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Influence du cycle industriel sur les caractéristiques probiotiques de Lactobacillus rhamnosus (Lcr35®)Nivoliez, Adrien 27 November 2012 (has links)
Au cours de ces dernières années, le développement de la métagénomique a permis d'étendre notre compréhension du microbiote et de son rôle dans la santé de l'Homme. L'utilisation de probiotiques apparaît comme une opportunité thérapeutique pour lutter contre d'éventuelles dysbioses, mais elle nécessite au préalable une recherche accrue dans la compréhension de leurs mécanismes d'action. La souche probiotique Lactobacillus rhamnosus Lcr35®, produite depuis 1951 par les Laboratoires LYOCENTRE et commercialisée par la société PROBIONOV, constitue le principe actif de produits pharmaceutiques. Notre travail a consisté à comparer certaines propriétés "probiotiques" de cette souche bactérienne à quatre de ses préparations commerciales. Trois de ces formulations sont indiquées pour des applications intestinales : BACILOR (API Lcr Restituo® sachet ou de l'API Lcr Restituo® gélule) et FLOREA (API Lcr Lenio®). Le quatrième produit étudié, GYNOPHILUS (API Lcr Regenerans®), est indiqué pour lutter contre les dysbioses vaginales. Nous avons montré que les différents traitements subis par le micro-organisme au cours des cycles industriels généraient des modifications de ses propriétés. Ainsi, les formes APIs, notamment Lcr Lenio®, sont plus résistantes à un stress gastrique que la souche native. De même, les capacités d'adhésion de la souche vis-à-vis de cellules épithéliales intestinales Caco-2 sont augmentées suite au passage dans un cycle industriel. La caractérisation de l'enveloppe bactérienne et de ses variations de composition en fonction du cycle industriel a permis de montrer que la souche native présentait un profil d'hydrophobicité différent de celui obtenu avec les souches issues des APIs. Ces variations n'ont pourtant pas permis de mettre en évidence de variation dans les capacités d'agrégation de la souche. Inversement, l'analyse du profil d'expression de gènes codant potentiellement des protéines sécrétées ou transmembranaires ou impliquées dans des processus d'adhésion montrent des variations entre la souche native et les APIs testés. Le traitement de la souche par un cycle entraine également des modifications de ses capacités métaboliques. L'API Lcr Regenerans® voit ainsi son aptitude à dégrader le glycogène et son potentiel bactéricide et fongicide fortement augmentés. Ces résultats suggèrent que le processus de fabrication influe sur les propriétés chimiques et la composition des protéines de la paroi cellulaire bactérienne. L'étude des modifications apportées par les processus industriels devra être approfondie afin de mieux adapter les souches probiotiques d'intérêt à la conception de produits manufacturés parfaitement adaptés aux visées thérapeutiques. / In recent years, the development of metagenomics has expanded our understanding of the role played by our microbiota on our health. The use of probiotics appears to be a therapeutic opportunity but requires more research to understand their mechanisms of action. The probiotic strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35 ®, produced since 1951 by Lyocentre Laboratories and marketed by PROBIONOV, is the active ingredient of pharmaceutical products. Our work was to compare some "probiotic" properties of bacterial strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35 ® versus four of its commercial preparations. Three of these formulations are suitable for intestinal applications: BACILOR (API Lcr Restituo ® packet or API Lcr Restituo ® capsule) and FLOREA (API Lcr Lenio ®). The fourth product studied GYNOPHILUS (API Lcr Regenerans ®) which is indicated for the fight against vaginal dysbiosis. We have shown that the different treatments of the microorganism in industrial processes generated changes to its properties. We found that APIs forms increased the resistance of the strain to gastric stress; Lcr Lenio ® offers the most resistance. Similarly, adherence capacities of the strain were increased in Caco-2 cells following industrial processes. Characterization of the bacterial envelope and its composition were changed depending on the industrial cycle and showed that the native strain expressed a hydrophobicity profile different from the APIs. However, these changes have not show variation in the aggregation capabilities of the strain. Conversely, analysis of the expression pattern of genes encoded potentially for secreted or trans-membrane proteins show variations between the native strain and the APIs tested. Treatment of the strain by an industrial manufacturing also allowed for changes in its metabolic capabilities. The API Lcr Regenerans ® sees these abilties as glycogen degradation and its bactericidal and fungicidal potential greatly increased. These results suggest that the manufacturing process affects the chemical properties and protein composition of the cell wall. The study of changes in industrial processes must be thorough in order to better adapt the probiotic strains in the design of manufactured products perfectly suited for therapeutic purposes.
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Caractérisation du mycobiome intestinal et fécal chez les patients atteints de maladie de Crohn, et leurs parents sains du premier degré / Characterization of the faecal mycobiome in familial Crohn's diseaseHoarau, Gautier 30 November 2016 (has links)
Introduction : La maladie de Crohn (MC), maladie inflammatoire chronique intestinale, est une maladie multifactorielle, d’origine inconnue. La dysbiose bactérienne a été largement évoquée dans la pathogénèse de la MC. Notre objectif était de caractériser la flore fongique, conjointement à la flore bactérienne au cours de formes familiales de MC.Méthodes: Nous avons utilisé une plateforme de séquençage à haut débit pour caractériser la flore fongique et bactérienne fécale, échantillonnée dans 9 familles multiplexes atteints de MC (20 patients, et 28 sujets sains apparentés), et 4 familles contrôles (21 individus sains non apparentés). Une analyse bioinformatique a été réalisée pour analyser l’abondance, la biodiversité, et les interactions microbiennes.Résultats : Le microbiote fécal des membres issus des familles multiplexes était statistiquement différent de celui des membres issus des familles contrôles. L’analyse en composantes principales a montré qu’au sein des familles multiplexes, les membres malades et sains partageaient un répertoire fongique commun. Les patients MC avaient en revanche un microbiote enrichi en Candida tropicalis, Escherichia coli et en Serratia marcescens, et appauvri en bactéries dites bénéfiques (Faecalibacterium prausnitzii). De plus les taux d’ASCA (Anticorps anti- S. cerevisiae), marqueur sérologique de MC étaient corrélées à la présence de C. tropicalis (P = .01). Enfin nous avons mis en évidence une synergie entre C. tropicalis, E. coli, et S. marcescens, suggérant une interaction microbienne in vivo participant à l’initiation de l’inflammation intestinale. Ces données ont été validées par la suite avec un modèle de biofilm.Conclusion : Dans ces formes familiales de MC, les interactions microbiennes entre bactéries et champignons sont déterminantes dans l’initiation de la réponse inflammatoire. / Introduction: Crohn's disease (CD) results from a complex interplay between host genetic factors and endogenous microbial communities.Methods: In the current study, we used Ion Torrent sequencing to characterize the gut bacterial microbiota (bacteriome) and fungal community (mycobiome) in patients with CD and their non-diseased first degree relatives (NCDR) in 9 familial clusters living in Northern France/Belgium, and in healthy individuals from 4 families living in the same area (non-CD unrelated, NCDU). Principal components analysis, diversity, and abundance analyses were conducted and CD-associated inter- and intra-kingdom microbial correlations determined. Significant microbial interactions were identified and validated using single- and mixed-species biofilms.Results: CD and NCDR groups clustered together in the mycobiome, but not in bacteriome. Microbiota of familial (CD, NCDR) samples were distinct from that of non-familial (NCDU) samples. Abundance of Serratia marcescens (SM), Escherichia coli (EC) was elevated in CD patients, while that of beneficial bacteria was decreased. Abundance of the fungus Candida tropicalis (CT) was significantly higher in CD compared to NCDR (P = .003), and positively correlated with levels of anti–Saccharomyces cerevisiae antibody (ASCA). Abundance of CT was positively correlated with SM and EC, suggesting these organisms interact in the gut. The mass and thickness of Triple species (CT+SM+EC) biofilm were significantly higher than single and double species biofilm. CT biofilms comprised of blastospores, while double and triple species biofilms were enriched in hyphae. SM used fimbriae to co-aggregate or attach with CT/EC, while EC closely apposed with CT. Conclusion: Specific inter-kingdom microbial interactions may be key determinants in CD.
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Exploration du microbiote d'invertébrés par métagénomique fonctionnelle et caractérisation structure-fonction d'une nouvelle xylanase / Exploration of the microbiota of invertebrates by functional metagenomics and structure-function characterization of a new xylanaseGuyez, Barbara 06 December 2016 (has links)
La paroi végétale est une structure complexe composée principalement de polysaccharides (cellulose, hémicellulose et pectine), de lignine et de protéines. Elle est impliquée dans de nombreuses fonctions essentielles à la vie de la cellule végétale. De plus, les constituants de cette paroi, que sont les polysaccharides et la lignine, représentent la plus grande source de carbone renouvelable de la planète. Ceci en fait des cibles de choix notamment pour la production d'énergies « vertes ». Toutefois, l'utilisation des polysaccharides tels que les hémicelluloses constituant la paroi végétale reste, à l'heure actuelle, limitée du fait de la difficulté à les dégrader. Ces dernières années, un effort important a été mis en œuvre pour identifier et caractériser de nouvelles enzymes, telles que les glycosides hydrolases, permettant de dégrader efficacement la biomasse végétale. Dans le but de découvrir de nouvelles enzymes impliquées dans la dégradation de la biomasse végétale, des chercheurs de l'équipe « Catalyse et Ingénierie Moléculaire Enzymatiques » du LISBP ont décidé d'explorer le métagénome d'organismes connus pour dégrader la biomasse végétale. Deux espèces animales ont fait l'objet d'analyses : tout d'abord les termites qui sont considérés comme les champions de la dégradation de la biomasse végétales et souvent comparés à des bioréacteurs, et le ver de terre. Des banques métagénomiques de trois espèces différentes de termites ainsi qu'une banque métagénomique de ver de terre ont ainsi été créées. Dans ces travaux de thèse deux des banques métagénomiques de termites, celle de Nasutitermes corniger et celle de Termes hispaniolae, ont fait l'objet d'une étude afin de comparer le potentiel hémicellulolytique de ces deux espèces. Après sélection de nombreux clones positifs sur substrats chromogéniques de chacune des deux banques, séquençage puis annotation taxonomique et fonctionnelle, un grand nombre d'enzymes et principalement des glycosides hydrolases, a pu être identifié. Les résultats montrent que le métagénome de Nasutitermes corniger présente majoritairement des enzymes à activité endoglycosidase alors que le métagenome de Termes hispaniolae possède plutôt des enzymes à activité exoglycosidase. Toutes les activités trouvées dans chacune des espèces de termite sont en bonne corrélation avec l'alimentation du termite. De plus, nous avons observé que le microbiote intestinal des deux termites ne possèdent pas les mêmes embranchements bactériens majoritaires et nous avons pu voir que le microbiote de Termes hispaniolae est plus diversifié ce qui corrèle aussi avec l'alimentation des deux termites. D'autre part, dans la banque métagénomique du ver de terre, l'annotation fonctionnelle a révélé une enzyme intéressante. Il s'agit d'une enzyme annotée par B. Henrissat (responsable de la base de données CAZy) comme étant une glycoside hydrolase putative mais n'appartenant à aucune des 135 familles de glycosides hydrolases existantes. Cette enzyme putative, appelée GH* présente des similitudes avec les GH de la famille 5 sans pour autant appartenir à cette famille du fait notamment de l'absence du résidu catalytique nucléophile conservé. Une étude structurale et fonctionnelle de GH* a donc été menée. Les expériences ont permis de prouver que GH* est une endo-xylanase ayant une préférence pour les arabinoxylanes et les xylooligosaccharides de degré de polymérisation d'au moins 5 ou 6. La structure tridimensionnelle de GH* à 1,6Å de résolution a été obtenue par cristallographie des rayons X par remplacement moléculaire à l'aide d'une GH5. Cette structure a permis de confirmer l'identité du résidu acide/base identifié par alignement de séquences et d'émettre une hypothèse sur l'identité du résidu nucléophile. Enfin des mutants de GH* pour ces deux résidus ont été obtenus et ont confirmé leur implication dans l'activité de l'enzyme. / Plant cell wall is a complex structure surrounding plant cells mainly composed by polysaccharides (cellulose, hemicellulose and pectin), lignin and proteins. The plant wall maintains and imposes the size and shape of cells. It is also important for exchanges between cells and extra cellular medium. The polysaccharides of this cell wall are the largest renewable carbon source on the earth, which makes them good targets to produce green energies. Because plant cell wall is difficult to degrade, its use for biofuels for is still limited. However, some organisms are able to efficiently degrade this biomass. Exploring the diversity of the living word to discover new effective biocatalysts has grown considerably last years, because of the emergence of metagenomics. In this context and to discover new enzymes involved in the degradation of plant biomass, the team « Catalyse et Ingénierie Moléculaire Enzymatiques » of LISBP decided to explore metagenome of organisms known to degrade plant biomass. Two animal families were chosen for metagenomics analysis, the termite and earthworm. Metagenomics banks of three different species of termite and one metagenomics bank of an earthworm were created. In this thesis project, two of the three metagenomics banks of termites, the one from Nasutitermes corniger and the other one from Termes hispaniolae, were studied to compare the hemicellulolytic potential of these two species. After selection of many positive clones on chromogenic substrates of both banks, sequencing, taxonomic and functional annotations, a large number of enzymes and mainly glycoside hydrolases, could be identified. The results obtained shown that the trends observed during functional screens were maintained. Indeed, it appears that Nasutitermes corniger has a majority of endoglycosidases while Termes hispaniolae has mainly exoglycosidases. Thereby, families of enzymes highlighted allowed correlating their hydrolytic activities with the diet of these species. Furthermore, we observed that the intestinal microbiota of each termite is different. Indeed, both termites do not have the same majority bacterial phyla and the microbiota of Termes hispaniolae is more diverse than the one of Nasutitermes corniger. On the other hand, functional annotation of the metagenomics bank of the earthworm revealed an enzyme annotated as a glycoside hydrolase no belonging to any of the 135 glycoside hydrolase existing families. This enzyme, named GH*, seems to be close to GH5 but does not shown the nucleophilic catalyst residue perfectly conserved in this glycoside hydrolase family. A functional and structural study of GH* was then done. We have shown that GH* is an endo-xylanase which prefers arabinoxylans and xylooligosaccharides having a polymerization degree greater than 5. In addition, we determined the crystal structure of GH* at 1.6Å resolution. This 3D structure has confirmed the presence of the acid/base residue identified by sequence alignment and allowed us to hypothesize about the identity of the nucleophilic residue. Finally, mutants of GH* for these two residues were obtained and confirmed their involvement in the activity of the enzyme. We were able to progress in the understanding of structure/function relationships of this protein.
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Dynamique des populations et communautés bactériennes au cours de l’hospitalisation et des infections associées aux soins : cas particulier de la chirurgie cardiaque / Bacterial populations and communities’ dynamic during the hospitalization and in the occurrence of the health-care associated infections : the particular case of cardiac surgeryRomano, Sara 09 January 2015 (has links)
Les microbiotes humains sont considérés comme des organes supplémentaires impliqués dans des pathologies diverses, y compris infectieuses. Les déséquilibres des microbiotes, ou dysbioses, créent des niches écologiques pathologiques ou pathobiomes. Ce nouveau paradigme de l'infection s'applique tout particulièrement aux infections opportunistes. Dans ce travail, nous considérons des infections associées aux soins (IAS), les infections du site opératoire en chirurgie cardiaque, comme le résultat d'une pathologie de niche et nous étudions la dynamique des communautés et des populations microbiennes comme conditions d'émergence et de succès de l'agent infectieux. La diversité et la dynamique du microbiote chirurgical superficiel et profond de patients opérés pour pontage aorto-coronarien montrent un remplacement partiel du microbiote pré-opératoire par un microbiote spécifique avec une résilience partielle lors de la cicatrisation. Un lien significatif est observé entre la composition microbiotique et les marqueurs de risque infectieux. Le suivi de la structure de population d'un agent pathogène reconnu en chirurgie cardiaque, Propionibacterium acnes, montre des fréquences différentielles de phylotypes selon les phases opératoires. La spécificité du microbiote opératoire consiste en une forte diversité de bactéries à Gram négatif dont certaines ont été décrites dans le microbiote de la peau saine. Nous avons réalisé une identification au niveau de l'espèce de ces bactéries de la peau saine qui s'avèrent atypiques parmi les bactéries humaines connues car elles évoquent une origine environnementale. Le réservoir cutané et non environnemental d'un pathogène opportuniste, Roseomonas mucosa, est démontré et trois populations de pathogène opportuniste à réservoir environnemental et/ou humain (Pseudomonas aeruginosa, Ochrobactrum antropi, O. intermedium) sont étudiés en termes de structure de population pour préciser les conditions de leur transmission et leur succès infectieux dans le contexte général du pathobiome et des niches écologiques perturbées. Ce contexte général permet d'organiser les résultats obtenus à diverses échelles (communauté, populations, espèces, phylotypes) pour proposer une vision intégrée et originale de la microbiologie des IAS. / Human microbiota are now considered as supplementary organs involved in diseases such as infections. Microbiota disequilibrium named dysbiosis creates impaired ecological niches (pathobiomes). This new paradigm of infection is particularly relevant for opportunistic infections. In this study, we consider one major type of healthcare associated infection (HAI), the surgical site infections after cardiothoracic surgery as a pathology of niche. We study the dynamics of microbial communities and populations as conditions for emergence and success of infectious agents.The diversity and dynamics of superficial and deep surgical microbiota in patients undergoing coronary artery bypass grafting show a partial replacement of the pre-operative microbiota by a specific surgical microbiota with partial resilience during healing. Significant links are found between microbiota composition and scores for infectious risk. The population structure of Propionibacterium acnes, a pathogen complicating cardiac surgery, shows variable frequencies of phylotypes according to operative stages. Surgical microbiota appears specific with high diversity of Gram-negative bacteria, some of them being previously described in healthy skin microbiota. At the species-level, these bacteria appear atypical among known human bacteria because they are related to environmental bacteria. We demonstrate the cutaneous reservoir of the opportunistic pathogen Roseomonas mucosa deemed, until now, to be environmental. Three populations of opportunistic pathogens (Pseudomonas aeruginosa, Ochrobactrum anthropi, O. intermedium) are structured in order to precise their transmission and their infectivity in the general context of impaired ecological niche and pathobiome.The results obtained at various microbiological scale (community, population, species, phylotype) are organized in this general context in order to delineate an original integrative vision of HAI.
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