Lors des pathologies articulaires, les chondrocytes sont soumis à différents processus qui concourent à la dégradation du cartilage articulaire soit en entraînant la mort par apoptose (nonrenouvellement des constituants de la matrice) soit par l’activation de protéases détruisant les constituants matriciels. Le potentiel chondroprotecteur des protéines de stress (Hsp70 / Hsp27) lors des pathologies dégénératives ayant été démontré, nous avons souhaité évaluer l'intérêt thérapeutique de l’induction de ces protéines par un inhibiteur réversible du protéasome (MG132) dans un modèle expérimental : modèle par section du ligament croisé antérieur (SLCA). Au cours de cette étude, nous avons du évaluer un nouveau système de vectorisation afin de surexprimer les protéines de stress dans le cartilage articulaire. Cette technique (électroporation biphasique) repose sur la dissociation des impulsions perméabilisantes et électrophorétiques. Nous avons donc développé des plasmides nous permettant de surexprimer ces protéines, fusionnées à une protéine traceur, facilitant ainsi leur détection dans le tissu ciblé. Puis, nous avons évalué l’innocuité et l’efficacité des impulsions sur des tissus sains et pathologiques (dégénératifs et inflammatoires). Nous avons constaté que cette technique, en plus de limiter les altérations du tissu articulaire ou les phénomènes de dissémination, offrait des propriétés d’adressage tissulaire de part la multiplicité des combinaisons d’impulsions (nombre, fréquence et intensité). Enfin, les effets de l’induction (MG132) des Hsps sur un modèle physiopathologique (SLCA) ont été évalués et nous avons pu montrer une diminution de la sévérité des atteintes articulaires, tant au niveau du cartilage que de la membrane synoviale. Cette molécule non seulement permet à la fois de renforcer la résistance des chondrocytes aux atteintes mais également de limiter l’amplitude de la réponse inflammatoire qui participe à la dégradation. / During articular diseases, chondrocytes suffer different mechanisms which take part in the degradation of the cartilage, either by generating cell death by apoptosis (without renewal of extracellular matrix components), or by protease activation which destroy matrix components. Based on the cytoprotective potential of Heat Shock proteins (Hsp70 and Hsp27) during degenerative diseases, we evaluated the therapeutic interest of these proteins induced by a transient proteasome inhibitor (MG132), in an experimental model, by transection of the anterior cruciate ligament (ACLT). During this study, we have evaluated a new electroporation system to overexpress HSPs in articular cartilage. This technique is based on two sets of electric pulses, wich have two roles, to permeabilize the target and to transport DNA across the permeabilized membrane. We have developed expression vectors to generate a fusion protein (Hsps linked to GFP). Effectively, GFP permit to detect simply the fusion protein in the targeted tissue by fluorescence. Besides, we have evaluated safety and efficiency of electric pulses on healthy and alterated tissues (degenerative and inflammatory). We have reported that this technique could limit articular tissue damages and, moreover, could offer the ability to target more specifically this tissue. Indeed, this apparatus allows a great number of electrics pulses combinations (number, frequency, intensity). Finally, the effects of the induction via MG132 of Hsps in a physiopathological ACLT model, have been evaluated and we have shown a decrease of severity of joint lesions, in cartilage and synovial tissues. This molecule has the advantage to reinforce the resistance of chondrocytes at stressful stimuli and moreover, to limite the amplitude of inflammatory response which contribute to the magnification of extracellular matrix destruction.

L'endothéline (ET-1) est un puissant vasoconstricteur constitué de 21 acides aminés et de deux ponts disulfures intramoléculaires qui provient d'un précurseur prépro-ET, composé de 212 acides aminés.L'hydrolyse de ce précurseur par des peptidases conduit à la Big-ET-1, peptide de 38 acides aminés. A ce jour, il existe deux voies de synthèses distinctes de l'ET-1 à partir de la Big-ET-1. La voie classique de conversion de la Big-ET1 en ET-1 se produit via l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE). Une seconde voie alternative via la chymase mMCP-4, une protéase à sérine, produit un intermédiaire de 31 acides aminés, l'ET-1 (1-31), à partir de la Big-ET-1. Par la suite, l'ET-1 (1-31) subit une hydrolyse pour former l'ET-1 par l'endopeptidase neutre (NEP). Les souris dont le gène mMCP-4 a été supprimé devraient montrer une capacité moindre à convertir la Big-ET-1 en ET-1 (1-31). Le but principal de ce mémoire est d'identifier la contribution de la mMCP-4 dans la conversion de la Big-ET-1 en ET-1 (1-31). L'activité spécifique de la chymotrypsine a été déterminée par des essais fluorogénique in vitro dans les fractions solubles des différents organes tels que, le ventricule gauche cardiaque, les poumons, l'aorte, le cortex rénal et la médulla rénale. Cette activité a été diminuée d'une manière significative dans les fractions solubles des tissus de souris mMCP-4 K.O. en comparant à celles de souris de type sauvage. De plus, l'activité spécifique de la chymase a été diminuée d'une manière significative en présence d'un inhibiteur spécifique, le TY-51469, chez la souris de type sauvage. Par ailleurs, son effet est absent chez la souris mMCP-4 K.O., suggérant ainsi que cet inhibiteur est sélectif pour l'activité de la chymase. Des analyses d'HPLC couplés à la spectrométrie de masse (MS), ont permis de montrer une conversion de la Big-ET-1 en ET-1 (1-31) par la chymase dans les fractions solubles des tissus de souris de type sauvage. Cette conversion a été abolie dans les fractions des tissus de souris de type sauvage prétraités au TY-51469, confirmant ainsi le rôle de la chymase dans la conversion de la Big-ET-1 en ET-1 (1-31). Ces résultats ont été confirmés par l'absence de conversion de la Big-ET-1 en ET-1 (1-31) dans les fractions solubles des tissus de souris mMCP-4 K.O. Notre étude a permis de confirmer la conversion de la Big-ET-1 en ET-1 (1-31) par la mMCP-4 via la voie alternative dépendante de la chymase chez la souris de type sauvage in vitro .

La tique est un parasite hématophage obligatoire dont le succès du repas sanguin requiert l’inhibition des principales voies de défense de l’hôte. Parmi ces mécanismes, on retrouve les réponses immunes innées et acquises, qui utilisent toutes deux le système du complément comme mécanisme effecteur. Le complément, constitué d’une trentaine de protéines intervient dans la lyse et l’opsonisation des pathogènes, dans l’initiation de la réponse inflammatoire mais également dans certaines pathologies lorsqu’une régulation efficace fait défaut. Une activité inhibitrice avait ainsi déjà été détectée dans des extraits de glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus, principal vecteur de la maladie de Lyme en Europe, mais sans pour autant qu’une protéine ne soit mise en évidence. Le Laboratoire de Biologie Moléculaire des Ectoparasites a cependant identifié une famille multigénique de 7 protéines, appelées protéines IxACs, qui inhibent de manière spécifique la voie alternative du complément. Nous avons découvert que ces protéines agissent en se liant de manière spécifique à la properdine, un facteur stabilisateur de la C3 convertase, complexe clé dans la cascade du complément. L’objectif de ce travail fut d'étudier le mécanisme d’action de ces protéines, ainsi que leur rôle potentiel en tant qu’outil thérapeutique dans certaines maladies auto-immunes. Les protéines IxACs agissent toutes comme compétiteurs directs du facteur C3b pour la liaison à la properdine et ne semblent pas montrer de diversité de mécanisme d’action ni de sites de liaison différents. Nous avons montré que les protéines IxACs lient la properdine via une hélice alpha d’une dizaine d’acides aminés située dans leur domaine N-terminale, et homologue au domaine de liaison à la properdine du C3b. Cette interaction dépend directement de deux tyrosines présentes au sein de cette hélice, et intervient au niveau du domaine TSR5 de la properdine. Des expériences utilisant un peptide correspondant à l’hélice alpha des protéines IxACs ainsi que des expériences de mutagenèse dirigée nous ont permis de confirmer cette interaction mais aussi de montrer qu’une autre région des protéines IxACs, encore inconnue, interagiraient avec le domaine TSR4 de la properdine et serait nécessaire à l’activité inhibitrice de ces protéines. Nous avons également utilisé les protéines IxACs dans un modèle d’ischémie/reperfusion rénale, dans lequel la voie alternative du complément est directement impliquée. Nous avons mis en évidence que les protéines IxACs administrées à des souris entraînent une diminution du taux de créatinine dans le sang après ischémie/reperfusion, ce taux étant un indice direct de la souffrance rénale. Leur rôle potentiel en tant qu’outil thérapeutique est cependant encore à approfondir.

Malgré les progrès considérables qui ont été réalisés depuis une trentaine d'années, le cancer demeure un ennemi redoutable. Néanmoins, de nombreuses études épidémiologiques ont montré qu'une alimentation riche en fruits et légumes réduit les risques de développer le cancer. Nous savons également que l'angiogenèse, ou la formation de nouveaux vaisseaux à partir de capillaires préexistants, joue un rôle crucial dans la croissance des tumeurs et dans leur dissémination sous forme de métastases. En conséquence, l'objectif de ce projet est de caractériser les effets antiangiogéniques d'une famille de composés omniprésents dans notre alimentation, les flavonoides, en particulier, les flavonols, kaempférol et myricétine, et les flavones, lutéoline et apigénine. Pour y parvenir, nous avons d'abord procédé à des tests de migration cellulaire et d'invasion de Matrigel™ en chambre de Boyden à l'aide de cellules musculaires lisses d'artère pulmonaire (PASMCs). Les données obtenues montrent qu'apigénine, lutéoline el myricétine inhibent grandement la migration et l'invasion cellulaire, et que les niveaux d'inhibition sont comparables à ceux observés avec des médicaments synthétiques. Ensuite, nous avons réalisé des études de marqueurs moléculaires tels que la phosphorylation du récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR-β), de la protéine kinase régulatrice des signaux extracellulaires (ERK) et de la protéine Akt, el ce, toujours avec des PASMCs. L'inhibition de la phosphorylation du récepteur PDGFR-β, de la protéine ERK et Akt par I'apigénine et la lutéoline a également été observée. Nous nous sommes également assurés que les effets observés n'étaient pas dus à la toxicité des molécules étudiées en effectuant des tests de viabilité cellulaire au bleu de trypan. Nous avons poursuivi en analysant la sécrétion de la proMMP-2 et du VEGF par les PASMCs lorsqu'elles sont stimulées au PDGF-BB. Les résultats obtenus montrent que la sécrétion de VEGF est inhibée par les flavones alors que seule la lutéoline affecte la sécrétion de la proMMP-2. Finalement, nous avons réalisé des études in vivo sur un modèle animal de souris immunosupprimées, soit des souris CrI:CDl® Foxnlnu. Ce modèle a permis de mettre en lumière le potentiel antiangiogénique in vivo des flavones. En somme, tous les résultats obtenus in vivo et in vitro indiquent que les flavones, lutéoline et apigénine. ont un fort potentiel antiangiogénigue. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cancer, Angiogenèse, Flavonoïdes, Cellules musculaires lisses, PDGFR.

Cet ouvrage présente la synthèse d'analogues du L-fucose comme inhibiteur de l'adhésion de la bactérie Pseudomonas aeruginosa (PA), dont la colonisation des poumons est mortelle chez les patients atteints de fibrose kystique. Ces dérivés fucosides devaient être reconnus de la PA-IlL, une lectine produite par la bactérie, ce qui leur permettra d'empêcher l'adhésion de P. aeruginosa aux poumons des patients atteints de la maladie. La préparation de O-, C-, N- et S-α-L-fucosides a été effectuée principalement à partir des réactions de O-glycosylation, de 'Click Chemistry' et de cycloadditions 1,3-dipolaires. La synthèse des dérivés α-L-fucosides a été réalisée en peu d'étapes, avec de bons rendements et avec un contrôle sur la configuration anomérique, ce qui a permis le développement de nouvelles méthodologies de synthèse sur des glycomimétiques. Le design rationnel de nos analogues fucosides se base sur des images cristallographiques présentant les interactions entre la PA-IlL et son ligand naturel le L-fucose. Une image cristallographique du complexe formé par un fucoside synthétique (composé 57) et la PA-IlL, a même pu être obtenue nous fournissant ainsi des informations supplémentaires. C'est à partir de ces nouvelles données qu'une exploration du pharmacophore de ce fucoside a été effectuée. L'insertion de pharmacophores en position C-6 du L-fucose a également été effectuée. La synthèse du 6,7,8-trideoxy-L-galacto-oct-7-enose a été réalisée avec un bon rendement global par le Dr. Karine Marotte. La fonction allyle en position C-6 a ainsi pu être fonctionnalisée par les réactions de métathèse croisée et de dihydroxylation asymétrique. Un homologue du L-galactose a également été préparé en deux étapes. Des résultats préliminaires en inhibition compétitive (tests ELLA) ont démontré que la lectine PA-IlL pouvait avoir une affinité 14 fois plus élevée pour certains de nos analogues, qu'elle en avait pour le fucose présent chez le trisaccharide Lewis a, le ligand naturel présumé de la bactérie. Les trois composés ayant démontré le meilleur potentiel d'inhibition sont des fucosides possédant des pharmacophores de type triazole et isoxazole. De tels agents anti-adhésion pourraient représenter une thérapie alternative ou un complémentaire aux antibiotiques dans le traitement d'infections mortelles.

Le nonylphénol (4-n-nonylphénol) et le bisphénol A (4,4'isopropylidène-2-diphénol) sont des perturbateurs endocriniens qui ont été détectés dans des échantillons de sang, d'urine, de tissus adipeux et de lait humain. Ces molécules sont biotransformées en métabolites non-toxiques par un processus de glucuronidation. Plusieurs facteurs, incluant la co-exposition avec d'autres xénobiotiques, sont susceptibles de réduire les taux de glucuronidation. Les objectifs de cette étude étaient d'identifier et de caractériser l'impact de 14 médicaments dont la consommation est répandue sur la biotransformation de ces perturbateurs endocriniens. L'identification des interactions a été effectuée en co-incubant des hépatocytes de rat fraîchement isolés avec du nonylphénol ou du bisphénol A, et des médicaments à une concentration 50 fois plus élevée que la concentration maximale (Cmax) reportée chez l'humain suite à une dose thérapeutique. Une inhibition de la biotransformation des polluants a été observée avec la plupart des médicaments. Le naproxène (18,7 mM), l'acide salicylique (24,5 mM), la carbamazépine (1,9 mM) et l'acide méfénamique (1,45 mM) ont inhibé le métabolisme du nonylphénol et du bisphénol A à plus de 50% dans les suspensions d'hépatocytes. La caractérisation des inhibitions observées avec le naproxène, l'acide salicylique et la carbamazépine a été tentée à l'aide de microsomes hépatiques de rat. Le naproxène et la carbamazépine ont inhibé compétitivement la glucuronidation du nonylphénol et du bisphénol A. L'acide salicylique n'a montré aucune inhibition des taux de glucuronidation à une concentration de 1000 µM, suggérant ainsi que d'autres mécanismes d'action sont impliqués dans l'inhibition observée dans les hépatocytes. Des simulations effectuées à l'aide d'un modèle pharmacocinétique à base physiologique ont démontré que des niveaux thérapeutiques de naproxène peuvent entraîner une hausse du Cmax et de l'aire sous la courbe de la concentration de bisphénol A chez l'humain d'environ 1,8 fois (en assumant un Ki similaire chez le rat et l'humain). En conlusion, cette étude démontre que plusieurs médicaments peuvent inhiber la détoxication de polluants comme le nonylphénol et le bisphénol A. L'analyse de risque pour les polluants environnementaux doit donc prendre en compte la consommation de médicaments comme facteur pouvant hausser les niveaux internes pour une exposition donnée. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Nonylphénol, Bisphénol A, Médicaments, Biotransformation, Modélisation pharmacocinétique à base physiologique, Interactions.

Le paludisme, une maladie inflammatoire, est caractérisé par une production du facteur de nécrose tumoral (TNF)-α, du facteur d'inhibition de migration des macrophages (MlF) et d'interféron (lFN)-y, qui inhibent les précurseurs érythropoïétiques de la moelle osseuse. Dans ce contexte, le MlF est sécrété durant les infections par Plasmodium, et sa synergie avec l'lFN-y et le TNF-α contribue à inhiber la différenciation érythropoïétiques et la production d'hémoglobine (Hb). Cet travail à démontrer que la neutralisation in vivo du MlF avec un anticorps monoclonal durant l'infection par Plasmodium chabaudi adami DK amène à une diminution du pic de la parasitémie et de façon inattendue à une production accrue de TNF-α en début d'infection et au pic d'infection. La neutralisation du MlF altère la production d'IFN-y et l'IL-10 durant l'infection. Au moment où la parasitémie est faible, une diminution significative de la production d'lFN-y, accompagnée par une chute importante de l'IL-10, est observée dans la rate de souris infectées et traitées avec l'anti-MIF. Par contre, au pic de l'infection, la production de l'IFN-y et l'IL-10 augmente chez les souris traitées avec l'anti-MIF. En plus de ces effets inhibiteurs au pic de l'infection, la neutralisation du MlF entraîne une diminution du pourcentage de réticulocytes en circulation en début d'infection et cet effet est accompagné par une légère diminution des érythrocytes basophiliques (EryA) dans la rate. La concentration d'hémoglobine sanguine était plus élevée chez les souris traitées avec l'anticorps anti-MIF, et ce, au pic de l'infection, ce qui suggère que la neutralisation du MlF, par son effet sur la parasitémie, diminue la destruction des érythrocytes par le parasite. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Paludisme, Hémoglobine, Cytokine inflammatoire, MlF, Parasitémie.

Les progrès considérables effectués durant les trente dernières années permettent de guérir actuellement plus de 75% des enfants atteints d’un cancer. Néanmoins, certains types de tumeur, comme les gliomes de haut grade et les neuroblastomes métastatiques des enfants de plus de un an, gardent un pronostic particulièrement sombre. De nouvelles stratégies thérapeutiques doivent donc être développées dans ces indications. Dans cette optique, nous avons étudié les effets de deux nouvelles molécules ciblées, le cilengitide, inhibiteur des intégrines αvβ3 et αvβ5, et le F14512, inhibiteur de la topoisomérase II dont la délivrance est vectorisée via le système de transport des polyamines, sur des modèles précliniques de gliomes pédiatriques et de neuroblastomes.Nous avons montré pour la première fois l’existence d’une expression variable d’αvβ3 et αvβ5 dans nos modèles de lignées cellulaires pédiatriques, peu modifiée par les radiations ionisantes. Le traitement par cilengitide a entraîné une inhibition dose-dépendante de la croissance des cellules exprimant αvβ3, liée à un rapide détachement cellulaire et à une sensibilité à l’anoïkis. Cette inhibition de croissance et le détachement cellulaire n’étaient pas corrélés au niveau d’expression des intégrines αvβ3 et αvβ5. Néanmoins, nos travaux semblent montrer que la cible principale du cilengitide est l’intégrine αvβ3. Le traitement par radiations ionisantes n’a pas modifié le détachement induit par le cilengitide dans nos modèles.Nous avons également mis en évidence une activité du système de transport des polyamines dans nos modèles, permettant ainsi une incorporation active du F14512 dans nos cellules de neuroblastomes. Nous avons montré une supériorité de la cytotoxicité du F14512 par rapport à l’étoposide in vitro, et son effet antitumoral a été démontré sur un modèle in vivo. Ces résultats, ainsi que l’effet globalement synergique de l’association du F14512 avec les sels de platine, sont de solides arguments pour poursuivre le développement de cette molécule, en phase clinique chez les patients atteints d’un neuroblastome. Par ailleurs, d’autres investigations pourraient être envisagées dans d’autres types tumoraux dans lesquels l’étoposide occupe une place importante. L’effet radiosensibilisant du F14512 pourrait dans ce cadre ouvrir des perspectives dans la prise en charge des médulloblastomes.[...] / Despite the progress made during the past thirty years leading to cure about 75% of children with cancer, the prognosis of high-grade gliomas (HGG) in children and metastatic neuroblastoma remains poor. The aim of the thesis was to study in vitro the mechanisms of action of a novel inhibitor of αvβ3 and αvβ5 integrins, so-called cilengitide , and of a new topoisomerase II inhibitor targeting the polyamine transport system (PTS), so-called F14512, used as a single drug or in combination therapy in neuroblastoma and pediatric gliomas cell lines. Our panel of cell lines included three pediatric HGG, 2 low-grade pediatric glioma and four neuroblastoma cell lines as well as one adult HGG cell line. The first part of the work involved cilengitide, and was based on clinical and preclinical data previously obtained in adult glioblastoma. There was no data concerning the effect of cilengitide on pediatric HGG or neuroblastoma cells nor about its use in combination with radiation therapy in children. Similarly, no data were available about the level of expression of αvβ3 and αvβ5 integrins on the surface of glioma and pediatric neuroblastoma cells. We showed by flow cytometry significant and various αvβ3 and αvβ5 integrin expression levels in our four neuroblastomas and in most of glioma cell lines. Those expression levels were unrelated to tumor grade. UW479 cells expressed only αvβ5 integrin and therefore served as a negative control. Irradiation of glioma cells slightly increased αvβ3 expression in SF188, KNS42 and Res259 cell lines without inducing de novo integrin expression in UW479 cells. Cilengitide treatment resulted in a dose-dependent inhibition of cell growth leading to obtain an IC50 in the three cell lines tested. UW479 cells were not sensitive to Cilengitide, suggesting that Cilengitide’s action largely depends on αvβ3 inhibition. It was not possible to determine an IC50 value in the adult prototypical U87MG cell line.Cilengitide treatment resulted in a rapid and dose -dependent detachment of more than 50% of our cells expressing αvβ3 when cultured in adherent conditions on vitronectin, which is a specific matrix of integrins, whereas it remained without effect when the cells were grown on collagen, a nonspecific matrix. The growth inhibition induced by cilengitide was comparable to that observed when cells were seeded on polyHEMA gel in physically non-adherent conditions. Not surprisingly, the cilengitide induced no detachment of UW479 cells regardless of the matrix used. In contrast, cell viability assays showed a strong growth inhibition when these cells were seeded on polyHEMA gel. Interestingly, U87MG cells remained able to grow despite a strong detachment induced by cilengitide, suggesting a resistance to anoikis. Finally, inhibition of cell growth induced by cilengitide seemed only linked to cell detachment and corresponded to cell death by anoikis. These inhibitions of cell detachment and cell growth were not correlated with the levels of expression of integrins [...].

La granulatimide et l'isogranulatimide sont deux alcaloïdes marins de structure imidazo[4,5a]pyrrolo[3,4- c]carbazole décrits comme inhibiteurs du checkpoint G2 agissent spécifiquement sur la checkpoint kinase 1. De tels inhibiteurs utilisés en association avec un génotoxique pourraient potentialiser l'action de celui-ci permettant ainsi d'en réduire les doses et de diminuer ses effets secondaires. Deux types d'analogues inhibiteurs potentiels du checkpoint G2 ont été étudiés. Le premier correspond à une structure pentacyclique diversement substituées au niveau du cycle indole dans laquelle le cycle imidazole a été remplacé par un cycle pyrrole ou pyrazole et. Le second type est une structure tetracyclique ou le noyau indole a été substitué par un cyclopentène. Les différents composés, préparés en adaptant des méthodes de la littérature, ont été évalués autant d'un point de vue de leur cytotoxicité que d'un point de vue de leur inhibition du checkpoint G2.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.