiculaire. De plus, la diminution des niveaux d’expression de p115 ou Sec16A provoque une redistribution cellulaire de TRAF3 et affecte la réponse interféron suivant une stimulation par de l’ARN double brin. Nos résultats démontrent également une colocalisation de TRAF3 et TRADD au niveau du cis-Golgi ainsi qu’une interaction avec la protéine du translocon Sec61β médiée par l’intermédiaire de Sec5. De façon générale, nos données suggèrent que la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau des compartiments de transport vésiculaire est requise afin d’obtenir une réponse antiviral optimale par la voie de signalisation cellulaire associée aux RIG-I-like RNA helicases, RIG-I et MDA5. Nos données appuient également le rôle potentiel précédemment suggéré de l’exocyste dans l’établissement d’une réponse antivirale. / Over the past four years, the field of the innate immune response has been highly influenced by the discovery of the IκB kinase (IKK)-related kinases, TBK1 and IKKi, which regulate the activity of IRF-3/IRF-7 and NF-κB transcription factors. The IKK-related kinases, TBK1 and IKKi, were recently shown to be responsible for the C-terminal phosphorylation of IRF-3. However, the identity of the phosphoacceptor site(s) targeted by these two kinases remains unclear. By combining mass spectrometry analysis to in vitro kinase assays using full length His-IRF3 as a substrate, we have demonstrated that serine 402 and serine 396 were directly targeted by TBK1. Analysis of Ser/Thr to Ala mutants revealed that S396A mutation, located in cluster II, abolished IRF-3 homodimerization, CBP association and nuclear accumulation. Interestingly, mutation of serine 339, which is involved in IRF-3 stability, also abrogated CBP association and dimerization without affecting gene transactivation as long as serine 396 remained available for phosphorylation. Complementation of MEFs IRF-3 KO also reveals a compensatory mechanism of serine 339 and serine 396 in the ability of IRF-3 to induce IFN-stimulated genes (ISGs) ISG56 and ISG54 expression. These data lead us to reconsider the current model of IRF-3 activation. TRAF3 is also a central mediator that is important for inducing type I interferon production in response to intracellular double-stranded RNA. By combining Flag-Affinity purification using Flag-TRAF3 as a bait to mass spectrometry, we have identified Sec16A and p115, two proteins of the ER-to-Golgi vesicular transport system, as novel TRAF3 interactors. We found that TRAF3 localizes to the ER-to-Golgi vesicular pathway and behaves like a cis-Golgi protein. Depletion of p115 or Sec16A disrupts the cis-Golgi cellular localization of TRAF3 and affects type I Interferon response following double-stranded RNA treatment. Furthermore, we demonstrate that TRAF3 colocalizes with TRADD at the cis-Golgi and also interacts with the translocon protein Sec61β in a Sec5 dependent manner. Together, our data suggest that the cellular localization of TRAF3 to the ER-to-Golgi transport compartments is required for an optimal RIG-I-like Helicases (RLH)-Cardif-dependent antiviral immune response. Our findings also highlight the potential role of the exocyst in the innate immune response. / Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche

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BACKGROUND: The type I interferon (IFN) response is a critical component of the innate immune response to infection by RNA viruses and is initiated via recognition of viral nucleic acids by RIG-like receptors (RLR). Engagement of these receptors in the cytoplasm initiates a signal transduction pathway leading to activation of the transcription factors NF-κB, ATF-2 and IRF-3 that coordinately upregulate transcription of type I IFN genes, such as that encoding IFN-β. In this study the impact of poliovirus infection on the type I interferon response has been examined. METHODS: The type I IFN response was assessed by measuring IFN-β mRNA levels using qRT-PCR and normalizing to levels of β-actin mRNA. The status of host factors involved in activation of the type I IFN response was examined by immunoblot, immunofluorescence microcopy and qRT-PCR. RESULTS: The results show that poliovirus infection results in induction of very low levels of IFN-β mRNA despite clear activation of NF-κB and ATF-2. In contrast, analysis of IRF-3 revealed no transcriptional induction of an IRF-3-responsive promoter or homodimerization of IRF-3 indicating it is not activated in poliovirus-infected cells. Exposure of poliovirus-infected cells to poly(I:C) results in lower levels of IFN-β mRNA synthesis and IRF-3 activation compared to mock-infected cells. Analysis of MDA-5 and IPS-1 revealed that these components of the RLR pathway were largely intact at times when the type I IFN response was suppressed. CONCLUSIONS: Collectively, these results demonstrate that poliovirus infection actively suppresses the host type I interferon response by blocking activation of IRF-3 and suggests that this is not mediated by cleavage of MDA-5 or IPS-1.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24119号 / 生博第481号 / 新制||生||64(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 野田 岳志, 教授 鈴木 淳, 教授 高田 穣 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Das Tribec-Virus wird zur Gattung der Orbiviren gezählt und wurde erstmals 1963 aus Blutproben aus dem Tribec-Gebirge in der Slowakei isoliert. Mittlerweile ist das Virus auch in vielen anderen Ländern Europas nachgewiesen worden. Wie für die Orbiviren typisch, besteht sein Erbgut aus insgesamt zehn Segmenten Doppelstrang-RNA. 2010 konnte das Genom des Tribec-Virus vollständig sequenziert werden. Das Virus wird meist über Zecken übertragen und steht in Verdacht, bei Säugetieren eine Entzündung des ZNS hervorrufen zu können. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es im Rahmen einer Infektion mit dem Tribec-Virus zu einer verminderten Induktion von Interferon-β in der infizier-ten Wirtszelle kommt. Dies ist auch dann der Fall, wenn gleichzeitig eine Infektion mit einem Interferon-induzierenden Virus vorliegt, was auf eine aktive Hemmung der ange-borenen Immunantwort durch das Tribec-Virus schließen lässt. Neben einer geringeren Aktivierung der Transkription des Interferon-β-Gens konnte in Zellkultur auch gezeigt werden, dass die Menge an freigesetzten Interferon-β nach einer Tribec-Virus-Infektion vergleichsweise gering ist. Als Folge dieser Unterdrückung der angeborenen Immunan-twort trägt es bei Typ-I Interferon-kompetenten Zellpopulationen nach Infektion mit Tribec-Virus zur Induktion eines zytopathischen Effekts bei der besonders stark ausfällt, wenn gleichzeitig mit dem Kontrollvirus RVFV-Clone-13 infiziert wird. RVFV-Clone-13 löst selbst nur einen sehr limitierten zytopathischen Effekt aus. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass bei mit Tribec-Virus infizierten Zellen die Translokation von IRF-3 aus dem Zellzytoplasma in den Zellkern unterbleibt, die einen notwendigen Schritt zur Aktivierung des Interferon-β-Promotors darstellt. Die Hemmung der IRF-3-Transloka-tion konnte auch über die verminderte Induktion von ISG56 nachgewiesen werden. Dies war auch für Zellen möglich, die sowohl mit Tribec-Virus als auch mit RVFV-Clone-13 infiziert worden waren, was den Rückschluss zulässt, dass es auch in diesen Zellen nicht zu einer Translokation von IRF-3 kommt. Von den 10 Segmenten des Erbguts des Tribec-Virus wurden in dieser Arbeit die Segmente 6 und 8 daraufhin untersucht, ob ihre Expression Einfluss auf die Interferoninduktion hat. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass keines der beiden Segmente für ein Protein kodiert, welches die Interferonantwort hemmen würde.