Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 93-107 [148 réf.].

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / La consommation de (poly)phénols est fréquemment associée à une réduction du risque de développer des maladies chroniques sociétales. Cependant, les variations du microbiote intestinal peuvent affecter les métabolites phénoliques bioactifs produits à partir de ces composés, ce qui impacte leur potentiel bénéfique. À cet égard, les bactéries probiotiques capables de métaboliser les (poly)phénols représentent une stratégie potentielle. C'est le cas de Lactiplantibacillus plantarum, une bactérie à potentiel probiotique qui possède un large éventail d'enzymes catalysant les (poly)phénols. Néanmoins, certaines de ces activités enzymatiques sont spécifiques à certaines souches et il existe peu d'information sur celles-ci. Cette thèse vise à identifier les souches de L. plantarum capables de métaboliser différents types de (poly)phénols, y compris les gallotanins, ellagitanins et flavan-3-ols, tout en approfondissant notre compréhension de leurs profils métaboliques et génomiques. Dans un premier volet, l'étude s'est focalisée sur le potentiel de L. plantarum dans la conversion des gallotanins. Afin de faciliter la détection de souches possédant cette capacité métabolique, nous avons développé une méthode spectrophotométrique pour mesurer la tannase extracellulaire (TanA), l'enzyme responsable de cette biotransformation. Parmi 115 isolats de L. plantarum évaluées, six ont montré une production de TanA (TanA+) (PROBI S126, PROBI S204, RKG 1-473, RKG 1-500, RKG 2-219, et RKG 2-690). Lorsque ces souches ont été cultivées avec de l'acide tannique (un gallotanin), elles ont libéré une quantité significativement supérieure d'acide gallique par rapport à une souche de référence qui ne possède pas cette activité (WCFS1). Après le séquençage des souches TanA+ (WGS) et l'analyse de leurs attributs génomiques, il s'est révélé qu'elles présentent une grande similarité entre elles, notamment en ce qui concerne leurs gènes associés à leur biosécurité, ainsi que ceux associés à leur potentiel probiotique et technologique, comme les gènes codant pour les bactériocines. Le deuxième volet a exploré le potentiel métabolique de cette espèce bactérienne face à la grande diversité des ellagitanins présents dans le fruit du camu-camu (Myrciaria dubia). En plus des souches L. plantarum TanA+, nous avons identifié et séquencé (WGS) des souches produisant l'Est_1092 (Est_1092+), une estérase précédemment associée à l'hydrolyse des tannins. Les analyses de spectrométrie de masse des surnageants obtenus après la fermentation ont révélé que parmi les souches Est_1092+ et TanA+, seule ces dernières étaient capables d'hydrolyser les ellagitanins galloylés présents dans le camu-camu (tri-galloyl-HHDP-glucose et différents isomères de [di]HHDP-galloyl-glucose). En conséquence, les souches TanA+ ont libéré de structures de base des ellagitanins et de l'acide gallique. Toutefois, ni les souches Est_1092+ ni celles TanA+ n'ont modifié les structures de base des ellagitanins ni de structures d'ellagitanins complexes comme la vescalagine ou la castalagine. Le dernier volet a examiné la capacité des différentes souches de L. plantarum à métaboliser les flavan-3-ols en diphénylpropan-2-ols. Après le criblage de 47, douze se sont révélées capables d'ouvrir le noyau C d'un flavan-3-ol [(+)-catéchine] en libérant du 3-(3',4'-dihydroxyphényl)-1- (2,4,6-trihydroxyphényl)-propan-2-ol (une forme de diphénylpropan-2-ol) à partir de (+)-catéchine : ATCC 8014, ATCC 14917, PROBI 56-12, PROBI 56-24, PROBI 59-12, PROBI S204, RKG 1-473, RKG 1-500, RKG 1-611, RKG 2-212, RKG 2-219 et RKG 2-690. Ces souches ont ensuite été évaluées par leur capacité à convertir différentes structures de flavan-3-ols. Une analyse hiérarchique en grappes a révélé deux groupes de souches métabolisant les flavan-3-ol : les productrices « élevées » et « faibles » de diphénylpropan-2-ols. De quatre structures simples de flavan-3-ols [(+)-catéchine, (−)-épicatéchine, (−)-épigallocatéchine, (+)-gallocatéchine], l'épicatéchine était la plus métabolisée. Toutes les souches ont hydrolysé le gallate de (−)- épigallocatéchine, mais n'ont pas réussi à métaboliser les procyanidines A2 et B2. En somme, cette thèse met en lumière le rôle de L. plantarum dans le métabolisme de divers types de (poly)phénols, notamment les gallotanins, les ellagitanins et les flavan-3-ols. Elle fournit également des informations sur les attributs génomiques des souches capables de réaliser ces conversions métaboliques. Les souches sélectionnées dans cette étude ont le potentiel de libérer de métabolites phénoliques bioactifs, tels que l'acide gallique et les diphénylpropan-2-ols, et pourraient être considérées comme des candidats pour des probiotiques de précision visant à maximiser les bienfaits de ces composés phénoliques. / The consumption of (poly)phenols is frequently associated with a reduced risk of developing non-communicable diseases. However, variations in the intestinal microbiota can affect the bioactive phenolic metabolites produced from these compounds, impacting their potential benefit. In this regard, probiotic bacteria capable of metabolizing (poly)phenols represent a possible strategy. This is the case of Lactiplantibacillus plantarum, distinguished by its wide range of enzymes that catalyze (poly)phenols. Nevertheless, some of these enzymatic activities are strain-specific, and little information is available about them. This thesis aims to identify L. plantarum strains capable of metabolizing various types of (poly)phenols, including gallotannins, ellagitannins, and flavan-3- ols, while deepening our understanding of their metabolic and genomic profiles. In the first part, the study focused on the potential of L. plantarum in converting gallotannins. To facilitate the detection of strains with this metabolic capacity, we developed a spectrophotometric method to measure the extracellular tannase (TanA), the enzyme responsible for this biotransformation. Among 115 L. plantarum isolates evaluated, six showed TanA production (TanA+) (PROBI S126, PROBI S204, RKG 1-473, RKG 1-500, RKG 2-219, and RKG 2-690). When these strains were cultured with tannic acid (a gallotannin), they released a significantly higher amount of gallic acid than a reference strain without this activity (WCFS1). After sequencing the TanA+ strains (WGS) and analyzing their genomic attributes, they were found to exhibit great similarity, especially regarding their safety-related genes and those associated with their probiotic and technological potential, such as bacteriocin-encoding genes. The second part of this thesis explored the metabolic potential of this bacterial species towards the great variety of ellagitannins present in camu-camu fruit (Myrciaria dubia). In addition to the L. plantarum TanA+ strains, we identified and sequenced (WGS) strains producing Est_1092 (Est_1092+), an esterase previously associated with tannin hydrolysis. Mass spectrometry analyses of the supernatants obtained after fermentation revealed that among the Est_1092+ and TanA+ strains, only the latter were able to hydrolyze the galloylated ellagitannins present in camu-camu (tri-galloyl-HHDP-glucose and various [di]HHDP-galloyl-glucose isomers). As a result, TanA+ strains released ellagitannin base structures and gallic acid. However, neither the Est_1092+ nor the TanA+ strains modified the ellagitannin base structures or complex ellagitannin structures such as vescalagin or castalagin. The last part of this work examined the ability of various L. plantarum strains to metabolize flavan-3-ols into diphenylpropan-2-ols. After screening 47 isolates, twelve were found capable of opening the C-ring of a flavan-3-ol [(+)-catechin], releasing 3-(3',4'-dihydroxyphenyl)-1-(2,4,6- trihydroxyphenyl)-propan-2-ol (a form of diphenylpropan-2-ol) from (+)-catechin: ATCC 8014, ATCC 14917, PROBI 56 12, PROBI 56 24, PROBI 59 12, PROBI S204, RKG 1 473, RKG 1 500, RKG 1 611, RKG 2 212, RKG 2 219, and RKG 2 690. These strains were then evaluated for their ability to convert different flavan-3-ol structures. A hierarchical cluster analysis revealed two strain groups metabolizing flavan-3-ols: "high" and "low" diphenylpropan-2-ol producers. Of the four simple flavan-3-ol structures [(+)-catechin, (−)-epicatechin, (−)-epigallocatechin, (+)- gallocatechin], epicatechin was the most metabolized. All strains hydrolyzed (−)-epigallocatechin gallate but failed to metabolize procyanidins A2 and B2. In summary, this thesis highlights the role of L. plantarum in the metabolism of various types of (poly)phenols, particularly gallotanins, ellagitannins, and flavan-3-ols. It also provides insights into the genomic attributes of the strains capable of performing these metabolic conversions. The strains selected in this study have the potential to release bioactive phenolic metabolites, such as gallic acid and diphenylpropan-2-ols. Such strains emerge as prime candidates for precision probiotics aiming to maximize the health benefits derived from these phenolic compounds.

L’exposition à l’oxygène durant la croissance de bactéries probiotiques sensibles à ce composé et les conditions rencontrées au cours de la digestion d’aliments ou de suppléments contenant ces bactéries peut causer une diminution importante de leur viabilité. Le but du présent projet était d’étudier les effets de catéchines et d’un extrait de thé vert (ETV) riche en catéchines sur la croissance de microorganismes sensibles à l’oxygène et d’une co-encapsulation bactéries-ETV sur leur survie lors d’une exposition à des conditions gastrointestinales simulées. Il ressort des résultats obtenus que les catéchines n’ont pas eu d’effet significatif sur la croissance des souches étudiées mais que l’ETV a grandement stimulé, en présence d’oxygène, la croissance de la souche Lactobacillus helveticus R0052. De plus, des populations équivalentes de cette souche ont été obtenues, en présence ou absence d’oxygène, lors de fermentations dans un milieu de culture enrichi de 2000 µg/mL d’ETV. Une réduction du potentiel d’oxydo-réduction du milieu par addition d’ETV expliquerait en partie la stimulation de la croissance en présence d’oxygène observée. Des analyses spectroscopiques et par chromatographie en phase gazeuse ont aussi montré une augmentation de l’ordre lipidique et un changement important de la composition en acides gras des lipides de cellules exposées à 2000 µg/mL d’ETV en comparaison avec ceux de cellules ayant eu une croissance dans un milieu non enrichi. Ces effets combinés de l’ETV sur le milieu de culture et directement sur les lipides bactériens auraient limité les effets de l’oxygène sur cette souche. De plus, la microencapsulation de la souche L. helveticus et de 1000 µg/mL d’ETV dans des microparticules de pectine enrobées de protéines de lactosérum a permis une amélioration notable de la survie bactérienne dans des conditions gastrointestinales simulées en comparaison avec des cellules libres. Les microparticules créées ont donc protégé de façon efficace les bactéries sensibles à l’oxygène étudiées et pourraient permettre une livraison combinée de bactéries et d’ETV à la partie inférieure du tractus gastrointestinal. / Oxygen exposure during the growth of oxygen-sensitive probiotic bacteria and the conditions encountered during their passage through the upper part of the gastrointestinal tract can have an important impact on their viability. The aim of this project was to study the effects of catechins and of a green tea extract (GTE) rich in catechins on the growth, in the presence of oxygen, of oxygen-sensitive probiotic bacteria and of a co-encapsulation bacteria-GTE on their survival under simulated gastrointestinal conditions. Results showed that medium enrichment with catechins did not have a significant effect on growth of the strains tested but that GTE stimulated the growth, under aerobic conditions, of Lactobacillus helveticus R0052. Moreover, similar populations of this strain were obtained, in the presence and absence of oxygen when the culture medium was enriched with 2000 µg/mL GTE. The growth-promoting effect of GTE in the presence of oxygen could be due, in part, to the reduction of the initial oxido-reduction (redox) potential of the medium following GTE addition. Spectroscopic and gas chromatography analyses also showed changes in the order and in fatty acid composition of lipids of cells exposed to 2000 µg/mL GTE in comparison with those of cells grown in unsupplemented culture medium. The combined effects of GTE components on the growth medium and on bacterial lipids seemed to have limited the effect of oxygen during growth of the Lactobacillus cells in media supplemented with 2000 µg/mL GTE. Moreover, the co-encapsulation of L. helveticus cells with 1000 µg/mL GTE in whey protein-coated pectin microparticles significantly increased the cell survival rates in comparison with free cells when exposed to the conditions encountered in the gastrointestinal tract. Whey-protein coated pectin microparticles could be an interesting system for the combined delivery of viable probiotic cells and of GTE to the lower part of the gastrointestinal tract.

Les bactéries probiotiques doivent être en mesure de survivre pendant la digestion gastrique afin d'atteindre le côlon et ainsi conférer des bienfaits sur la santé humaine. Le potentiel des matrices d'origine laitière pour soutenir les probiotiques a souvent été décrit, mais celui des produits végétaux tels que la sève d'érable pour cette application reste peu connue, alors que l'engouement pour ces produits est en croissance. L'objectif de ce mémoire était d'évaluer la viabilité cellulaire par l'utilisation du propidium monoazide (PMA) couplé à la qPCR, ainsi que d'évaluer l'expression de cinq gènes reliés au stress atpA, dnaK, galK, groEL et hrcA par RT-qPCR lors de la digestion gastrique in vitro (TIM-1) de trois souches commerciales (Bifidobacterium animalis ssp. lactis A026, Lacticaseibacillus paracasei A234, Lacticaseibacillus rhamnosus A119) ainsi que de la souche de référence Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) contenues dans de la sève d'érable. Les résultats ont indiqué que toutes les souches ont maintenu un taux de survie élevé suite à la digestion gastrique; B. animalis ssp. lactis A026 (7.14 log de cellules viables/mL), L. paracasei A234 (8.12 log de cellules viables/mL), L. rhamnosus A 119 (8.48 log de cellules viables/mL) et L. rhamnosus GG (8.36 log de cellules viables/mL) et que l'expression de certains gènes de stress ciblés avait été modulée pendant la digestion gastrique. Seule la souche L. rhamnosus GG a montré une modulation au niveau de l'expression de tous les gènes ciblés. Dans l'ensemble, l'expression d'au moins un gène associé à la réponse au stress a été modulée pour toutes les souches probiotiques pendant la digestion gastrique dans la matrice de sève d'érable. Face aux stress de la digestion gastrique, les différentes réponses du métabolisme des bactéries probiotiques permettent une meilleure survie cellulaire. En définitive, ces quatre souches ont le potentiel d'être utilisées comme probiotiques dans une matrice de sève d'érable, ce qui pourrait mener au développement d'une boisson fonctionnelle. / The probiotic bacteria must be able to survive during gastric digestion in order to reach the colon and thus provide human health benefits. The potential of dairy matrices to support probiotics has often been described, but plant products such as maple sap for this application remains little known, while the interest for these products is growing. The objective of this thesis was to evaluate cell viability by the use of propidium monoazide (PMA) coupled to qPCR, as well as to evaluate the expression of five genes linked to stress atpA, dnaK, galK, groEL and hrcA by RT-qPCR during in vitro gastric digestion (TIM-1) of three commercial strains (Bifidobacterium animalis ssp. lactis A026, Lacticaseibacillus paracasei A234, Lacticaseibacillus rhamnosus A119) as well as the reference strain Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) delivered in maple sap. The results indicated that all strains maintained a high survival rate after gastric digestion; B. animalis subsp. lactis A026 (7.14 log of viable cells/mL), L. paracasei A234 (8.12 log of viable cells/mL), L. rhamnosus A119 (8.48 log of viable cells/mL), and L. rhamnosus GG (8.36 log of viable cells/mL) and that the expression of certain target stress genes was modulated during gastric digestion. Only L. rhamnosus GG strain showed modulation in the expression of all target genes. Overall, the expression of at least one gene associated with the stress response was modulated for all probiotic strains during gastric digestion in the maple sap matrix. Faced with the stress of gastric digestion, the different responses of the metabolism of probiotic bacteria allow better cell survival. Ultimately, these four strains have the potential to be used as probiotics in a maple sap matrix, which could lead to the development of a functional drink.

Au cours de ces dernières années, le développement de la métagénomique a permis d'étendre notre compréhension du microbiote et de son rôle dans la santé de l'Homme. L'utilisation de probiotiques apparaît comme une opportunité thérapeutique pour lutter contre d'éventuelles dysbioses, mais elle nécessite au préalable une recherche accrue dans la compréhension de leurs mécanismes d'action. La souche probiotique Lactobacillus rhamnosus Lcr35®, produite depuis 1951 par les Laboratoires LYOCENTRE et commercialisée par la société PROBIONOV, constitue le principe actif de produits pharmaceutiques. Notre travail a consisté à comparer certaines propriétés "probiotiques" de cette souche bactérienne à quatre de ses préparations commerciales. Trois de ces formulations sont indiquées pour des applications intestinales : BACILOR (API Lcr Restituo® sachet ou de l'API Lcr Restituo® gélule) et FLOREA (API Lcr Lenio®). Le quatrième produit étudié, GYNOPHILUS (API Lcr Regenerans®), est indiqué pour lutter contre les dysbioses vaginales. Nous avons montré que les différents traitements subis par le micro-organisme au cours des cycles industriels généraient des modifications de ses propriétés. Ainsi, les formes APIs, notamment Lcr Lenio®, sont plus résistantes à un stress gastrique que la souche native. De même, les capacités d'adhésion de la souche vis-à-vis de cellules épithéliales intestinales Caco-2 sont augmentées suite au passage dans un cycle industriel. La caractérisation de l'enveloppe bactérienne et de ses variations de composition en fonction du cycle industriel a permis de montrer que la souche native présentait un profil d'hydrophobicité différent de celui obtenu avec les souches issues des APIs. Ces variations n'ont pourtant pas permis de mettre en évidence de variation dans les capacités d'agrégation de la souche. Inversement, l'analyse du profil d'expression de gènes codant potentiellement des protéines sécrétées ou transmembranaires ou impliquées dans des processus d'adhésion montrent des variations entre la souche native et les APIs testés. Le traitement de la souche par un cycle entraine également des modifications de ses capacités métaboliques. L'API Lcr Regenerans® voit ainsi son aptitude à dégrader le glycogène et son potentiel bactéricide et fongicide fortement augmentés. Ces résultats suggèrent que le processus de fabrication influe sur les propriétés chimiques et la composition des protéines de la paroi cellulaire bactérienne. L'étude des modifications apportées par les processus industriels devra être approfondie afin de mieux adapter les souches probiotiques d'intérêt à la conception de produits manufacturés parfaitement adaptés aux visées thérapeutiques. / In recent years, the development of metagenomics has expanded our understanding of the role played by our microbiota on our health. The use of probiotics appears to be a therapeutic opportunity but requires more research to understand their mechanisms of action. The probiotic strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35 ®, produced since 1951 by Lyocentre Laboratories and marketed by PROBIONOV, is the active ingredient of pharmaceutical products. Our work was to compare some "probiotic" properties of bacterial strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35 ® versus four of its commercial preparations. Three of these formulations are suitable for intestinal applications: BACILOR (API Lcr Restituo ® packet or API Lcr Restituo ® capsule) and FLOREA (API Lcr Lenio ®). The fourth product studied GYNOPHILUS (API Lcr Regenerans ®) which is indicated for the fight against vaginal dysbiosis. We have shown that the different treatments of the microorganism in industrial processes generated changes to its properties. We found that APIs forms increased the resistance of the strain to gastric stress; Lcr Lenio ® offers the most resistance. Similarly, adherence capacities of the strain were increased in Caco-2 cells following industrial processes. Characterization of the bacterial envelope and its composition were changed depending on the industrial cycle and showed that the native strain expressed a hydrophobicity profile different from the APIs. However, these changes have not show variation in the aggregation capabilities of the strain. Conversely, analysis of the expression pattern of genes encoded potentially for secreted or trans-membrane proteins show variations between the native strain and the APIs tested. Treatment of the strain by an industrial manufacturing also allowed for changes in its metabolic capabilities. The API Lcr Regenerans ® sees these abilties as glycogen degradation and its bactericidal and fungicidal potential greatly increased. These results suggest that the manufacturing process affects the chemical properties and protein composition of the cell wall. The study of changes in industrial processes must be thorough in order to better adapt the probiotic strains in the design of manufactured products perfectly suited for therapeutic purposes.

Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 173-179 [120 réf.].

Reproduction de : Thèse de doctorat : Qualité et sécurité des aliments : Toulouse, INPT : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 503 réf.

Thèse de doctorat : Chimie analytique : Strasbourg : 2009. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 19 p.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine vétérinaire : Toulouse 3 : 2008. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p. 141-146.

La matrice du fromage Cheddar est souvent, selon les souches, un milieu propice à la survie des probiotiques au cours de la fabrication et de l’entreposage à long terme. Elle les protégerait également lors du passage dans le tractus gastro-intestinal, leur permettant d’atteindre l’intestin sous une forme viable. Par contre, la compétition avec les lactocoques pour les nutriments, le pH acide, le sel et la présence d’oxygène pendant la fabrication sont tous des facteurs qui peuvent affecter la viabilité des probiotiques. Dans le but de vérifier les paramètres influençant la viabilité des probiotiques dans le fromage Cheddar pendant la fabrication et la maturation, six souches probiotiques commerciales ont été sélectionnées. Il s’agit des souches Lactobacillus rhamnosus GR-1, Lb. rhamnosus GG, Lb. rhamnosus R0011, Lactobacillus helveticus R0052, Lactobacillus acidophilus LA-5 et Bifidobacterium animalis ssp. lactis Bb-12. Dans un premier temps, afin de déterminer la nature des interactions possibles avec les lactocoques de fabrication, une étude de biocompatibilité a été effectuée avec quatre souches de lactocoques commerciaux ainsi qu’un mélange de lactocoques commerciaux. Il s’est avéré que la biocompatibilité des probiotiques était variable en fonction du lactocoque. Le lactocoque W62 était le plus biocompatible pour les souches probiotiques. Dans l’extrait acellulaire de la souche W62, la combinaison des souches Bb-12 et GR-1 était plus performante. La viabilité des six souches probiotiques seules et des souches Bb-12 et GR-1 fut ensuite évaluée dans des caillés modèles composés du lactocoque (W62), de deux pH (5.0 et 5.4) et de deux S/H (2.5 % et 4.5 %). Chacune des souches probiotiques étaient affectées différemment en fonction du pH, du S/H et de la présence de la souche W62. Dans les caillés modèles, la viabilité des souches de Lb. rhamnosus (GR-1, GG et R0011) était meilleure que celle des souches Lb. acidophilus LA-5, B. lactis Bb-12 et Lb. helveticus R0052. Lors de leur co-culture, la population des souches Bb-12 et GR-1 était plus élevée que lorsqu’elles étaient seules. Des fromages furent ensuite fabriqués avec ces deux souches seules ou en combinaison. Pendant la fabrication fromagère, la viabilité de la souche Bb-12 diminua de 1 log UFC/g pendant la cuisson. Des essais en mini-fromagerie confirmèrent qu’une agitation élevée pendant la cuisson diminuait la survie de la souche Bb-12. Par contre, il fut impossible de confirmer si l’oxygène était aussi en cause. Pendant l’affinage des fromages, les deux souches probiotiques ont maintenu leur population dans les fromages pendant les douze semaines d’affinage. La protéolyse ainsi que la quantité d’acides organiques étaient plus élevées dans les fromages contenant la souche GR-1. Le fromage contenant la souche Bb-12 entreposée à 4°C avait des propriétés sensorielles différentes des fromages contenant la souche GR-1. / When added to Cheddar cheese, viability of probiotic strains vary according to combination of several factors. These factors are the probiotic strain being studied, the lactic acid bacteria strain used in the manufacture of cheese, the presence of other probiotic strains, stirring while cooking, pH, salt on moisture (S/M) content and ripening temperature. The lactic acid bacteria strain used for Cheddar cheese process influence the viability of probiotic strains. In the same way, co-culture of two probiotic strains can also affect their viability. While cooking procedure, high level of agitation may affect probiotic strain viability. During ripening, each probiotic strain had a single survival profile according to the pH, S/M and ripening temperature. Moreover, depending on the probiotic strain added in cheese, proteolysis and the amount of organic acids had increase. This increase causes changes in texture and in sensory properties of Cheddar cheese.