Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La MAPK p38α est une protéine clé de l’inflammation, également impliquée dans de nombreux processus liés au cancer. Les petites molécules chimiques inhibitrices de p38α bloquent son activité kinase par un mécanisme de compétition à l’ATP. En raison de la grande conservation du domaine kinase, la spécificité de la majorité de ces inhibiteurs n’est pas restreinte à la p38α et des effets « off-targets » ont été rapportés. Dans ce contexte, le projet de ma thèse a porté sur l’utilisation de fragments d’anticorps au format scFv comme nouvel outil de ciblage pharmacologique afin de définir une/des voie(s) alternative(s) d’inhibition de la p38α. Les fragments d’anticorps lient un motif antigénique avec une affinité et une spécificité élevées, tout comme les immunoglobulines classiques. Leur expression intracellulaire permet également le ciblage de protéines cytoplasmiques et l’étude de leurs fonctions dans des processus physiologiques et pathologiques. Nous avons sélectionné par phage display, à partir d’une banque de fragments d’anticorps, 5 scFv spécifiques de la MAPK p38α. Alors que tous ces scFv empêchent l’activation par phosphorylation de la p38α par MKK6, l’un d’entre eux agit directement sur l’enzyme pour inhiber totalement son activité kinase in vitro. Ce scFv possède un site de liaison et un mécanisme d’inhibition distincts des inhibiteurs pharmacologiques déjà décrits : bien qu’il ne cible pas le domaine kinase et n’empêche pas la fixation de l’ATP, le scFv se comporte comme un inhibiteur compétitif de l’hydrolyse de l’ATP. Ces résultats suggèrent un effet allostérique du scFv sur l’activité de la p38α et permettent de le caractériser comme un inhibiteur compétitif non conventionnel. La détermination de son épitope d‘interaction ainsi que la confirmation de sa fonctionnalité une fois exprimé dans le cytosol des cellules nous permettra de définir une voie alternative d'inhibition de la p38α et de valider notre approche de ciblage par l’utilisation de fragments d’anticorps.Ces données ouvrent de nouvelles perspectives de design d’inhibiteurs chimiques de la p38α de meilleure spécificité que ceux actuellement disponibles. / MAPK p38α is a key protein in inflammation, but is also involved in many cancer-related processes. All the currently described chemical inhibitors of p38α inhibit its kinase activity by an ATP-competitive mechanism. Because of the high conservation of the ATP-binding pocket, the majority of these inhibitors are not specific to p38α and off-target effects have been reported. To identify alternative approaches to inhibit p38α MAPK, my thesis project focused on the use of scFv antibody fragments as a new highly specific pharmacological tool.Antibody fragments bind to an antigen with high affinity and specificity like conventional immunoglobulins. Their intracellular expression also allows to target cytoplasmic proteins and study the target functions in physiological and pathological processes. Using a naïve library of antibody fragments, we have selected by phage display five scFv specific of MAPK p38α isoform. While all these scFv inhibit the activation of p38α by MMK6, one of them also completely inhibits its kinase activity in vitro. This scFv has a binding site and a mechanism of inhibition distinct from the pharmacological inhibitors currently described: although it does not target the ATP-binding pocket and does not prevent ATP binding, it behaves like a competitive inhibitor of ATP hydrolysis. These results suggest an allosteric effect of this scFv on p38α activity and allow to characterize it as an unconventional competitive inhibitor. The determination of its epitope as well as the confirmation of its inhibitory activity once expressed in the cell cytosol will allow us to propose an alternative approach to target p38α function using antibody fragments.These data open up new perspectives for the design of more specific p38α chemical inhibitors than those currently available.

Le mésothéliome pleural est un cancer de la plèvre provoqué principalement par linhalation de fibres damiante. Nous avons émis lhypothèse que la dérégulation de lexpression génique est un paramètre important du développement de cette maladie. Or, les histones désacétylases (HDACs) peuvent jouer le rôle de répresseur transcriptionnel en modifiant la conformation de la chromatine. Dans ce contexte, nous avons étudié lactivité anticancéreuse du valproate, un inhibiteur dHDAC, en combinaison avec différents types de traitements utilisés en chimiothérapie. Nous avons démontré leffet synergique entre la chimiothérapie et le valproate dans des lignées cellulaires et dans des biopsies isolées à partir de patients. Nous avons étudié les processus impliqués dans lapoptose et révélé limplication des caspases, des espèces oxygéno-réactives et le rôle important de la protéine Bid. Nous avons ensuite réalisé une étude transcriptomique par microdamiers dans le but de mieux caractériser les mécanismes impliqués. Enfin, nous avons démontré lefficacité du valproate dans un modèle préclinique murin. Ces recherches ont permis la mise en place dun essai clinique de deuxième ligne sur des patients réfractaires à une première chimiothérapie.

Dérivé des deux termes grecs « anti » et «biotikos », le terme antibiotique signifie « contre la vie ». Les antibiotiques attaquent et détruisent les bactéries vivantes et les empêchent de se multiplier dans l'organisme humain. Depuis leur première utilisation, tout un arsenal d'antibiotiques a été développé pour le traitement de diverses infections chez l'humain. L'utilisation à profusion, et dans certains cas à outrance des antibiotiques pour le traitement des infections microbiennes, a permis à certaines souches bactériennes d'acquérir une résistance à ces médicaments. Dans cette optique une alternative aux antibiotiques s'impose de plus en plus. La première étape de nombreuses infections bactériennes est la colonisation des surfaces épithéliale de l'hôte. L'adhésion est médiée par des structures présentes à la surface de la cellule bactérienne, appelées adhésines, qui interagissent avec des composants présents à la surface de la cellule hôte ou à hauteur de la matrice extra-cellulaire, appelés récepteurs. Les lectines sont les adhésines bactériennes les plus étudiées. De nature protéique, elles ont été classées en différents groupes sur la base de leurs propriétés d'hémagglutination, leurs ultrastructures et leurs spécificités de récepteurs. Les lectines du premier groupe sont responsables d'hémagglutination sensible au mannose et présentent une structure de nature fimbriaire (fimbriae de type 1, FimH). Les futures stratégies thérapeutiques résident probablement dans l'utilisation de diverses adhésines, comme cibles thérapeutiques ou comme porteur d'épitopes étrangers, afin de produire des anticorps contre différents facteurs de virulence. Utilisant de nouvelles méthodes de C-glycosidations combinées à la 'click chemistry' une série de C-mannosides a été synthétisée. Le potentiel d'inhibition de l'adhésion du FimH de ses glycomimétiques apportera de précieuses informations dans le cadre d'une grande étude relation-structure-activité (QSAR). ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Antibiotique, Adhésion, Lectine, FimH, C-glycosidation, Click chemistry.

Les galectines sont une famille de protéines cytosoliques possédant au moins un domaine de reconnaissance du carbohydrate (CRD) d'environ 130 acides aminés lui conférant une affinité particulière pour les β-D-galactosides. Parmi les quinze membres identifiés à ce jour chez les mammifères, la galectine-3 est unique avec un seul domaine se terminant par une chaîne peptidique capable de s'auto-associer. Alors que le rôle des galectines n'a pas été encore clairement identifié, elles semblent être impliquées dans un vaste champ d'activités biologiques allant de l'adhésion cellulaire à la réponse immunitaire et inflammatoire, ainsi qu'à l'induction de signaux. Des études récentes montrent l'implication de la galectine-3 dans la progression des tumeurs cérébrales et du colon. Ainsi, une inhibition sélective de celle-ci pourrait mener à des traitements anti-cancer et anti-métastasique. Dans le but de préparer des molécules de haute affinité pour la galectine-3, nous avons fait la synthèse de galactosides comportant des pharmacophores en position anomérique et 0-3. La catalyse par transfert de phase a permis l'insertion de thiophényles carboxyliques en position anomérique et la chimie de l'étain celle de fonctions propargyle et allyle en position 0-3 du galactose. La formation régiosélective de cycles triazoles catalysée par le cuivre, ainsi que l'utilisation de couplages peptidiques avec une variété d'amines, a permis de produire une famille de galactosides modifiés en position 0-3 et contenant divers autres pharmacophores en position anomérique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Galectines, Galectine-3, Chimie médicinale, Cancer, D-galactose, Glycosidation, Click chemistry, Métathèse croisée, Couplage peptidique, Alkylation régiosélective, Catalyse par transfert de phase.

Les analogues de nucléosides font partie de l'arsenal contre le cancer, principale cause de décès au pays. Ces dérivés synthétiques, qui empêchent la prolifération des cellules malignes via l'inhibition d'enzymes (ex. : kinases et polymérases) impliquées dans la réplication de l'ADN, possèdent une courte demi-vie in vivo. Notamment, les phosphorylases clivent facilement le lien N-glycosidique. Un autre obstacle que rencontrent les analogues est la compétition que leur livrent les nucléosides naturels. Le mémoire porte sur des améliorations à 2 niveaux: la synthèse d'analogues stabilisés et la synthèse d'inhibiteurs de la biosynthèse des nucléosides puriques. Pour la première partie, la préparation de composés ayant un méthylène entre les sous-unités furannose et base nucléique, appelés l'-homonucléosides, pourrait réduire l'instabilité métabolique. Aucune méthode stéréosélective n'existe pour préparer ces composés. La synthèse de l'-homocarbanucléosides a été amorcée, de façon stéréosélective, à partir du cycloadduit de Diels-Alder [4+2] endo issu du cyclopentadiène et de l'acrylate de méthyle. Ensuite, l'ozonolyse de l'alcène et la réduction in situ du dialdéhyde intermédiaire ont produit un diol, duquel un des hydroxyles a réagi par lactonisation sélective avec l'ester provenant du diénophile. L'autre hydroxyle (position 5') a été protégé sous forme d'éther silylé. Pour compléter la synthèse de l '-homocarbanucléosides, il fallait régénérer l'hydroxyle impliqué dans la lactone et l'activer pour faire le couplage avec une base nucléique. La lactone a donc été aminolysée mais il a été impossible d'isoler le mésylate dérivé de l'hydoxyamide obtenu. Alternativement, la lactone a été réduite en lactol, qui a été impliqué dans une réaction de Wittig, libérant ainsi l'alcool en position l'-homo, qui a été activé sous forme de sulfonate. Diverses tentatives de couplage entre cet intermédiaire et la thymine sont restées sans succès jusqu'à maintenant. Pour la deuxième partie du mémoire, la préparation d'inhibiteurs bifonctionnels de l'enzyme amidophosphoribosyltransférase (APRT), mimant à la fois le ribose et la glutamine, a été envisagée. La stéréochimie l,4-cis des dérivés tétrahydrofuranés serait assurée par une cycloaddition [4+2] impliquant un vinylphosphonate comme diénophile et le 3-méthoxyfurane comme diène. La préparation de ce dernier a été tentée de différentes manières. Deux méthodes connues de la littérature ont échoué. Une troisième méthode a été tentée, impliquant une cycloaddition [4+2] entre le furane et l'anhydride maléique, une éthérification suivie d'une rétrocycloaddition [4+2]. Après avoir rencontré de nombreuses difficultés, nous avons exploré la possibilité de synthétiser un intermédiaire requis pour les inhibiteurs, mais excluant le 3-méthoxyfurane. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Analogue de nucléosides, Nucléosides, L'-homonucléosides, Cycloaddition de Diels-Alder, Inhibiteurs bifonctionnels, Enzyme APRT, 3- méthoxyfurane.

Les infections urinaires (UTI) sont la forme la plus courante des infections extra-intestinales causées dans 90 % des cas par la bactérie Escherichia coli. Plus de 100 000 personnes sont hospitalisées chaque année aux États-Unis en raison de complications rénales avec des risques de septicémies. La gestion des infections urinaires (UTIs) repose depuis longtemps sur le principe de la thérapie par les antibiotiques. Généralement ces derniers détruisent les bactéries en s'attaquant à leur structure cellulaire et en interférant profondément le cycle cellulaire normal. De ce fait, ces infections bactériennes deviennent une grande problématique au niveau mondial. La surconsommation et la mauvaise utilisation d'antibiotiques ont involontairement produit de nouvelles souches de bactéries résistantes qui ont développé des stratégies de défenses vis-à-vis de ces médicaments et qui peuvent donner naissance à des infections non traitables pouvant mener à la mort. Une nouvelle thérapie serait de mise pour l'éradication de ce phénomène en contre-carrant cette résistance par l'inhibition du premier contact entre la bactérie et les cellules et représenterait une alternative séduisante. L'adhésion bactérienne médiée par les interactions multivalentes protéines-glucides constitue le premier événement de l'infection à la surface urothéliale. La bactérie E. coli comportant des lectines Fim H comme protéines de surface sur leurs pili ne déroge pas à cette règle en se liant spécifiquement aux α-D-mannosydes des récepteurs d'uroplakines pour adhérer aux cellules urothéliales. Considérant l'importance de ce phénomène, notre travail s'est porté sur la synthèse de macromolécules glycosylées servant de mimétiques multivalents. Ces inhibiteurs synthétiques potentiels de l'adhésion bactérienne ont pu être obtenus de façon monodisperse, avec une valence controlée, sous la forme de «glycoclusters» ou «glycodendrimères». En effet, les dendrimères sont des macromolécules très bien définies avec une uniformité et une symétrie pouvant offrir une grande surface fonctionnelle multivalente. Concernant l'approche synthétique, la voie divergente a été empruntée, partant du coeur pour aboutir à des terminaisons fonctionnelles à la surface. Cette croissance dendritique a pu être développée et contrôlée avec l'utilisation d'éléments branchés de type aliphatique ou aromatique en utilisant des réactions efficaces de substitution nucléophile, de couplage peptidique, et de diazotransfert. La fonctionnalisation des dendrimères exhibant des épitopes a été effectuée avec la chimie « click » (ou CuAAc) sur trois dérivés mannosylés différents contenant les fonctions chimiques complémentaires requises. Ainsi, ces structures multivalentes mannosylées ont été synthétisées avec de hauts rendements, avec une variété architecturale controlée dont l'influence a été appréciée lors des investigations biologiques. Dans ce contexte, leur potentiel en tant que ligands synthétiques a été évalué par des tests préliminaires de turbidimétrie avec la lectine végétale Con A et des investigations plus avancées impliquant des tests d'inhibition sur des cellules cancéreuses U87 et des bactéries E. coli. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : E. coli uropathogénique, UTI, Anti-adhésines, Inhibition de l'adhésion bactérienne, Fim H, Mannosides, Multivalence, Glycoclusters, Glycodendrimères, Couplage pepridique, Diazotransfert, Chimie click, Tests d'inhibition d'hémagglutination, FACS.

Le facteur d'inhibition de la migration des macrophages (MIF) joue un rôle important dans la régulation du système immunitaire inné et adaptatif. Le MIF est impliqué dans plusieurs maladies inflammatoires chroniques dû à sa capacité à induire la sécrétion du facteur nécrosant tumoral (TNF-a) et de l'interleukine-12 (IL-12), en plus de favoriser l'expression des récepteurs de type Toll (TLR) 4 chez les macrophages. Paradoxalement, la neutralisation du MIF augmente l'activation des lymphocytes T cytotoxiques et diminue la réponse humorale in vivo qui sont des résultats inattendus considérant le rôle du MIF comme pro-inflammatoire et inducteur d'IL-12. Étant donné que la sécrétion de MIF est induite chez les souris BALB/c infectées avec Plasmodium chabaudi adami (DK) et que la résolution de cette infection nécessite une réponse Th1 couplée à une production d'IFN-y, nous avons évalué l'effet de la déficience en MIF sur la cinétique d'infection ainsi que sur l'activation des lymphocytes CD4+. Nos résultats montrent un meilleur contrôle de l'infection avec Plasmodium chabaudi adami (DK) chez des souris déficientes en MIF (MIF/KO), caractérisé par un pic et une parasitémie cumulative significativement plus faible. D'autre part, une anémie plus modérée, déterminée par une plus faible expression des précurseurs érythroïdes et des réticulocytes a aussi été mesurée chez des souris MIF/KO lors de l'infection. Au jour 4 post-infection, le pourcentage et le nombre absolu de cellules CD4+ spléniques activées était plus important chez les souris MIF/KO, de plus, ces cellules sécrétaient plus d'IFN-y, moins d'IL-10 et d'IL-4. De manière intéressante, la production précoce d'IL-4 par une population des cellules spléniques non B et non T (possiblement des basophiles) a été fortement inhibée chez les souris MIF/KO lors de l'infection. Une observation collatérale dans notre étude a été la surexpression du facteur de transcription T-bet chez des cellules T CD4 + naïves déficientes en MIF. Étant donné que les lymphocytes CD4+ déficients en MIf sécrètent plus d'IFN-y et moins d'IL-4 suite à leur stimulation in vitro, nos résultats suggèrent que le MIF module la capacité des lymphocytes CD4+ à sécréter des cytokines de type Th1. De plus, elle suggère aussi la présence d'une corrélation entre l'expression plus forte de T-bet et le phénotype Th1 accentué chez les lymphocytes CD4+ déficients en MIF. Par contre, cette régulation n'impliquerait pas la voie des récepteurs TLR étant donné qu'aucune modulation de ces récepteurs par le MIF n'a été observée. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MIF, Plasmodium, IFN-y, IL-4, Lymphocyte

La schizophrénie est une psychopathologie caractérisée par une perturbation du fonctionnement cognitif. Malgré l'efficacité de certains traitements antipsychotiques en regard de certains symptômes négatifs et positifs, il n'en demeure pas moins que les troubles cognitifs demeurent présents. Ce travail doctoral a pour but d'examiner l'effet des inhibiteurs d'acétylcholinestérase sur le fonctionnement cognitif dans la schizophrénie, afin d'en vérifier l'efficacité. Il s'agit d'une famille de médicaments utilisés pour d'autres pathologies où des problèmes cognitifs, en particulier mnésiques, apparaissent liés à un neurotransmetteur particulier, l'acétylcholine. Après une introduction sur les troubles cognitifs en tant qu'éléments importants du tableau clinique de la schizophrénie, nous présentons les diverses avenues de recherche en pharmacologie visant l'amélioration du fonctionnement cognitif dans la schizophrénie. Cette présentation, sous la forme d'un article intitulé « On the trail of a cognitive enhancer for the treatment of schizophrenia » met en évidence l'implication du système cholinergique dans les troubles cognitifs de la schizophrénie. Sur la base de cette littérature, nous avons effectué une étude sur les effets de la rivastigmine, un inhibiteur d'acétylcholinestérase, chez des patients atteints de schizophrénie et présentant des troubles cognitifs. Les résultats de cette étude clinique menée auprès de patients sous médication neuroleptique et rivastigmine de manière concomitante n'ont pas révélé d'effet particulier de la rivastigmine sur le fonctionnement cognitif dans la schizophrénie. Les données contradictoires entre les études récentes sur l'effet des inhibiteurs d'acétylcholinestérase sur le fonctionnement cognitif dans la schizophrénie, et la nôtre nous ont incité à effectuer une méta-analyse. Le but de cette méta-analyse était de statuer sur les effets des différents inhibiteurs d'acétylcholinestérase sur le dysfonctionnement cognitif dans la schizophrénie. Les résultats de cette méta-analyse ont montré une faible contribution des inhibiteurs d'acétylcholinestérase dans l'amélioration des fonctions mnésiques chez les patients atteints de schizophrénie. Nos résultats expérimentaux et méta-analytiques ne permettent pas de confirmer notre hypothèse initiale stipulant que les inhibiteurs d'acétylcholinestérase puissent être efficaces pour le traitement des troubles cognitifs dans la schizophrénie. En fait, les faibles résultats obtenus apparaissent liés à des facteurs méthodologiques et un effet de pratique. En outre, plusieurs études récentes mieux contrôlées ne révèlent pas d'effet du traitement. Il ne semble donc pas prometteur de poursuivre des études dans ce domaine de recherche. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Schizophrénie, Fonctionnement Cognitif, Mémoire, Inhibiteur d'Acétylcholinestérase, Rivastigmine.