Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche / Durant ces quatre dernières années, le champ de recherche concernant l’immunité innée a grandement été influencé par la découverte des IKK-related kinases, TBK1 et IKKi, deux kinases régulant l’activité des facteurs de transcription IRF-3/IRF-7 et NF-κB. Les kinases TBK1 and IKKi furent notamment démontrées comme étant responsables de la phosphorylation en C-terminal de IRF-3. Toutefois, l’identité des sites phosphoaccepteurs ciblés par ces kinases restait un sujet de controverse. En combinant la spectrométrie de masse aux essais de phosphorylation in vitro de His-IRF-3 par la kinase recombinante TBK1, nous démontrons que les sérines 396 et 402 sont directement phosphorylées par cette kinase. Nos analyses biochimiques révèlent également que la mutation S396A, localisée dans le cluster II, abolit l’homodimérisation, l’association à CBP et l’accumulation nucléaire de IRF-3. De façon intéressante, la mutation de la sérine 339, impliquée dans la stabilité de IRF-3, provoque également une perte d’association à CBP et de la dimérisation du facteur de transcription sans toutefois affecter la transactivation des gènes antiviraux en autant que la sérine 396 soit disponible pour accepter un événement de phosphorylation. Nos expériences de complémentation de MEFs IRF-3 KO révèlent la présence d’un mécanisme compensatoire impliquant la sérine 339 et la sérine 396 dans l’induction des IFN-stimulated genes (ISGs), ISG56 and ISG54. Globalement, les données présentées dans cette étude nous ont permis de reconsidérer le modèle d’activation du facteur de transcription IRF-3 actuellement proposé et d’y ajouter certaines subtilités. TRAF3 est également un médiateur central impliqué dans l’induction de la réponse interféron de type I. Cette fois, en couplant la spectrométrie de masse à la technique de purification protéique par affinité, nous avons identifié Sec16A et p115, deux protéines du système de transport vésiculaire ER-Golgi , comme étant des nouveaux partenaires protéiques de Flag-TRAF3. Nos expériences démontrent la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau du système de transport vésiculaire. De plus, la diminution des niveaux d’expression de p115 ou Sec16A provoque une redistribution cellulaire de TRAF3 et affecte la réponse interféron suivant une stimulation par de l’ARN double brin. Nos résultats démontrent également une colocalisation de TRAF3 et TRADD au niveau du cis-Golgi ainsi qu’une interaction avec la protéine du translocon Sec61β médiée par l’intermédiaire de Sec5. De façon générale, nos données suggèrent que la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau des compartiments de transport vésiculaire est requise afin d’obtenir une réponse antiviral optimale par la voie de signalisation cellulaire associée aux RIG-I-like RNA helicases, RIG-I et MDA5. Nos données appuient également le rôle potentiel précédemment suggéré de l’exocyste dans l’établissement d’une réponse antivirale. / Over the past four years, the field of the innate immune response has been highly influenced by the discovery of the IκB kinase (IKK)-related kinases, TBK1 and IKKi, which regulate the activity of IRF-3/IRF-7 and NF-κB transcription factors. The IKK-related kinases, TBK1 and IKKi, were recently shown to be responsible for the C-terminal phosphorylation of IRF-3. However, the identity of the phosphoacceptor site(s) targeted by these two kinases remains unclear. By combining mass spectrometry analysis to in vitro kinase assays using full length His-IRF3 as a substrate, we have demonstrated that serine 402 and serine 396 were directly targeted by TBK1. Analysis of Ser/Thr to Ala mutants revealed that S396A mutation, located in cluster II, abolished IRF-3 homodimerization, CBP association and nuclear accumulation. Interestingly, mutation of serine 339, which is involved in IRF-3 stability, also abrogated CBP association and dimerization without affecting gene transactivation as long as serine 396 remained available for phosphorylation. Complementation of MEFs IRF-3 KO also reveals a compensatory mechanism of serine 339 and serine 396 in the ability of IRF-3 to induce IFN-stimulated genes (ISGs) ISG56 and ISG54 expression. These data lead us to reconsider the current model of IRF-3 activation. TRAF3 is also a central mediator that is important for inducing type I interferon production in response to intracellular double-stranded RNA. By combining Flag-Affinity purification using Flag-TRAF3 as a bait to mass spectrometry, we have identified Sec16A and p115, two proteins of the ER-to-Golgi vesicular transport system, as novel TRAF3 interactors. We found that TRAF3 localizes to the ER-to-Golgi vesicular pathway and behaves like a cis-Golgi protein. Depletion of p115 or Sec16A disrupts the cis-Golgi cellular localization of TRAF3 and affects type I Interferon response following double-stranded RNA treatment. Furthermore, we demonstrate that TRAF3 colocalizes with TRADD at the cis-Golgi and also interacts with the translocon protein Sec61β in a Sec5 dependent manner. Together, our data suggest that the cellular localization of TRAF3 to the ER-to-Golgi transport compartments is required for an optimal RIG-I-like Helicases (RLH)-Cardif-dependent antiviral immune response. Our findings also highlight the potential role of the exocyst in the innate immune response.

Durant ces quatre dernières années, le champ de recherche concernant l’immunité innée a grandement été influencé par la découverte des IKK-related kinases, TBK1 et IKKi, deux kinases régulant l’activité des facteurs de transcription IRF-3/IRF-7 et NF-κB. Les kinases TBK1 and IKKi furent notamment démontrées comme étant responsables de la phosphorylation en C-terminal de IRF-3. Toutefois, l’identité des sites phosphoaccepteurs ciblés par ces kinases restait un sujet de controverse. En combinant la spectrométrie de masse aux essais de phosphorylation in vitro de His-IRF-3 par la kinase recombinante TBK1, nous démontrons que les sérines 396 et 402 sont directement phosphorylées par cette kinase. Nos analyses biochimiques révèlent également que la mutation S396A, localisée dans le cluster II, abolit l’homodimérisation, l’association à CBP et l’accumulation nucléaire de IRF-3. De façon intéressante, la mutation de la sérine 339, impliquée dans la stabilité de IRF-3, provoque également une perte d’association à CBP et de la dimérisation du facteur de transcription sans toutefois affecter la transactivation des gènes antiviraux en autant que la sérine 396 soit disponible pour accepter un événement de phosphorylation. Nos expériences de complémentation de MEFs IRF-3 KO révèlent la présence d’un mécanisme compensatoire impliquant la sérine 339 et la sérine 396 dans l’induction des IFN-stimulated genes (ISGs), ISG56 and ISG54. Globalement, les données présentées dans cette étude nous ont permis de reconsidérer le modèle d’activation du facteur de transcription IRF-3 actuellement proposé et d’y ajouter certaines subtilités. TRAF3 est également un médiateur central impliqué dans l’induction de la réponse interféron de type I. Cette fois, en couplant la spectrométrie de masse à la technique de purification protéique par affinité, nous avons identifié Sec16A et p115, deux protéines du système de transport vésiculaire ER-Golgi , comme étant des nouveaux partenaires protéiques de Flag-TRAF3. Nos expériences démontrent la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau du système de transport vésiculaire. De plus, la diminution des niveaux d’expression de p115 ou Sec16A provoque une redistribution cellulaire de TRAF3 et affecte la réponse interféron suivant une stimulation par de l’ARN double brin. Nos résultats démontrent également une colocalisation de TRAF3 et TRADD au niveau du cis-Golgi ainsi qu’une interaction avec la protéine du translocon Sec61β médiée par l’intermédiaire de Sec5. De façon générale, nos données suggèrent que la localisation cellulaire de TRAF3 au niveau des compartiments de transport vésiculaire est requise afin d’obtenir une réponse antiviral optimale par la voie de signalisation cellulaire associée aux RIG-I-like RNA helicases, RIG-I et MDA5. Nos données appuient également le rôle potentiel précédemment suggéré de l’exocyste dans l’établissement d’une réponse antivirale. / Over the past four years, the field of the innate immune response has been highly influenced by the discovery of the IκB kinase (IKK)-related kinases, TBK1 and IKKi, which regulate the activity of IRF-3/IRF-7 and NF-κB transcription factors. The IKK-related kinases, TBK1 and IKKi, were recently shown to be responsible for the C-terminal phosphorylation of IRF-3. However, the identity of the phosphoacceptor site(s) targeted by these two kinases remains unclear. By combining mass spectrometry analysis to in vitro kinase assays using full length His-IRF3 as a substrate, we have demonstrated that serine 402 and serine 396 were directly targeted by TBK1. Analysis of Ser/Thr to Ala mutants revealed that S396A mutation, located in cluster II, abolished IRF-3 homodimerization, CBP association and nuclear accumulation. Interestingly, mutation of serine 339, which is involved in IRF-3 stability, also abrogated CBP association and dimerization without affecting gene transactivation as long as serine 396 remained available for phosphorylation. Complementation of MEFs IRF-3 KO also reveals a compensatory mechanism of serine 339 and serine 396 in the ability of IRF-3 to induce IFN-stimulated genes (ISGs) ISG56 and ISG54 expression. These data lead us to reconsider the current model of IRF-3 activation. TRAF3 is also a central mediator that is important for inducing type I interferon production in response to intracellular double-stranded RNA. By combining Flag-Affinity purification using Flag-TRAF3 as a bait to mass spectrometry, we have identified Sec16A and p115, two proteins of the ER-to-Golgi vesicular transport system, as novel TRAF3 interactors. We found that TRAF3 localizes to the ER-to-Golgi vesicular pathway and behaves like a cis-Golgi protein. Depletion of p115 or Sec16A disrupts the cis-Golgi cellular localization of TRAF3 and affects type I Interferon response following double-stranded RNA treatment. Furthermore, we demonstrate that TRAF3 colocalizes with TRADD at the cis-Golgi and also interacts with the translocon protein Sec61β in a Sec5 dependent manner. Together, our data suggest that the cellular localization of TRAF3 to the ER-to-Golgi transport compartments is required for an optimal RIG-I-like Helicases (RLH)-Cardif-dependent antiviral immune response. Our findings also highlight the potential role of the exocyst in the innate immune response. / Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche

Chez les insectes, la voie des petits ARNs interférants (siARN) joue un rôle majeur dans la réponse antivirale. Ces dernières années, il a été montré que les petits ARNs interagissant avec les protéines PIWI (piARNs) sont impliqués dans la défense des moustiques face aux infections arbovirales. Le but de mon travail de thèse fut de caractériser l'implication de la voie des piARNs dans la réponse antivirale de la Drosophila melanogaster, utilisée ici comme un organisme modèle. Dans un premier temps, j’ai demontré qu’à la suite d’une infection virale, la survie et le titre viral chez les drosophiles mutées pour les protéines Piwi, Aubergine, Argonaute-3 et Zucchini, ne présente aucune différence avec les données observées pour les drosophiles sauvages. Ensuite, via l’utilisation de virus provoquant une infection aigue, persistante ou se transmettant de manière verticale par les cellules germinales, j’ai montré l’absence de production de piARNs viraux durant l’infection chez les drosophiles adultes. Finalement, l’utilisation de mes données de séquencage m’a permis d’observer la production de piARNs dérivant d’un gène codant une protéine impliquée dans la réponse antivirale. Suggérant ainsi un rôle hypothétique des piARNs dans la régulation de l’immunité de l’hôte durant l’infection virale.Mes travaux visent à améliorer la compréhension de la réponse immunitaire antivirale chez l’insecte. Je montre que la fonction antivirale de la voie des piARN dépend plus de la biologie de l’hôte et du virus que de la réponse antivirale en elle-même. / In insects, the small interfering RNA (siRNA) pathway is the major antiviral response. In recent years, the piwi-interacting RNA (piRNA) pathway has been also implicated in antiviral defense in mosquitoes infected with arboviruses. The aim of my thesis was to characterize the involvement of the piRNA pathway in antiviral defense in Drosophila melanogaster. I first showed that following virus infection, the survival and viral titers of Piwi, Aubergine, Argonaute-3, and Zucchini mutant flies were similar to those of wild type flies. Then, by studying an array of viruses that infect the fruit fly acutely or persistently or are vertically transmitted through the germ line, I showed that no viral piRNAs are produced during infection in adult Drosophila melanogaster. Finally, using the next generation sequencing data generated during viral infections, I showed the presence of piRNAs derived from protein coding gene and suggested their potential role in regulating the immune status of the host during viral infection.This work improves the current understanding of the antiviral response in insects. It shows that, in contrast to what was observed in mosquitoes, the piRNA pathway is not directly implicated in antiviral defence in adult Drosphila melanogaster and that viral piRNAs production depends on the biology of the host–virus combination rather than being part of a general antiviral process.

Les interférons (IFN) constituent une famille de cytokines aux propriétés antiprolifératives et antivirales. Ils activent, via la voie Jak/STAT, des gènes spécifiques dont les produits sont les médiateurs des effets biologiques des IFN. C’est le cas de PML (Promyelocytic leukemia), appelée aussi TRIM19, qui joue un rôle central dans la défense antivirale. PML appartenant à la famille des protéines Tripartite Motif (TRIM), caractérisée par la présence en N-terminal d’un motif RBCC, constitué d’un domaine RING, d’une ou de deux boites B et d’un domaine coiled-coil. PML a été identifiée dans la leucémie aiguë promyélocytaire, une pathologie causée par la translocation chromosomique t(15 ;17) qui fusionne les gènes PML et RARA, aboutissant à la synthèse d'une protéine chimère PML-RARA. Le trioxyde d'arsenic (As2O3) cible la portion PML de la protéine oncogénique, entraînant sa dégradation et la rémission complète des patients. Dans les cellules saines, les transcrits PML issus d’un gène unique génèrent par épissage alternatif 7 isoformes principales de PML, dont six sont nucléaires (PMLI à PMLVI) et une cytoplasmique (PMLVIIb). Toutes possèdent la même extrémité N-terminale mais diffèrent au niveau de leur extrémité C-terminale, conférant à chaque isoforme des fonctions spécifiques.PML est l’organisatrice d’une structure multi-protéique appelée corps nucléaires (CN), impliquée dans divers processus cellulaires tels que l’apoptose, la dégradation des protéines ou encore la défense antivirale.PML est modifiée par SUMO de façon covalente au niveau de trois sites lysines (K65, K160, K490) et de façon non covalente, via son domaine SIM (pour « SUMO Interacting Motif »). Ces modifications sont requises pour la formation de CN fonctionnels et le recrutement de protéines partenaires au sein de ceux-ci. Le but de ma thèse a été d’étudier le rôle différentiel des différentes isoformes de PML en réponse à l’As2O3 et suite à l’infection virale. Nous avons montré que le SIM de PML est nécessaire à sa dégradation en réponse à l'As2O3. Ce motif est présent dans toutes les isoformes de PML, hormis l’isoforme nucléaire PMLVI et l’isoforme cytoplasmique PMLVIIb. Le SIM de PML n’est pas requis pour sa SUMOylation et son interaction avec RNF4 (une E3 ubiquitine ligase responsable de la dégradation de PML via le protéasome). En revanche, ce motif est requis pour l’ubiquitination de PML, le recrutement des composants du protéasome et sa dégradation en réponse à l’As2O3. Concernant les propriétés antivirales de PML, l’étude que nous avons menée avec toutes les isoformes de PML a permis de montrer que seules PMLIII et PMLIV confèrent une résistance au Virus de la Stomatite Vésiculaire (VSV). L’effet antiviral de PMLIII n'est observé qu'à faible multiplicité d’infection (MOI) et est indépendant de la production d’IFN. Par contre, PMLIV exerce une puissante activité anti-VSV, y compris à forte MOI et s'exerce selon deux mécanismes distincts : (i) PMLIV inhibe la réplication du VSV par un mécanisme précoce indépendant de l’IFN, (ii) PMLIV augmente tardivement la production d’IFN-β via une plus forte activation d’IRF3 qui est due à la séquestration spécifique de Pin1 au sein des CN par PMLIV. Ces deux processus nécessitent la SUMOylation de PMLIV. Ces résultats montrent que PMLIV exerce une activité antivirale intrinsèque et est impliquée dans l’immunité innée en régulant positivement la voie de transduction conduisant à la synthèse d’IFN-β. / Interferons (IFNs) are a family of cytokines with antiproliferative and antiviral properties.They activate, via the Jak/Stat pathway, specific genes whose products are the mediators of the biological effects of IFNs. This is the case of PML (Promyelocytic leukemia), also known as TRIM19, which plays a central role in antiviral defense.PML belongs to the Tripartite Motif (TRIM) protein family, characterized by the presence of an N- terminal RBCC pattern, consisting of a RING domain, one or two B-boxes and a coiled-coil domain. PML was identified in acute promyelocytic leukemia, a disease caused by the chromosomal translocation t(15 ;17), which fuses the PML and RARA genes, leading to the synthesis of a chimeric protein PML-RARA . Arsenic trioxide (As2O3) targets the PML moiety of the oncogenic protein, resulting in its degradation and in the complete remission of patients.In healthy cells, PML transcripts derived from a single gene generate seven major isoforms of PML by alternative splicing, including six nuclear (PMLI to PMLVI) and one cytoplasmic (PMLVIIb). All share the same N-terminus but differ at their C-terminus, giving each isoform specific functions.PML is the organizer of a multi-protein structure called nuclear bodies (NBs) that are involved in various cellular processes such as apoptosis, protein degradation or antiviral defense.PML is covalently modified by SUMO at three lysine residues (K65, K160, K490) but also non-covalently via its SIM domain (for « SUMO Interacting Motif »). These modifications are required for the formation of functional NBs and the recruitment of partner proteins within them.The aim of my thesis was to study the differential role of the different PML isoforms in response to As2O3 and during viral infection.We have shown that the SIM PML SIM is necessary for its degradation in response to As2O3. This motif is present in all PML isoforms, except the nuclear PMLVI and the cytoplasmic PMLVIIb isoforms. The SIM of PML is not required for its SUMOylation and its interaction with RNF4 (the E3 ubiquitin ligase responsible for PML proteasome-dependent degradation). However, this motif is required for the ubiquitination of PML, the recruitment of proteasome components and the degradation of PML in response to As2O3.Concerning the antiviral properties of PML, the study that we conducted with all PML isoforms allowed us to show that only PMLIII and PMLIV confer resistance to Vesicular Stomatitis Virus (VSV). Whereas the antiviral activity of PMLIII is only observed at low multiplicity of infection (MOI) and is independent of IFN production, PMLIV has a potent anti-VSV activity, including at high MOI, which is mediated through two distinct mechanisms: (i) PMLIV inhibits the replication of VSV by an early and IFN-independent mechanism, (ii) PMLIV later increases the production of IFN-β via a stronger activation of IRF3, which is due to the specific sequestration of Pin1 by PMLIV within NBs. Both processes require the PMLIV SUMOylation. These results show that PMLIV has an intrinsic antiviral activity and is also involved in innate immunity by positively regulating the transduction pathway leading to IFN-β synthesis.