Le pollen des Graminées est l'un des principaux vecteurs d'allergènes. Il contribue à l'apparition des allergies respiratoires comme l'asthme et la rhinite allergique. En contact avec l'eau de pluie ou des polluants atmosphériques, le pollen peut libérer des microparticules (<5 !m) dites granules cytoplasmiques de pollen. À cause de leur taille, ces granules peuvent pénétrer plus profondément dans l'appareil respiratoire que le pollen entier et induire ainsi des réactions allergiques. L'objectif de ce travail est de caractériser l'allergénicité de ces granules selon 3 volets : épidémiologique, expérimental et analytique. Les résultats de l'étude épidémiologique mettent évidence un effet éventuel des granules dans la survenue des allergies respiratoires, et plus particulièrement de l'asthme. Dans la partie expérimentale, les résultats obtenus permettent de montrer que les granules induisent des réactions allergiques, humorales et cellulaires ainsi que des réponses inflammatoires, comparables au pollen entier, chez le rat Brown Norway, le modèle animal d'allergie ici utilisé. Enfin, la partie analytique permet de conclure que l'allergénicité des granules dépend à la fois de leur contenu en allergènes hydrosolubles et non-hydrosolubles.

La maturation des cellules lymphoïdes T est un processus thymique hautement régulée où se mettent en place de manière ordonnée et successive les réarrangements des loci du TCRδ, γ, β et enfin α. Ceci nécessite des événements de recombinaisons somatiques V(D)J qui font intervenir les protéines RAG1/2, les séquences RSS jouxtant les segments V, D et J et des éléments régulateurs (enhancers) assurant une cis-régulation de ce processus. Le contrôle de la recombinaison V(D)J se fait grâce à divers mécanismes incluant des mécanismes épigénétiques, l'intervention de facteurs de transcription et la conformation/séquence des RSS (la règle 12/23 et la restriction B12/23). Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des proliférations malignes de blastes de phénotype thymique immature. Elles présentent des caractéristiques communes avec les progéniteurs T dont elles dérivent. Les anomalies cytogénétiques les plus fréquentes sont des translocations chromosomiques avec les loci TCRα/δ et TCRβ. La dérégulation, par translocation chromosomique, de nombreux oncogènes, comme le gène à homéodomaine TLX, ont été décrits dans les LAL-T. Les mécanismes moléculaires de ces anomalies, et notamment le rôle joué par la machinerie V(D)J ainsi que les mécanismes moléculaires intimes du blocage de différenciation observé restent cependant peu connus. Les leucémies, TLX1 ou TLX3 positive, se caractérisent par un blocage de maturation au stade cortical. Celui-ci se définit notamment par la présence de réarrangements complets du TCRβ, mais sans réarrangement du TCRα ni expression détectable du récepteur membranaire TCRαβ. Par un système de gène rapporteur, nous avons mis en évidence l'action répressive des protéines à homéodomaines TLX1 et TLX3 sur l'Enhancer Alpha (Eα). Puis l'interaction protéique entre ETS1 et TLX1/3 a été mise en évidence in vivo dans des lignées TLX positives. Enfin, nous montrons le recrutement des protéines TLX1/3, via ETS1, sur l'Eα. De manière intéressante, l'inactivation directe (knock-down par shRNA TLX1) ou indirecte (surexpression d'un TCRαβ exogène) de cette répression a pour conséquence une reprise de la différenciation T suivie d'une mort cellulaire par apoptose. De manière notable, cette apoptose est observé uniquement en condition de culture sur OP9DL1. Les cellules restent ainsi dépendantes du blocage de maturation dont la levée semble incompatible avec leur survie malgré l'accumulation de nombreux évènements oncogéniques. Parallèlement, en analysant les translocations TCRα/δ-TLX1 dans les LAL-T et dans le thymus d'individus sains, nous avons identifié un mécanisme d'auto-sélection clonal par addiction oncogénique. L'étude des translocations TCR-oncogènes sur une série de 280 LAL-T, nous a permis de confirmer la survenue des translocations TCRα/δ-oncogènes dans 19% de cas et TCRβ-oncogènes dans 14% des cas de LAL-T. Ce travail descriptif a permis l'identification de quatre nouveaux oncogènes impliqués dans les translocations TCR dans les LAL-T (LEF1, GNAQ, NKX2.4, IL2RB). Le clonage moléculaire des points de cassure a permis de mettre en évidence une absence d'intervention de la machinerie RAG au niveau de la cassure double brin de l'oncogène, soit une translocation de type 2. De façon intéressante, nous montrons un découplage entre le moment de survenue de la translocation (stade DN) et l'activation de l'oncogène (cortical, pré-αβ). Enfin nous avons mise en évidence un mécanisme de dérégulation oncogénique sensiblement différent en fonction du locus du TCR (α/δ ou β) impliqué dans la translocation. Cette étude descriptive, a permis de pointer l'implication fréquente des segments Dδ2 et Dδ3 dans les translocations chromosomiques et nous a amené à analyser les étapes les plus précoces de la thymopoïèse humaine. Nous avons pu mettre en évidence un ordonnement strict des réarrangements précoces de ce locus : Dδ2-Dδ3 précédant toujours les réarrangements impliquant les segments Jδ1. Le premier réarrangement Dδ2-Dδ3 à s'effectuer est détectable au stade de maturation Early Thymic Precursor ETP (CD34+ /CD1a-/CD7+/dim). De façon importante, nous montrons que le facteur de transcription RUNX1 est directement impliqué dans ce remaniement par sa fixation sur le Dδ2-23RSS et son interaction avec RAG1. Ainsi l'inactivation de RUNX1 dans des CD34+ de sang cordon, cultivés en condition de différenciation T a pour conséquence une absence totale de réarrangement Dδ2-Dδ3. L'ensemble de ces données met bien en évidence le rôle majeur de RUNX1 dans l'ordonnement précoce des réarrangements du TCRδ et pointe pour la première fois que ce locus, comme celui du TCRβ, est contrôlé par la restriction B12/23 chez l'Homme contrairement à ce qui est décrit chez la souris. Au final l'ensemble de ces expériences montre que l'oncogenèse et l'ontogénie T sont étroitement liées et qu'ainsi le blocage du processus de maturation physiologique T est un élément central du processus oncogénique dont les cellules leucémiques restent dépendantes pour leur survie. Ces résultats soulignent le potentiel de l'étude des LAL-T pour une meilleure compréhension de l'ontogénie T et ouvrent des perspectives originales de thérapie ciblée " différenciante ".

Le cortex de la plupart des protistes ciliés contient un squelette membranaire dont le principal élément est l'épiplasme, une structure apposée à la membrane alvéolaire interne. Chez la paramécie, l'épiplasme se présente sous forme d'écailles indépendantes disposées autour de chaque appareil ciliaire ; il est composé d'une famille multigénique de protéines appelées épiplasmines. Nous avons réalisé une étude structurale de cette famille multigénique. L'analyse phylogénétique a permis de confirmer l'existence de 5 groupes d'épiplasmines divisé chacun en deux sous-groupes a et b. L'utilisation de la méthodologie HCA nous a permis de montrer que ces protéines sont modulaires et présentent un arrangement de leurs domaines structuraux. Elles peuvent ainsi être regroupées en trois classes symétriques, asymétriques et atypiques. L'analyse des régions 5'UTR des membres de cette famille multigénique montre la présence d'éléments putatifs de régulation d'expression. La comparaison des épiplasmines de la paramécie avec leurs orthologues de Tetrahymena montre une relation structurale entre les groupes 1,2,3 et 5 et les EpiT 1,2,3, et 5 respectivement suggérant l'existence d'un ancêtre commun pour l'épiplasme de Paramecium et Tetrahymena. Nous avons réalisé l'analyse fonctionnelle des épiplasmines à partir d'approche par ARN interférence et par localisation couplée à la GFP. La perturbation de l'expression des épiplasmines symétriques et asymétriques, aboutit à une réponse cellulaire commune qui se traduit par un changement de la forme cellulaire, un blocage de la cytocinèse et enfin l'apparition de formes plasmodiales. L'analyse du cortex par microscopie à fluorescence montre une altération des unités corticales qui est fonction des types structuraux des épiplasmines. Les épiplasmines se localisent de manière différentielle autour du corps basal définissant un territoire dont le modèle d'organisation est centrifuge. On définit alors des épiplasmines cinétomosales, péricinétomosales, core et enfin périphériques. Ce modèle est discuté en relation avec les phénotypes obtenus par l'analyse fonctionnelle. Il permet d'intégrer les différents niveaux de relation entre le corps basal, son territoire et l'ensemble de l'épiplasme.

La signalisation Notch est une voie extrêmement conservée depuis Caenorhabditis elegans jusqu'aux mammifères en passant par Drosophila melanogaster. Elle est requise dès le développement embryonnaire et contrôle de nombreux processus comme la différenciation et le choix du destin cellulaire, la prolifération, ou encore le maintien de stocks de cellules souches et l'apoptose. La voie est basée sur l'activité du récepteur Notch, un hétérodimère transmembranaire qui est activé lors de contacts intercellulaires par la liaison de ses ligands qui sont également des protéines transmembranaires. Suite à cette activation, le récepteur subit une série de deux clivages protéolytiques internes, respectivement catalysés par une métalloprotéase ADAM et par le complexe multi-protéique γ-secrétase. Ce dernier clivage libère le domaine intracellulaire de Notch dans le cytoplasme, cette forme étant ensuite transportée dans le noyau où elle active directement la transcription des gènes cibles de la voie Notch en se liant à ses co-facteurs de transcription, CSL et Mastermind. Le récepteur Notch est régulé à diverses étapes par des processus d'ubiquitination : la monoubiquitination du récepteur Notch activé contrôle son clivage γ-secrétase, la polyubiquitination du récepteur Notch non activé et endocytosé contrôle sa dégradation dans les lysosomes. Les processus d'ubiquitination sont réversiblement contrôlés par la déubiquitination. Or, aucune déubiquitination n'a été identifiée dans la voie de signalisation Notch. Mon projet consistait à identifier les déubiquitinases - les enzymes responsables de la déubiquitination - impliquées dans les deux processus d'ubiquitination décrits précédemment. Nous avons pour cela mis au point deux cribles en immunofluorescence permettant de tester une banque de shRNA qui cible l'expression des 91 déubiquitinases connues ou putatives du génome humain. Le premier crible m'a permis d'identifier eIF3f, une sous-unité du facteur d'initiation de la traduction eIF3, comme une nouvelle protéine portant une activité déubiquitinase. eIF3f est recrutée au récepteur Notch via l'E3 ubiquitine ligase Deltex, et régule positivement la voie de signalisation Notch en déubiquitinant le récepteur Notch activé avant le clivage γ-secrétase, favorisant ainsi la production de la forme transcriptionnellement active de Notch. Par ailleurs, le deuxième crible a identifié plusieurs déubiquitinases candidates, dont le rôle dans la régulation du trafic intracellulaire du récepteur Notch non activé est en cours de validation.

Au cours de l'endocytose, les cargos de membrane plasmique (PM) sont internalisés puis dirigés vers l'endosome précoce (EE), les corps multivésiculaires (MVBs), puis le lysosome/vacuole pour dégradation. Le ciblage des protéines vers les zones invaginées des MVBs requiert l'action des complexes ESCRTs. Chez la levure comme chez les mammifères, les mutants déficients pour ces complexes présentent un compartiment endosomal anormal (Cl E) et une accumulation à la PM de diverses protéines. Nous avons montré que chez S. cerevisiae la stabilisation de la perméase à uracile (Fur4p) à la PM dans les mutants ESCRTs résulte de son recyclage vers la PM après internalisation. Fur4p ne traverse pas les compartiments Golgiens lors de son recyclage depuis le compartiment Cl E. Cette voie de recyclage est distincte de celle empruntée par la v-SNARE Snc1p. Fur4p est également capable de recycler depuis l'EE et suit alors la même voie de recyclage que Snc1p. Ceci suggère une complexité inattendue des voies de recyclage chez la levure.<br />Nous nous sommes aussi intéressés à Irs4p et Tax4p, 2 protéines à domaine EH, un domaine trouvé jusqu'alors dans des protéines impliquées dans l'endocytose ou le recyclage. Irs4p et Tax4p ne sont pas impliquées dans ces processus mais interviennent de façon redondante au cours de l'autophagie, un transport catabolique vésiculaire de fractions de cytoplasme ou d'organelles vers le lysosome/vacuole. Irs4p et Tax4p interagissent physiquement avec la machinerie d'autophagie et sont partiellement localisées à la structure Pré-autophagosomale, d'où émanent les vésicules d'autophagie. Ces résultats étendent donc la panoplie des fonctions des protéines à domaine EH.

Lors de l'attachement du VIH à la surface d'une cellule, la protéine d'enveloppe gp120 se fixe au récepteur cellulaire CD4, exposant alors son site CD4i qui est alors reconnu par des corécepteurs. Par ailleurs, Le VIH est capable de se fixer aux héparanes sulfate (HS), des polysaccharides présents en abondance à la surface cellulaire, notamment via le site CD4i de gp120 (site de fixation des corécepteurs). Il serait donc possible d'inhiber l'attachement du VIH sur les cellules par l'utilisation de molécules solubles dérivées des HS. Dans ce contexte, nos travaux se sont attachés à définir les aspects structuraux de l'interaction VIH/HS au niveau du site CD4i. Pour cela, des protéines gp120 mutées sur quatre résidus du site CD4i, potentiellement engagés dans la fixation des HS, ont été produites, purifiées et étudiées, par BIAcore, pour leur capacité à interagir avec l'héparine. En parallèle, nous avons développé une méthode simple, permettant d'identifier les régions de fixation à l'héparine d'une protéine donnée. L'ensemble de ces travaux nous a permis d'identifier, au sein de gp120, quatre domaines de liaison à l'héparine et de valider, en particulier, l'engagement de trois résidus du site CD4i (R419, K421 et K432) dans l'interaction avec le polysaccharide. Ces différentes approches ont pour but de clarifier le rôle des HS dans le processus d'attachement du virus à la surface cellulaire et de fournir des informations structurales précises permettant la définition de composés issus des HS capables d'inhiber le mécanisme de l'entrée virale.

Les effluents industriels, agricoles et urbains, chargés en polluants divers, soumettent les écosystèmes marins côtiers à un risque écotoxicologique chronique. Depuis une vingtaine d'années, les effets toxiques des polluants sur le système immunitaire ont été étudiés chez tous les groupes écologiques, notamment chez les bivalves pour caractériser ce risque dans les écosystèmes aquatiques. Pour définir un cadre opérationnel de ces outils immunotoxicologiques, il a fallu d'abord étudier plusieurs questions méthodologiques. Ensuite, il convenait d'étudier l'impact des facteurs endogènes et environnementaux naturels sur le signal immunotoxique généré par un polluant. Dans le cadre d'une collaboration franco-québécoise, un suivi bisannuel, en France (Rade de Brest), chez la moule bleue, Mytilus edulis, et chez l'huître creuse, Crassostrea gigas, a permis de mettre en évidence le rôle critique du sexe et du cycle reproducteur sur les variations saisonnières des paramètres immunitaires, au détriment des paramètres naturels de la colonne d'eau. En parallèle, des séries d'expositions « in tubo » de moules bleues, au Québec, à deux saisons différentes a également mis en évidence le rôle critique du sexe et du cycle reproducteur dans la mesure du signal immunotoxique des xénobiotiques, mais surtout dans la sensibilité immunotoxique. En conclusion, cette recherche a permis de créer un cadre opérationnel d'utilisation des biomarqueurs immunotoxicologiques, pour l'évaluation du risque chimique dans les milieux marins côtiers. Mais ils ont également démontré l'importance capitale des facteurs confondants étudiés pour évaluer, au plus juste, le danger des substances chimiques.

La stéatose hépatique est une pathologie associée à l'obésité et à l'insulinorésistance. Les mécanismes à l'origine du développement de la stéatose hépatique sont loin d'être élucidés. Cependant, une altération de la fonction mitochondriale pourrait contribuer à l'accumulation de lipides dans le foie. Par conséquent, l'objectif de ce travail est d'évaluer la fonction mitochondriale dans deux modèles animaux de stéatose hépatique ainsi que les effets de deux molécules, le rimonabant et le resvératrol. Dans un modèle génétique d'obésité, le rat Zucker, aucune altération de la phosphorylation oxydative n'est observée. Dans un modèle plus physiologique, le rat alimenté avec un régime riche en lipides pendant différentes durées, dans les premiers temps d'un apport accru en lipides, le métabolisme hépatique est orienté de manière à utiliser ou à stocker l'excès de lipides. Cette première adaptation est ensuite inversée et une diminution de l'oxydation des acides gras mais également une diminution du stockage de triglycérides sont observées. Le traitement avec du rimonabant de rats alimentés avec un régime en gras, a un effet bénéfique sur la fonction mitochondriale hépatique notamment en augmentant l'entrée des acides gras dans la mitochondrie et donc leur oxydation. Enfin, le traitement par du resvératrol de cellules HepG2, entraîne une augmentation de la consommation d'oxygène mitochondriale et une augmentation de l'activité du complexe I mais sans modification de la biogenèse mitochondriale. Même si la mitochondrie semble peu affectée au cours du développement de la stéatose hépatique, la considérer comme une cible thérapeutique reste pertinent.

La conservation des ressources génétiques végétales est un défi majeur, le maintien de la biodiversité étant capital pour répondre aux besoins des générations futures. Ce travail de thèse, s'inscrivant dans cette démarche de conservation, a été réalisé sur Pelargonium, plante ornementale multipliée végétativement. Un procédé de cryoconservation d'apex par « dropletvitrification » a été mis en place avec succès sur P. x peltatum ‘Balcon Lilas'. Avec un taux de régénération moyen de 40 % obtenu sur 28 taxons testés, la constitution d'une cryobanque est maintenant possible. L'optimisation de la survie post-cryoconservation passant par une meilleure connaissance des effets des solutions cryoprotectrices sur les cellules, des études microscopiques faisant appel notamment à la RTM (Real Time Microscopy) et la CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) ont été pratiquées. Elles ont permis de mettre en évidence, d'une part que la solution de vitrification (PVS2) provoque une contraction importante et rapide des cellules en agissant sur les parois et d'autre part que la solution de charge (LS), outre son rôle d'osmoticum, atténue les altérations dues à PVS2. Les travaux sur la régénération in vitro à partir d'apex ont montré que celle-ci était le plus souvent directe ce qui peut favoriser le maintien de la conformité. Ainsi, une plante obtenue après régénération d'un apex cryoconservé ou non, ne présente pas de modifications phénotypiques sauf chez certains cultivars chimériques. Enfin, des tests ELISA ont montré une augmentation du taux d'assainissement lors d'une régénération après cryoconservation par rapport à une simple culture d'apex pour deux virus (PFBV et PLPV). Cependant les immunolocalisations réalisées ont mis en évidence que les virus étaient toujours présents dans les apex, l'élimination n'étant que partielle. L'augmentation de ces connaissances devrait permettre une utilisation à plus grande échelle de la cryoconservation participant ainsi à une meilleure gestion de la conservation des ressources génétiques par une offre stratégique plus importante.

La maîtrise des agents de zoonoses alimentaires passe par la mise en œuvre de l'inspection sanitaire en abattoir par les pouvoirs publics. L'avènement du concept d'évaluation scientifique des risques conduit à interroger la pertinence des mesures de maîtrise engagées. La viande de porc étant la première viande consommée en France, la filière porcine constitue un objet d'étude intéressant. Nous avons développé une méthodologie de hiérarchisation des dangers, basée sur le calcul de notes de risque, qui a permis d'identifier les dangers responsables des cas de zoonoses alimentaires les plus fréquent et les plus graves. Ces dangers sont caractérisés par leur faible détectabilité lors d'un examen macroscopique des carcasses de porc à l'abattoir. L'étude de la bibliographie et une étude terrain menée au sein d'un échantillon d'élevages porcins nous ont permis de caractériser le statut de contamination des porcs au niveau de la production primaire et d'identifier des facteurs de risque de présence des dangers. Le suivi longitudinal de lots de porcs de l'élevage à l'abattoir nous a permis de mettre en évidence de fortes disparités de statuts de contamination des carcasses en fonction des outils d'abattage, ainsi que de quantifier le transfert des contaminations de l'animal à la carcasse. La très faible valeur prédictive d'indicateurs post mortem quant au statut de contamination des carcasses a été confirmée. L'ensemble de ces données a permis de modéliser la transmission des dangers de l'élevage à la carcasse et de proposer un schéma de maîtrise fondé sur l'établissement et la combinaison des profils de risque des élevages et des abattoirs.