L'acétylcholine (ACh), bien connue comme neurotransmetteur chez les animaux, est le substrat des acétylcholinestérases eucaryotes et procaryotes (AChE). La structure et la fonction des AChE de mammifères ont été bien étudiées en raison de leur importance à la fois dans les synapses cérébrales cholinergiques, dans le système nerveux périphérique et également comme une cible médicamenteuse clé pour de nombreuses maladies telles que la maladie d'Alzheimer chez les humains. En revanche, les acétylcholinestérases procaryotes restent mal comprises malgré une longue historique d'études. La bactérie Pseudomonas aeruginosa possède le système d'acquisition de la choline comprenant l'enzyme ChoE, qui aide à importer la choline comme source de nutriments. Fait intéressant, ChoE a été identifiée comme une acétylcholinestérase putative qui présente des propriétés enzymatiques similaires aux AChE de mammifères malgré sa taille beaucoup plus petite. Dans ce travail, pour mieux comprendre l'acétylcholinestérase d'origine procaryote, nous avons effectué la caractérisation structurale et biochimique de ChoE en utilisant la cristallographie aux rayons X et l'enzymologie comme approches primaires. Nous avons démontré que ChoE est indispensable à la croissance de P. aeruginosa lorsque l'acétylcholine est utilisée comme seule source de carbone et d'azote. Un ensemble complet de structures à haute résolution de ChoE a été obtenu, y compris des complexes avec des substrats, des produits, un intermédiaire acyle ainsi qu'un inhibiteur. Ces structures ont révélé les déterminants moléculaires de la reconnaissance du substrat, des instantanés des différentes étapes catalytiques et la base moléculaire de l'inhibition du substrat à des concentrations élevées de substrat. D'après ces résultats, la libération retardée du produit acétate facilite la liaison non productive du substrat, provoquant l'inhibition du substrat. En utilisant une série de mutants, nous avons étudié le rôle des résidus critiques dans la triade catalytique, le trou oxyanion et la poche de liaison de la choline, tels que Ser38, Tyr106, Asn147, Asp285, Trp287 et His288. Ces résultats ont révélé que Ser38 et His288 dans la triade catalytique sont essentiels pour l'activité ChoE tandis que Asp285 n'est pas essentiel. Conformément au mécanisme moléculaire déduit de ces structures, l'inhibition du substrat est abolie ou considérablement atténuée chez les mutants N147A, Y106A, D285N et W287A. Par-dessus tout, nous avons identifié trois conformations distinctes de Ser38 catalytique, dont la plasticité conformationnelle contrôle vraisemblablement la géométrie du site actif et donc les états fonctionnels de ChoE, ce qui est également corroboré par notre analyse structurale d'autres hydrolases SGNH. En résumé, ces travaux ont fourni des informations moléculaires sans précédent sur les acétylcholinestérases bactériennes et la famille des hydrolases SGNH. / Acetylcholine (ACh), a well-known neurotransmitter in animals, is the substrate of both eukaryotic and prokaryotic acetylcholinesterases (AChE). The structure and the function of mammalian AChEs have been well studied due to their importance in both cholinergic brain synapses and the peripheral nervous systems. They are also a key drug target for many diseases such as Alzheimer's disease in humans. In contrast, prokaryotic acetylcholinesterases remain poorly understood despite a long history of studies. Pseudomonas aeruginosa bacterium possesses the choline acquisition system including the enzyme ChoE, helping it to import choline as a nutrient source. ChoE has been identified as a putative acetylcholinesterase which exhibits similar enzymatic properties to mammalian AChEs despite its much smaller size. In this work, to better understand the acetylcholinesterase of prokaryotic sources, we performed the structural and biochemical characterization of ChoE using X-ray crystallography and enzymology as the primary approaches. We have demonstrated that ChoE is indispensable for P. aeruginosa growth when acetylcholine is used as the sole carbon and nitrogen source. A comprehensive set of high-resolution structures of ChoE have been obtained including the complexes of enzyme with substrates, products, acyl intermediate and inhibitor. These structures have revealed the molecular determinants for substrate recognition, snapshots of the various catalytic steps, and the molecular basis of substrate inhibition at high substrate concentrations. From these results, the retarded release of the acetate product facilitates the nonproductive binding of substrate causing substrate inhibition. Using a series of mutants, we have studied the role of critical residues in the catalytic triad, the oxyanion hole and the choline-binding pocket, such as Ser38, Tyr106, Asn147, Asp285, Trp287 and His288. These results indicated that both Ser38 and His288 in the catalytic triad are strictly required for ChoE activity while Asp285 is not essential. Consistent with the molecular mechanism deduced from our structures, substrate inhibition is abolished or significantly alleviated in the N147A, Y106A, D285N and W287A mutants. Importantly, we have identified three distinct conformations of catalytic Ser38, whose conformational plasticity presumably controls the active site geometry and thus the functional states of ChoE, which is also substantiated by our structural analysis of other SGNH hydrolases. In summary, this work has provided unprecedented molecular insights into both bacterial acetylcholinesterases and the SGNH hydrolase family.

La schizophrénie est une psychopathologie caractérisée par une perturbation du fonctionnement cognitif. Malgré l'efficacité de certains traitements antipsychotiques en regard de certains symptômes négatifs et positifs, il n'en demeure pas moins que les troubles cognitifs demeurent présents. Ce travail doctoral a pour but d'examiner l'effet des inhibiteurs d'acétylcholinestérase sur le fonctionnement cognitif dans la schizophrénie, afin d'en vérifier l'efficacité. Il s'agit d'une famille de médicaments utilisés pour d'autres pathologies où des problèmes cognitifs, en particulier mnésiques, apparaissent liés à un neurotransmetteur particulier, l'acétylcholine. Après une introduction sur les troubles cognitifs en tant qu'éléments importants du tableau clinique de la schizophrénie, nous présentons les diverses avenues de recherche en pharmacologie visant l'amélioration du fonctionnement cognitif dans la schizophrénie. Cette présentation, sous la forme d'un article intitulé « On the trail of a cognitive enhancer for the treatment of schizophrenia » met en évidence l'implication du système cholinergique dans les troubles cognitifs de la schizophrénie. Sur la base de cette littérature, nous avons effectué une étude sur les effets de la rivastigmine, un inhibiteur d'acétylcholinestérase, chez des patients atteints de schizophrénie et présentant des troubles cognitifs. Les résultats de cette étude clinique menée auprès de patients sous médication neuroleptique et rivastigmine de manière concomitante n'ont pas révélé d'effet particulier de la rivastigmine sur le fonctionnement cognitif dans la schizophrénie. Les données contradictoires entre les études récentes sur l'effet des inhibiteurs d'acétylcholinestérase sur le fonctionnement cognitif dans la schizophrénie, et la nôtre nous ont incité à effectuer une méta-analyse. Le but de cette méta-analyse était de statuer sur les effets des différents inhibiteurs d'acétylcholinestérase sur le dysfonctionnement cognitif dans la schizophrénie. Les résultats de cette méta-analyse ont montré une faible contribution des inhibiteurs d'acétylcholinestérase dans l'amélioration des fonctions mnésiques chez les patients atteints de schizophrénie. Nos résultats expérimentaux et méta-analytiques ne permettent pas de confirmer notre hypothèse initiale stipulant que les inhibiteurs d'acétylcholinestérase puissent être efficaces pour le traitement des troubles cognitifs dans la schizophrénie. En fait, les faibles résultats obtenus apparaissent liés à des facteurs méthodologiques et un effet de pratique. En outre, plusieurs études récentes mieux contrôlées ne révèlent pas d'effet du traitement. Il ne semble donc pas prometteur de poursuivre des études dans ce domaine de recherche. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Schizophrénie, Fonctionnement Cognitif, Mémoire, Inhibiteur d'Acétylcholinestérase, Rivastigmine.

Le projet de cette thèse était l'évaluation du processus de réactivation et l'étude du site actif de l'AChE inhibée par un agent neurotoxique par des méthode computationnelles. L'objectif était de guider le design rationnel de nouveau réactivateurs. Une étude initiale avec un modèle QM tronqué a indiqué la nécessité de modéliser l'environnement enzymatique pour compenser la charge du Glu334. Elle a aussi confirmé le rôle du trou oxyanionique dans la stabilisation des états de transition de la réactivation. Des simulations QM/MM de la réactivation par le réactivateur classique 2-PAM, ainsi que par deux réactivateurs au coeur aromatique non chargé ont été effectuées. Il a été démontré que le Glu202, un résidu à proximité de la triade catalytique de l'AChE, doit être protoné pour que la réactivation ait lieu. Ces simulations ont aussi montré que le réactivateur peut être déprotoné dans le site actif de l'AChE par His447. Les réactivateurs au coeur aromatique non chargé sont plus nucléophiles que la 2-PAM et l'un d'entre eux est plus aisément déprotoné dans le site actif. Nos résultats indiquent que la capacité d'un réactivateur à être facilement déprotoné est plus importante que sa nucléophilie. Enfin, un mécanisme de migration de protons a été identifié par des calculs QM/MM et EVB. Il implique deux glutamates derrière le site actif, Glu450 et Glu452. La possibilité que ces deux protons soient temporairement protonés et donc impliqués dans une migration de protons a été confirmé par des calculs CpHMD. La migration de proton passe par la N-protonation d'une liaison amide, ce qui constitue un nouveau mécanisme. / The project of this PhD was to investigate the reactivation process and the active site of nerve agent inhibited AChE by computational methodologies to gain insight about the rational design of new reactivators. An initial truncated QM model study provided some insight in the necessary compensation of Glu334 by the enzyme. It also confirmed the role of the oxyanionic hole in the stabilization of the transition state of the reactivation. QM/MM simulations of the reactivation with classical reactivator 2-PAM, as well as two non-pyridinium reactivators, were performed. It was shown that Glu202, a residue near the catalytic triad of AChE, needs to be protonated for the reactivation to occur. Those simulations also showed that the reactivator can be deprotonated in the active site of AChE by His447. Non-pyridinium reactivator were found to have a greater nucleophilicity than 2-PAM and, for one of them, to be easily deprotonated in the active site. Our results indicate that the capacity of a reactivator to be deprotonated in the active site of the enzyme is more important than its nucleophilicity. Finally, a proton relay mechanism was identified through QM/MM and EVB simulations. It involves two glutamate residues, Glu450 and Glu452, positioned behind the active site. The potential for these two residues to be transiently protonated and thus involved in a proton relay was confirmed by CpHMD simulations. This proton relay mechanism relies on the N-protonation of an amide which is a novel mechanism.

Au niveau de la jonction neuromusculaire (JNM) squelettique de Vertébrés, deux enzymes d'une remarquable efficacité peuvent hydrolyser l'acétylcholine (ACh) : l'acétylcholinestérase (AChE) et la butyrylcholinestérase (BChE). L'hydrolyse de l'ACh dépend non seulement de l'activité enzymatique de l'AChE et de la BChE mais également de leur localisation. Ces deux enzymes semblent posséder des capacités fonctionnelles différentes dont l'importance relative n'a pas encore été établie.<br />Nous avons choisi une approche génétique pour analyser le rôle des cholinestérases dans la transmission neuromusculaire. Nous disposons de plusieurs lignées de souris qui présentent un déficit dans l'hydrolyse de l'ACh à la jonction neuromusculaire. Certaines de ces souris génétiquement modifiées n'ont plus d'activité enzymatique AChE (souris AChE KO) dans tous les tissus, d'autres ne possèdent que la forme moléculaire soluble de l'AChE (souris AChE Del E5,6), d'autres sont dépourvues de la forme ancrée à la membrane par un glycophospholipide (souris AChE Del E5/neo) ou des formes ancrées à la membrane par PRiMA (souris PRiMA KO) ou totalement de BChE (souris BChE KO). La caractérisation des JNM de ces souris par des approches électrophysiologiques et de microscopie confocale nous a permis d'appréhender les rôles des différentes formes moléculaires des cholinestérases dans la transmission neuromusculaire ainsi que les éventuelles adaptations pré- et postsynaptiques qui conditionnent l'efficacité synaptique.<br />Malgré l'absence totale ou partielle d'AChE, les souris développent des contractions tétaniques dans une gamme de fréquences physiologiques (10 à 100 Hz) mais ne peuvent pas les maintenir constantes à des fréquences supérieures à 30 Hz. Chez ces souris, l'inhibition de la BChE entraîne une accentuation de la dépression de ces réponses, ce qui suggère que la BChE joue un rôle de modulateur dans la transmission synaptique. De plus, les cours temporels des réponses synaptiques enregistrées au niveau des JNM sont augmentés de par l'activation répétitive des récepteurs nicotiniques de l'ACh (RnACh) par l'ACh. Enfin, des remodelages pré- et postsynaptiques post-nataux ont été mis en évidence au niveau des JNM. Ces remodelages synaptiques sont probablement dus à l'adaptation des RnACh et des terminaisons nerveuses motrices face à l'absence d'activité enzymatique de l'AChE.<br />Nous proposons que, chez ces souris génétiquement modifiées, la petite taille des aires de distribution des RnACh ainsi que la discontinuité des amas de ces récepteurs et de celle des terminaisons nerveuses permettent à l'ACh de diffuser facilement et rapidement hors de la fente synaptique.

L'objectif de la thèse était de regarder l'acétylcholinestérase (AChE) en mouvement. L'AChE est une enzyme très rapide qui met fin à la transmission de l'influx nerveux au sein des synapses cholinergiques. À l'aide de la cristallographie aux rayons X, des sous-états conformationnels de l'AChE de Torpedo californica (Tc) ont été piégés par sa liaison à des drogues anti-Alzheimer putatives. Les formes, non vieillie et vieillie, de la TcAChE conjuguée au soman ont été caractérisées structuralement, éclairant ainsi le mécanisme de vieillissement de la TcAChE inhibée par les organophosphorés (OP). La structure du complexe ternaire du conjugué vieilli avec un réactivateur a également été résolue. Toutes ces structures guideront l'élaboration de médicaments (drogues anti-Alzheimer ou antidotes contre l'empoisonnement par des OP) en prenant en compte la flexibilité de l'enzyme et ses conformations minoritaires. La structure du complexe de la TcAChE avec un inhibiteur de son site périphérique (PAS), l'aflatoxine B1 (AB1), a été résolue dans deux formes cristallines. Ce travail a mis en évidence des artefacts de la cristallographie nuisibles à l'interprétation biologique des structures. La mesure du temps de vie de phosphorescence de l'AB1 a permis de sonder les mouvements du PAS à l'échelle de la seconde et de révéler des différences de flexibilité liées à l'empilement cristallin de la TcAChE. Cette méthode spectroscopique est complémentaire à la cristallographie cinétique. La gamme de températures cryogéniques identifiée pourrait en effet faciliter l'exploration du mécanisme réactionnel de l'AChE, en ralentissant l'enzyme sans pour autant la figer.

Ce projet à caractère dual civil et militaire vise à développer de nouvelles contre-mesures médicales d’urgences hautement efficaces en cas d’intoxications accidentelles ou volontaires aux organophosphorés toxiques (gaz de combat et pesticides). Ces poisons agissent comme des inhibiteurs irréversibles de l’acétylcholinestérase, enzyme clé principalement localisé dans notre système nerveux, par phosphorylation du site actif enzymatique. Cependant, un nucléophile puissant capable de pénétrer jusqu’au site actif de la protéine peut également l’hydrolyser. Notre recherche réside sur l’élaboration de molécules hybrides possédant deux systèmes clés : une partie réactivatrice neutre capable de restaurer l’activité enzymatique et un ligand du site périphérique capable de vectoriser la structure hybride à l’entrée du site actif. Une librairie de nouveaux hybrides bifonctionnels a ainsi été synthétisée, évaluée et décrite dans ces travaux de thèse. L’ensemble de ces hybrides démontre une activité égale ou supérieure à celle des réactivateurs de référence. Nous avons même découvert le premier hybride universel surpassant l’activité de réactivation des antidotes actuellement commercialisés pour des intoxications aux gaz de combat et aux pesticides. / Remediation of both acute and chronic intoxications by organophosphorus nerve agents, both chemical warfare agents and pesticides, continues to be a challenge of paramount importance. These manmade poisons act as covalent and irreversible inhibitors of acetylcholinesterase, a key enzyme mostly located in the nervous system, through phosphylation of its active site. The phosphylated active site residues do not undergo spontaneous hydrolysis. However, hydrolysis can be achieved through the use of strong nucleophiles able to enter the buried active site of the protein. Our research is based on the rational design of hybrid structures containing two key elements: a neutral reactivator to restore the enzyme activity, and a peripheral site ligand giving selectivity by targeted binding to a site at the entrance of the enzyme active site gorge. A library of novel reactivators based on acridine, quinoline and original oxoassoanine analogues was synthesised, evaluated and is herein described. Delightfully, most of these hybrids proved to be equally or more potent than the drugs currently in use. Outstandingly, we have discovered the first broad-spectrum reactivator that outperformed all known reactivators for both chemical warfare agent and pesticide intoxications.

Les vésicules extracellulaires (VE) jouent un rôle de communication intercellulaire pouvant réguler le système immunitaire. Les VE sont composées de différentes populations que l'on retrouve dans tous les fluides biologiques et constituent des biomarqueurs ainsi que des outils thérapeutiques dans diverses pathologies comme les cancers. Une étude dans notre laboratoire a révélé le potentiel de biomarqueur des vésicules extracellulaires plasmatiques (VEsp) chez des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1). Cette étude a montré un enrichissement des VE acétylcholinestérase positive (AChE+) et des marqueurs protéiques de la population des exosomes chez les patients infectés. Nous avons proposé comme hypothèse que la population de VEsp AChE+ serait des exosomes et que cette population constituerait un meilleur biomarqueur de l'infection par le VIH-1 que l'ensemble des VE. Les VEsp AChE+ d'une nouvelle cohorte de patients ont été caractérisées. Dans un premier temps, la purification des VEsp AChE+ a été optimisée afin de séparer les grosses vésicules des petites. Dans un deuxième temps nous avons validé que la population de VEsp AChE+ est une population homogène et spécifique dont le potentiel de biomarqueur de l'infection a été validé. Pour terminer la caractérisation de cette population, elle a été séparée dans un gradient de vélocité à l'iodixanol afin de valider que cette population de vésicules était des exosomes. Ce projet a permis de valider que la population d'exosomes AChE+ purifiées et caractérisées dans une cohorte de patients atteints du VIH-1+, représente un biomarqueur de l'évolution de l'infection par le VIH-1.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 juillet 2023) / Selon les projections de l'Alzheimer's Disease International (ADI, 2018), le nombre mondial de cas diagnostiqués de maladie d'Alzheimer (MA) triplera d'ici 2050. Ce trouble est caractérisé par un ensemble de symptômes que l'on peut diviser en trois catégories, soit les symptômes cognitifs, les symptômes fonctionnels et les symptômes psychologiques et comportementaux (SCPD). Les inhibiteurs de la cholinestérase (IAChEs) - donépézil, rivastigmine, et galantamine - sont des agents pharmacologiques qui sont prescrits pour le traitement symptomatologique de la MA. Il est estimé que 80 % des personnes qui sont atteintes de la MA sont prises en charge par un proche. Le rôle de proche aidant (PA) est associé à un ensemble de stresseurs. Le terme fardeau est souvent utilisé pour faire référence à cette charge et à ses conséquences négatives. La sévérité de la symptomatologie de l'aidé a un effet documenté sur le fardeau du PA et les symptômes fonctionnels et les SCPD seraient les catégories de symptômes dont l'effet négatif est le plus important. L'objectif de ce mémoire doctoral est d'évaluer si par leurs effets sur la symptomatologie de l'aidé, les IAChEs ont des répercussions positives sur le fardeau du PA. Pour ce faire, une recension systématique avec résumé narratif a été réalisée. Les résultats obtenus révèlent des changements en faveur du traitement sur au moins une des trois catégories de symptômes de la MA et des changements concomitants en faveur du traitement sur le fardeau dans 8 des 12 études retenues. Toutefois, les effets observés sont petits et plusieurs variables non contrôlées pourraient expliquer les différences observées. Les résultats de cette recension laissent croire que les IAChEs n'ont pas d'effets cliniquement significatifs sur le fardeau du PA. Les IAChEs ne pouvant pas être utilisés comme façon de diminuer le fardeau, la mise en place d'autres interventions s'adressant tant au PA, à l'aidé qu'à la dyade semble être une avenue bien plus prometteuse.

L'acétylcholinestérase est une enzyme très rapide, essentielle à la neurotransmission cholinergique. Elle est la cible de toutes les molécules actuellement utilisées dans le traitement de la maladie d'Alzheimer, et les progrès à venir dans la modulation de son activité réclament une connaissance plus fine de sa structure et de sa dynamique. Dans cette thèse, nous décrivons trois approches expérimentales ayant permis d'obtenir des informations structurales sur la dynamique de l'acétylcholinestérase. Nous rapportons, dans un premier temps, la structure de cette enzyme en complexe avec un putatif médicament anti-Alzheimer de seconde génération. Nous décrivons, par ailleurs, une approche de mise à l'équilibre réactionnel de complexes enzyme/substrat cristallins, grâce à laquelle le trafic des substrats au sein de l'acétylcholinestérase a pu être suivi structuralement. Nous présentons, enfin, le développement d'une stratégie nouvelle en cristallographie cinétique des protéines, basée sur l'utilisation d'un précurseur photosensible du produit de réaction enzymatique, sa photolyse in-crystallo par le biais d'un laser, et l'application subséquente de profils de température adéquats afin de permettre la survenue des mouvements moléculaires nécessaires à l'expulsion des produits de photolyse. Prises conjointement, les différents résultats de cette thèse permettent une description détaillée du trafic des substrats et produits au sein de l'acétylcholinestérase, et fournissent un aperçu structural de son paysage conformationnel.

Les pesticides et toxiques de guerre organophosphorés sont responsables d'intoxications qui se révèlent préoccupantes pour les autorités sanitaires. La recherche de solutions thérapeutiques pour pallier le manque de moyens efficaces pour contrer ces intoxications apparaît comme essentielle. L'acétylcholinestérase (AChE), enzyme de régulation de l'influx nerveux, en est la cible principale.Au cours de cette thèse, nous avons, d'une part, mis en place une stratégie de conception de molécules capables de réactiver les cholinestérases dites vieillies. Dans ce but, plusieurs dizaines de molécules ont été conçues et synthétisées. Leur évaluation in silico par docking moléculaire et in vitro par mesure d'affinité pour l'enzyme et par étude cristallographique n'a pas permis d'obtenir la réalkylation espérée, mais ce travail nous a offert quelques nouvelles perspectives.D'autre part, nos travaux de cristallographie de l'inhibition de la butyrylcholinestérase humaine par les agents V et le sarin montrent que cette cholinestérase a une énantiosélectivité altérée pour ces inhibiteurs chiraux par rapport à l'AChE humaine. Ceci implique la nécessité de quantités d'enzyme plus importantes pour atteindre la capacité protectrice désirée et donc un surcoût non négligeable. L'AChE humaine serait finalement un bioépurateur de neurotoxiques organophosphorés économiquement plus viable. / Organophosphate pesticides and chemical warfare are responsible for poisoning that pose to health security issues. The research of therapeutic solutions to overcome the lack of effective means to counter these poisonings is essential. Acetylcholinesterase (AChE), the enzyme involved in the regulation of nerve impulses, is the main target. ln this thesis, we have, first, set up a strategy for designing molecules that can reactivate aged cholinesterases. To this purpose, severa! dozen molecules have been designed and synthesized. Evaluation in silico by molecular docking and in vitro by rneasuring affinity for the enzyme and crystallographic study did not observe the desired realkylation. But this work opened new perspectives.Secondly, our crystallographic work on the inhibition of human butyrylcholinesterase by V-agents and sarin shows that cholinesterase has altered enantioselectivity for these chiral inhibitors of human AChE. This implies that larger amounts of enzyme are required for the desired protection and thus, a significant additional cost. Human AChE seems finally a more suitable neurotoxic bioscavenger.