Les épithéliums agissent comme des barrières physiques et chimiques vitales pour l’organisme. Les fonctions épithéliales reposent sur la cohésion des cellules assurée par les jonctions serrées et adhérentes qui sont connectées au réseau d’acto-myosine. Pendant le développement et la vie adulte, les épithélia se développent ou se régénèrent grâce à la division cellulaire. Durant la division, les cellules épithéliales opèrent des changements importants de leurs formes sans que l’intégrité de l’épithélium soit altérée. Pendant la division, les forces de tensions appliquées sur la jonction adhérente et la force produite par l’anneau de cytodiérèse s’opposent ce qui contribue au maintien de l’intégrité de l’épithélium. Cependant les mécanismes impliqués dans la régulation des forces mises en jeu pendant la division cellulaire sont mal connus. Mon projet de thèse a été de caractériser la cytodiérèse des cellules épithéliales de vertébrés en utilisant l’embryon de Xenopus laevis comme modèle d’étude in situ. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré qu’un espace se forme de façon transitoire entre les deux cellules filles pendant la division. Cet espace est intimement lié à l’anneau de cytodiérèse. Dans la seconde partie, nous avons caractérisé l’implication de la jonction serrée pendant la division cellulaire. Nos résultats montrent que la protéine de structure ZO-1 et la protéine régulatrice GEF-H1 associées à cette jonction, régulent négativement les tensions appliquées sur la jonction adhérente. Le rôle actif de la jonction serrée dans cette régulation est supporté par l’activation de la voie de signalisation Rho/RockII/myosine et la régulation par GEF-H1 du trafic membranaire via le complexe exocyste. Grâce à un biosenseur de tension, nous avons montré que la force appliquée sur la jonction adhérente augmente dans les embryons déplétés de ZO-1 et GEF-H1. Cette augmentation des tensions induit le ralentissement de la division et la déformation de l’anneau contractile. Enfin, nos résultats suggèrent que GEF-H1 contrôlerait localement les tensions au site de division. Dans la dernière partie, nous avons étudié la formation et l’activation de l’anneau d’acto-myosine. Nos résultats non publiés montrent que le recrutement de plusieurs protéines de l’anneau commence en apical et progresse le long de la membrane latérale. Nous nous intéressons à présent à l’étude du rôle des jonctions apicales dans ce recrutement. / Epithelia act as mechanical and chemical barriers essential to the body. Those functions rely on the cohesion of cells by tight and adherens junctions, which are linked to the actomyosin network. During development and adult life, epithelia develop or regenerate through cell division. During division, epithelial cells undergo important cell shape remodeling without altering the epithelium integrity. During cell division, mechanical forces applied to the adherens junctions and forces produced by the contractile ring are opposed, contributing to the maintenance of the epithelium integrity. However, the mechanisms involved in the regulation of the forces involved during cell division are poorly understood. The aim of my thesis project was to characterize cytokinesis in vertebrate epithelial cells using the Xenopus laevis embryo as an in situ model. In the first part of this manuscript, we described in vivo a space transiently forms between the two daughter cells during cell division. This space is intimately linked to the cytokinetic ring. In the second part, we have deciphered the role of tight junctions on cytokinesis. Our results show that the scaffold protein ZO-1 and the regulatory protein GEF-H1, which is associated to tight junctions, negatively regulate global tension applied to adherens junctions. The active role of tight junctions in regulating adherens junction is supported by the finding that GEF-H1 acts by activating the Rho/RockII/myosin pathway and by regulating membrane trafficking via the exocyst complex. The increase tension observed in ZO-1 and GEF-H1 depleted cells is correlated with defect in cytokinesis duration and contractile ring shape during cytokinesis. Finally, our results suggest that GEF-H1 can locally control tensions at division site. In the last part, we have studied contractile ring formation and activation. Our results show that recruitment of contractile ring proteins begins apically and progresses along the lateral membrane. We are now studying the role of apical junctions in this recruitment.

L'endothelium vasculaire constitue la principale barrière entre le sang et les tissus régulant le passage de macromolécules et de cellules circulantes. Longtemps considéré comme une monocouche passive, l'endothélium joue d'importants rôles dans la régulation de la pression sanguine, de l'hémostase, des réponses immunitaires et inflammatoires. L'adhérence cellule/cellule est initiée dans l'endothélium vasculaire par des interactions homophiliques entre molécules de VE-cadhérine (= jonctions adhérentes). La dynamique de la jonction et du cytosquelette est importante pour le remodelage des jonctions intercellulaires qui a lieu au cours l'angiogenèse, de la vasculogenèse et lors de la réparation de l'endothélium. C'est pourquoi la détermination des mécanismes moléculaires sous-jacents est indispensable à la comprehension de phénomènes physiopathologiques (angiogenèse et progression tumorales, inflammation...). D'après la littérature, la protéine EPLIN intervient dans la formation du complexe E-cadhérine/alpha-caténine/EPLIN et stabilise l'actine corticale. Actuellement décrite comme spécifique des modèles épithéliaux, EPLIN peut-elle intervenir dans la liaison du complexe à base de VE-cadhérine au cytosquelette d'actine? De plus, il paraît essentiel de comprendre le rôle de cette protéine dans les cellules car son expression est fortement diminuée dans la plupart des cancers alors qu'à l'inverse sa surexpression bloque la prolifération cellulaire. / The endothelium forms the main barrier regulating the passage of macromolecules and circulating cells between the blood and tissue. Historically viewed as a passive vascular lining, vascular endothelium plays important roles in the regulation of vascular pressure, hemostasis, immune and inflammatory responses. In vascular endothelium, cell/cell adhesion is mediated by homophilic interactions of VE-cadherin molecules (= adherens junctions). Cytoskeleton and junction dynamics are important for intercellular junctions remodelling that occurs during angiogenesis, vasculogenesis and endothelium repair. So, determining the underlying molecular mechanisms is essential for the comprehension of pathologic phenomena such as angiogenesis, tumor progression or inflammation. We learn from the literature that EPLIN is involved in E-cadherin/α-catenin/EPLIN complex formation and cortical actin stabilization. Usually described as a protein specific of epithelial models, we wondered if EPLIN is able to link VE-cadherin complex to actin cytoskeleton. Furthermore, it seems essential to understand its cellular role since it is downregulated in many cancers while in contrast its overexpression blocks cell proliferation.

Les cellules tumorales, comme les leucocytes, franchissent l'endothélium vasculaire au niveau des jonctions intercellulaires à l'endroit même où s'exprime la VE-cadhérine, la protéine majeure des jonctions adhérentes. Cette transmigration déstabilise transitoirement les jonctions, ce qui affecte l'intégrité de ce tissu.<br />Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents à l'ouverture des jonctions, nous avons établi la composition protéique du complexe à base de VE-cadhérine des jonctions adhérentes matures de cellules endothéliales primaires confluentes de type HUVEC. Pour cela, nous avons couplé immunoprécipitation et analyse protéomique par spectrométrie de masse (LC-nanoESI-MS/MS). Nous avons ainsi identifié de nouveaux partenaires du complexe à base de VE-cadhérine jamais identifiés auparavant au niveau de la jonction adhérente endothéliale. Parmi ceux-ci se trouvent des protéines liant l'actine telles l'annexine 2 et la moésine.<br />Nos résultats indiquent que l'annexine 2, qui s'accumule à la membrane plasmique au niveau des radeaux de cholestérol, entre en interaction directe avec le complexe à base de VE-cadhérine. Ainsi, l'annexine 2 connecte le complexe jonctionnel à base de VE-cadhérine au cytosquelette d'actine dans les HUVEC confluentes. L'utilisation de siRNA nous a permis d'établir que l'expression de l'annexine 2 est absolument nécessaire au maintien de la VE-cadhérine à la membrane plasmique. Nos résultats suggèrent que l'annexine 2, connectée à l'actine, arrime le complexe à base de VE-cadhérine au niveau des radeaux de cholestérol. En limitant la diffusion membranaire du complexe jonctionnel, ces interactions aboutissent à une consolidation des jonctions adhérentes ce qui contribue à maintenir l'intégrité de l'endothélium vasculaire. Lorsque les HUVEC sont soumises à des molecules destabilisant les jonctions adhérentes, une délocalisation de l'annexine 2 de la membrane vers le cytosol et une perturbation de la localisation de la VE-cadhérine sont observés. Ceci suggère que le prérequis à l'ouverture des jonctions adhérentes nécessite une rupture de l'interaction existant entre le complexe à base de VE-cadhérine et l'annexine 2.<br />La moésine, quant à elle, semble interagir avec le complexe à base de VE-cadhérine dans les jonctions immatures formées entre cellules sub-confluentes. La moésine serait donc impliquée dans l'établissement des contacts intercellulaires précoces plutôt que dans la maturation des jonctions endothéliales.

L'endothelium vasculaire constitue la principale barrière entre le sang et les tissus régulant le passage de macromolécules et de cellules circulantes. Longtemps considéré comme une monocouche passive, l'endothélium joue d'importants rôles dans la régulation de la pression sanguine, de l'hémostase, des réponses immunitaires et inflammatoires. L'adhérence cellule/cellule est initiée dans l'endothélium vasculaire par des interactions homophiliques entre molécules de VE-cadhérine (= jonctions adhérentes). La dynamique de la jonction et du cytosquelette est importante pour le remodelage des jonctions intercellulaires qui a lieu au cours l'angiogenèse, de la vasculogenèse et lors de la réparation de l'endothélium. C'est pourquoi la détermination des mécanismes moléculaires sous-jacents est indispensable à la comprehension de phénomènes physiopathologiques (angiogenèse et progression tumorales, inflammation...). D'après la littérature, la protéine EPLIN intervient dans la formation du complexe E-cadhérine/alpha-caténine/EPLIN et stabilise l'actine corticale. Actuellement décrite comme spécifique des modèles épithéliaux, EPLIN peut-elle intervenir dans la liaison du complexe à base de VE-cadhérine au cytosquelette d'actine? De plus, il paraît essentiel de comprendre le rôle de cette protéine dans les cellules car son expression est fortement diminuée dans la plupart des cancers alors qu'à l'inverse sa surexpression bloque la prolifération cellulaire.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable de maladies nosocomiales. Il provoque des infections aiguës ou chroniques en employant conjointement plusieurs facteurs de virulence. Les souches les plus agressives possèdent un système de sécrétion de type III (SST3), injectant des toxines directement dans le cytoplasme des cellules eucaryotes grâce à une nano-aiguille. Récemment, une souche clinique hyper-virulente, appelée CLJ1, a été isolée dans l'unité de soins intensifs de l'hôpital universitaire de Grenoble sur un patient souffrant d'une infection pulmonaire hémorragique. Cette souche ne possède pas les gènes codant pour le SST3 mais sécrète une pore-forming toxin, ExlA, non identifiée auparavant. ExlA est une protéine de 172 kDa, formant des pores de 1,6 nm dans la membrane plasmique de plusieurs types de cellules, à l'exception des érythrocytes. Le pore provoque la rétraction des cellules hôtes et finit par induire la mort de la cellule. Nous avons montré que CLJ1 appartenait à un nouveau clade très divergent des souches classiques de P. aeruginosa, dont les membres possèdent le gène exlA au lieu des gènes codant pour le SST3. Les souches exlA-positives que nous avons collectées dans le monde proviennent d'infections humaines et d'échantillons environnementaux. Leur cytotoxicité, sur diverses cellules humaines et sur un modèle murin d’infection pulmonaire, est corrélée avec les niveaux de sécrétion d'ExlA. En plus de la toxicité membranaire, les souches exlA-positives ont montré des activités protéolytiques élevées envers les VE et E-cadhérines, deux protéines adhésives des jonctions adhérentes requises pour l'intégrité de l'endothélium et de l'épithélium, respectivement. Nous avons démontré que la formation de pores par ExlA dans la membrane eucaryote induisait une entrée massive et rapide de calcium dans le cytosol. Cet afflux de calcium permet la maturation et l'activation d'ADAM10, une protéase eucaryote située à la membrane plasmique. L'activation d’ADAM10 induit le clivage de ses substrats naturels : les VE et E-cadhérines. ExlA fait partie de la même famille de pore forming toxin que ShlA de Serratia marcescens. Nous avons démontré que ShlA utilisait le même mécanisme qu’ExlA pour induire le clivage des cadhérines. En conclusion, les souches bactériennes produisant ExlA ou ShlA détournent un mécanisme naturel de l'hôte pour induire la perte d'intégrité tissulaire. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible for nosocomial diseases. It provokes acute or chronic infections due to several virulence factors acting in concert. The most aggressive strains possess a Type III Secretion System (T3SS), injecting toxins directly into the cytoplasm of eukaryotic cells thanks to a nano-needle. Recently, a hyper-virulent clinical strain, called CLJ1, was isolated from a patient suffering of hemorrhagic pulmonary infection, at the intensive care unit of Grenoble University Hospital. This strain lacks a T3SS but secretes a pore-forming toxin, ExlA, not previously identified. ExlA is a 172-kDa protein, forming 1.6-nm pores in the plasma membrane of several cell types, except erythrocytes. The pore causes the retraction of host cells and eventually induces necrotic cell death. We showed that CLJ1 belongs to a recently-discovered and highly divergent clade of P. aeruginosa, whose members possess the exlA gene instead of the genes coding for the T3SS and its effectors. The strains we collected worldwide originate from human infections and environmental samples. Their cytotoxicity on various human cells and mouse models of infection was correlated with ExlA secretion levels. In addition to membrane toxicity, exlA-positive strains displayed high proteolytic activities targeting VE and E-cadherins, two intercellular-junction adhesive proteins required for endothelium and epithelium integrity. We thus investigated the mechanisms of ExlA-induced cadherin cleavage. We demonstrated that ExlA pore formation in the eukaryotic membrane induces a massive and rapid entry of calcium into the cytosol. This calcium influx enables the maturation and activation of ADAM10, an eukaryotic protease located at the cell membrane. ADAM10 activation induces the cleavage of its natural substrates: the VE- and E-cadherins. ExlA is related to other toxins, including ShlA from Serratia marcescens, and altogether they constitute a family of pore-forming toxins with unique properties. We demonstrated that ShlA uses the same mechanism as ExlA to induce the cleavage of the cadherins. In conclusion, exlA- and shlA-positive strains hijack a natural mechanism of the host to induce the loss of tissue integrity.