Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au niveau de la jonction neuromusculaire (JNM) squelettique de Vertébrés, deux enzymes d'une remarquable efficacité peuvent hydrolyser l'acétylcholine (ACh) : l'acétylcholinestérase (AChE) et la butyrylcholinestérase (BChE). L'hydrolyse de l'ACh dépend non seulement de l'activité enzymatique de l'AChE et de la BChE mais également de leur localisation. Ces deux enzymes semblent posséder des capacités fonctionnelles différentes dont l'importance relative n'a pas encore été établie.<br />Nous avons choisi une approche génétique pour analyser le rôle des cholinestérases dans la transmission neuromusculaire. Nous disposons de plusieurs lignées de souris qui présentent un déficit dans l'hydrolyse de l'ACh à la jonction neuromusculaire. Certaines de ces souris génétiquement modifiées n'ont plus d'activité enzymatique AChE (souris AChE KO) dans tous les tissus, d'autres ne possèdent que la forme moléculaire soluble de l'AChE (souris AChE Del E5,6), d'autres sont dépourvues de la forme ancrée à la membrane par un glycophospholipide (souris AChE Del E5/neo) ou des formes ancrées à la membrane par PRiMA (souris PRiMA KO) ou totalement de BChE (souris BChE KO). La caractérisation des JNM de ces souris par des approches électrophysiologiques et de microscopie confocale nous a permis d'appréhender les rôles des différentes formes moléculaires des cholinestérases dans la transmission neuromusculaire ainsi que les éventuelles adaptations pré- et postsynaptiques qui conditionnent l'efficacité synaptique.<br />Malgré l'absence totale ou partielle d'AChE, les souris développent des contractions tétaniques dans une gamme de fréquences physiologiques (10 à 100 Hz) mais ne peuvent pas les maintenir constantes à des fréquences supérieures à 30 Hz. Chez ces souris, l'inhibition de la BChE entraîne une accentuation de la dépression de ces réponses, ce qui suggère que la BChE joue un rôle de modulateur dans la transmission synaptique. De plus, les cours temporels des réponses synaptiques enregistrées au niveau des JNM sont augmentés de par l'activation répétitive des récepteurs nicotiniques de l'ACh (RnACh) par l'ACh. Enfin, des remodelages pré- et postsynaptiques post-nataux ont été mis en évidence au niveau des JNM. Ces remodelages synaptiques sont probablement dus à l'adaptation des RnACh et des terminaisons nerveuses motrices face à l'absence d'activité enzymatique de l'AChE.<br />Nous proposons que, chez ces souris génétiquement modifiées, la petite taille des aires de distribution des RnACh ainsi que la discontinuité des amas de ces récepteurs et de celle des terminaisons nerveuses permettent à l'ACh de diffuser facilement et rapidement hors de la fente synaptique.

Thèse d'exercice : Médecine. Ophtalmologie : Paris 12 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 62-70.

Lors du développement du système nerveux, de nombreux mécanismes moléculaires sont mis en jeu afin que les axones trouvent leur cible et établissent des synapses. Une fois ces synapses établies, elles restent plastiques et peuvent encore être modifiées d'un point de vue morphologique et fonctionnel en fonction de la taille de la cible ou de l'activité de la synapse. La jonction neuromusculaire (JNM) de la larve de drosophile est un modèle idéal pour étudier cette plasticité synaptique développementale. En effet, la cellule musculaire innervée augmente de taille d'un facteur 50, et la JNM croît en conséquence. Cette croissance met en jeu le cystoquelette microtubulaire, composant central de la terminaison synaptique. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la protéine kinase Shaggy dans la croissance de la JNM et avons montré qu'elle joue un rôle inhibiteur dépendant de la protéine associée aux microtubules (MAP) Futsch. Futsch est le représentant d'une des deux familles de MAPs structurales. Ces deux familles comprennent la famille MAP1 (MAP1A, MAP1B et MAP1S) et la famille MAP2/MAP4/Tau. Dans le système nerveux, elles stabilisent les microtubules et favorisent la pousse neuritique. Cependant, lors de synaptogenèse, leur rôle est méconnu. Chez la drosophile, il n'existe qu'un membre de chaque famille : Futsch (MAP1) et Tau (MAP2/MAP4/Tau), ce qui simplifie l'étude d'une famille par rapport à l'autre par l'absence de redondance. Nous avons ensuite étudié le rôle de ces MAPs sur la stabilité des microtubules, ce qu'il en résulte concernant la croissance de la JNM et quels acteurs, notamment ceux de la voie de signalisation Wnt/Wingless, peuvent réguler ces protéines.

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une affection neurodégénérative touchant les motoneurones, habituellement mortelle en 3 à 5 ans. La cause de la maladie n'est pas connue et le seul traitement actuellement disponible ne permet qu'un allongement modeste de la survie. Des altérations fonctionnelles de la jonction neuromusculaire (JNM) ont été rapportées dans la SLA mais leur origine physiopathologique n'est pas connue. Nous avons étudié les JNM chez 11 patients atteints de SLA, en associant étude morphologique en microscopie confocale et analyse ultrastructurale. L'analyse fonctionnelle réalisée en EMG de surface retrouvait une anomalie de transmission neuromusculaire (décrément > 10%) chez 45% des patients. Des altérations morphologiques des JNM étaient visibles chez tous les patients, y compris au stade précoce de la maladie. Associé aux anomalies en rapport avec le phénomène de dénervation, nous avons observé un aspect anormal de spiculation de la gouttière primaire dans environ un tiers des cas. Une interposition marquée de la cellule de Schwann terminale entre la terminaison nerveuse et la membrane postsynaptique, pouvant altérer la transmission synaptique, était parfois visible. Nous avons objectivé une réinnervation compensatrice significativement plus importante chez les patients présentant une SLA d'évolution lente et montré que certains facteurs moléculaires musculaires comme l'histone déacétylase 4 pourraient jouer un rôle crucial dans la capacité de réinnervation. Ce travail a mis en évidence des altérations morphologiques majeures au niveau des JNM des patients atteints de SLA et a permis d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder affecting motor neurons, usually leading to death in 3 to 5 years. The only treatment currently available, riluzole, has a modest effect on survival. Functional alterations of the neuromuscular junction (NMJ) have been reported in ALS, but their pathophysiological significance remains unknown. We studied the morphology of neuromuscular junctions in muscle samples collected from 11 ALS patients, using confocal and electron microscopy. Functional analysis of the NMJs was performed using surface-recording of compound motor action potentials after repetitive nerve stimulation at slow stimulus rate. A significant decrement (>10%), suggesting impairment of the neuromuscular transmission, was present in 45% of the patients. Morphological alterations of the NMJs were present in all ALS patients even at the early-stages. Beside denervation-induced morphological changes, one third of the NMJs showed abnormal spike-like areas of the outer edge of the postsynaptic primary gutter. A marked interposition of the terminal Schwann cell between the nerve terminal and the postsynaptic membrane, which was likely to alter synaptic transmission, was sometimes present. We found a significantly greater compensatory reinnervation in muscle from patients with slowly progressive ALS. Furthermore, we identified that the muscle molecular factor histone deacetylase 4 could play a key role in muscle reinnervation and disease progression in patients with ALS. This work has highlighted the presence of major morphological changes at the NMJs of ALS patients and identified potential new targets for future treatment.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative dont les premiers symptômes apparaissent généralement vers 60 ans. Elle affecte sélectivement le système moteur et provoque une paralysie progressive amenant au décès du patient par défaillance respiratoire en quelques années. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, d’où la nécessité de comprendre la physiopathologie de la SLA. Bien que de nombreuses altérations dans le muscle aient été mises en évidence, sa contribution dans la SLA reste à définir. Nous avons montré que FUS est enrichi dans les noyaux sous-synaptiques de façon dépendante de l’innervation. De plus, FUS se lie au promoteur des récepteurs de l’acétylcholine et induit leur transcription de façon dépendante d’ERM. Le mutant FUS, quant à lui, est enrichi dans les noyaux extra-synaptiques et entraîne une toxicité musculaire responsable de l’altération de la jonction neuromusculaire (JNM). Au-delà de la JNM, FUS active MEF2A, de façon dépendante de PRMT1 afin de réguler les fonctions mitochondriales et la différenciation musculaire. La toxicité musculaire de FUS joue donc un rôle clé dans la physiopathologie de la SLA. / Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative whose first symptoms generally appear around age 60. It is characterized by progressive motor neuron degeneration, paralysis and leading to death due to respiratory failure in a few years. Currently, there is no cure so the understanding of ALS physiopathology is necessary. Although many alterations in the muscle have been highlighted, its contribution in ALS remains to be defined. We showed that FUS is enriched in subsynaptic nuclei and this enrichment depended on innervation. Besides, FUS binds directly acetylcholine receptors (AchR) promoter and is required for Ermdependent induction of AChR expression. Conversely, mutant FUS is enriched on extra-synaptic nuclei and induce muscle intrinsic toxicity responsible for neuromuscular junction (NMJ) alteration. Beyond NMJ, FUS is required for muscle mitochondrial function and muscle differentiation through PRMT1-dependent MEF2A activation. Thus, FUS muscular toxicity plays a key role in the ALS physiopathology.

Le syndrome de Schwartz-Jampel (SJS) est une pathologie autosomique récessive rare car seulement plus de 100 cas ont été décrits dans la littérature. Elle est caractérisée par une raideur musculaire permanente et généralisée associée à une chondrodystrophie. Elle est due à des mutations perte de fonction dans le gène HSPG2 codant pour le perlecan, un héparane sulfate protéoglycane ubiquitaire présent dans les membranes basales et les matrices extracellulaires. Une autre pathologie, la dysplasie dissegmentaire de type Silvermann-Handmaker (DDSH) est due à des mutations perte de fonction dans ce gène, et est caractérisée par une chondrodysplasie très sévère menant à la mort du patient dès les premiers jours de vie. Dans une première partie de mon introduction, je décrirai les signes cliniques de ces deux pathologies et les mutations du gène HSPG2 actuellement connues pour chacune. Le perlecan est une des plus grandes protéines connues. Avec une séquence protéique de plus de 4300 acides aminés et un poids moléculaire de plus de 450kDa, il subit des modifications post-traductionnelles et peut alors atteindre un poids moléculaire de 800kDa. Cette protéine immense assure de multiples interactions et fonctions dans les membranes basales dans lesquelles elle est ubiquitairement présente. Afin de mieux comprendre quel rôle cette protéine peut jouer dans la détermination du phénotype dans le SJS, je détaillerai dans une seconde partie les différentes molécules avec lesquelles le perlecan interagit et les fonctions qu'il assume dans les deux principaux tissus d'intérêt de la pathologie : le cartilage et le muscle. Enfin, je décrirai le phénotype de mutants d'orthologues de gène HSPG2 dans les trois organismes modèles que sont la drosophile, le nématode et la souris. Au cours de ma thèse, je me suis plus particulièrement intéressée au phénotype neuromusculaire du SJS. Pour une meilleure compréhension de mes travaux, je rappellerai dans une troisième et dernière partie de mon introduction, la structure, le développement et le fonctionnement de la jonction neuromusculaire, ainsi que les pathologies humaines congénitales associées.

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative fatale caractérisée par la dégénérescence progressive des neurones moteurs centraux et périphériques. L’un des premiers signes de la maladie est la dénervation de la jonction neuromusculaire (JNM). Les diverses unités motrices (UM) ne présentent toutefois pas la même vulnérabilité à la dénervation dans la SLA: les UM rapide fatigables sont en fait les plus vulnérables et les UM lentes sont les plus résistantes. Alors que des études précédentes ont démontré dans plusieurs modèles animaux de la SLA de nombreuses variations synaptiques, les découvertes ont été contradictoires. Par ailleurs, le type d’UM n’a pas été tenu en compte dans ces divers travaux. Nous avons donc émis l’hypothèse que la présence de la mutation SOD1 pourrait affecter différemment la transmission synaptique des UM, en accord avec leur vulnérabilité sélective. En effectuant des enregistrements électrophysiologiques et de l’immunohistochimie, nous avons étudié la transmission synaptique des différents types d’UM du muscle à contraction rapide Extensor Digitorum Longus (EDL; rapide fatigable (FF) MU) et du muscle à contraction lente Soleus (SOL; lente (S) and rapide fatigue-résistante (FR) MU) de la souris SOD1G37R et leur congénères WT. Pour identifier le type d’UM, un marquage par immunohistochimie des chaînes de myosine a été effectué. Un triple marquage de la JNM a également été effectué pour vérifier son intégrité aux différents stades de la maladie. À P160, dans la période asymptomatique de la maladie, alors qu’aucune altération morphologique n’était présente, l’activité évoquée était déjà altérée différemment en fonction des UM. Les JNMs FF mutantes ont démontré une diminution de l’amplitude des potentiels de plaque motrice (PPM) et du contenu quantique, alors que les JNMs lentes démontraient pratiquement le contraire. Les JNMs FR montraient quant à elles une force synaptique semblable au WT. À P380, dans la période présymtomatique, de nombreuses altérations morphologiques ont été observées dans le muscle EDL, incluant la dénervation complète, l’innervation partielle et les extensions du nerf. La transmission synaptique évoquée des UM FF étaient toujours réduites, de même que la fréquence des potentiels de plaque motrice miniatures. À P425, à l’apparition des premiers symptômes, l’activité synaptique des JNMs S était redevenue normale alors que les JNMs FR ont montré à ce moment une diminution du contenu quantique par rapport au contrôle. De manière surprenante, aucun changement du ratio de facilitation n’a été observé malgré les changements flagrants de la force synaptique. Ces résultats révèlent que la fonction de la JNM est modifiée différemment en fonction de la susceptibilité des UM dans l’ALS. Cette étude fournit des pistes pour une meilleure compréhension de la physiologie de la JNM durant la pathologie qui est cruciale au développement d’une thérapie adéquate ciblant la JNM dans la SLA. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal late-onset neurodegenerative disease characterized by the progressive loss of upper and lower motor neurons. Denervation of the neuromuscular junction (NMJ) is an early pathological event in various ALS models. Motor units (MU) appear unequally susceptible to denervation, the fast fatigable (FF) MU being the most vulnerable and the slow (S) MU the most resistant. While previous studies in several ALS models have consistently reported alterations in synaptic transmission, their findings have been contradictory. Interestingly, the MU types were not taken into account in these studies, which could explain these discrepancies. We hypothesized that the MU selective vulnerabilities observed in ALS will be associated with MU-specific NMJ alterations throughout the disease course. Using electrophysiology, we studied synaptic transmission of different types of MU in the fast-twitch Extensor Digitorum Longus (EDL; fast fatigable (FF) MU) and the slow-twitch Soleus (SOL; slow (S) and fast fatigue resistant (FR) MU) of the SOD1 mice and their WT littermates. MU types were identified using immunohistochemical labelling of the respective myosine heavy chains. Immunohistochemistry was also performed to assess NMJ integrity by using antibodies against main NMJ components. At a presymptomatic stage (P160), while no morphological alterations of NMJs were seen in both muscles, evoked activity was altered in a MU-specific manner in SOD1 mice. FF MU from SOD1 mice showed a decrease in EPP amplitude and quantal content whereas S MU showed the opposite. Mutant FR MU showed no difference in evoked activity compared to WT. At presymptomatic stage (P380), various morphological alterations were seen in the SOD1 EDL, including denervation, partial innervation and nerve sprouting. Evoked activity was still reduced in FF MU, as well as mEPP frequency. In contrast, at disease onset (P425), synaptic strength of the S MU was now similar to WT MU, whereas FR NMJs showed a decrease in EPP amplitude and quantal content. Surprisingly, paired-pulse facilitation was not altered in any MU type and at any age despite changes in synaptic strength. Taken together, these results reveal that NMJ function is differentially modified according to MU susceptibility in ALS. This study provides insights for a better understanding of NMJ physiology during the illness that is crucial to the development of a proper NMJ-targeted treatment in ALS.

Les protéines associées aux microtubules (MAP) de structures, telles que celles appartenant à la famille des MAP1 sont connues pour contrôler la stabilité et la dynamique des microtubules (MTs). Elles sont aussi connues pour interagir avec des protéines post-synaptiques telles que les récepteurs GABAergique ou glutamatergique. Cependant, leur rôle pré-synaptique dans la libération de neurotransmetteurs a été très peu étudié. Dans cette thèse, j'utilise l'avantage du modèle Drosophila melanogaster dans lequel il n'y a qu'un seul homologue des MAP1 des vertébrés, nommé Futsch. J'ai étudié la fonction de Futsch à la jonction neuromusculaire (JNM) de larve, où cette protéine n'est trouvée que dans la partie pré-synaptique. Ici, j'ai montré qu'en plus de sa fonction connue sur la morphologie de la JNM (Roos et al., 2000; Gogel et al., 2006), Futsch est également important pour la physiologie de la JNM, par le contrôle de la libération de neurotransmetteurs ainsi que de la densité des zones actives (ZAs). J'ai montré que l'effet physiologique de Futsch n'est pas la conséquence de l'altération du cytosquelette de MTs ou d'un défaut de transport axonal, mais doit être la conséquence d'un effet local de Futsch à la terminaison synaptique. J'ai utilisé la microscopie d'éclairage structuré 3D (3D-SIM) pour étudier plus précisément la localisation de Futsch et des MTs au niveau de la ZA. Futsch et les MTs se trouvent presque toujours à proximité des ZAs, avec Futsch en position intermédiaire entre les MTs et les ZAs. En utilisant la technique de « proximity ligation assays », j'ai aussi démontré la proximité fonctionnelle de Futsch avec Bruchpilot un composant de la ZA, ce qui n'est pas le cas des MTs. En conclusion, mes données sont en faveur d'un modèle pour lequel Futsch stabilise localement les ZAs, en renforçant leur lien avec le cytosquelette de MTs sous-jacent. / Structural microtubule associated proteins like those belonging to the MAP1 family are known to control the stability and dynamics of microtubules (MTs). They are also known to interact with postsynaptic proteins like GABA or glutamate receptors. However, their presynaptic role in neurotransmitter release was barely studied. Here, we took advantage of the Drosophila model in which there is only one MAP1 homologue, called Futsch. We studied the function of Futsch at the larval neuromuscular junction (NMJ), where this protein is found presynaptically only. Here, we show that, in addition to its known function on NMJ morphology (Roos et al., 2000; Gogel et al., 2006), Futsch is also important for NMJ physiology, by controlling neurotransmitter release as well as active zone density. We show that this physiological effect of Futsch is not the consequence of disrupted microtubule bundle and disrupted axonal transport, but must be the consequence of a local effect of Futsch at the synaptic terminal. We used 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) to further study the localization of Futsch and MTs with respect to active zones. Both Futsch and MTs are almost systematically present in close proximity active zones, with Futsch being localized in-between MTs and active zones. Using proximity ligation assays, we further demonstrated the functional proximity of Futsch, but not MTs, with the active zone component Bruchpilot. Altogether our data are in favor of a model by which Futsch locally stabilizes active zones, by reinforcing their link with the underlying MT cytoskeleton.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une pathologie neurodégénerative progressive se déclarant vers 50-60 ans. Elle est majoritairement de nature sporadique son incidence est estimée à 1 :1000. La SLA mène à une paralysie progressive et entraine généralement à la mort des patients de 2 à 5 ans suivant le diagnostic aux suite d’une fonte musculaire importante liée à la perte des neurones moteurs. Au cours des années, plusieurs mutations ont été identifiées autant chez les patients atteints de SLA sporadique que de SLA familiale. Ces mutations interfèrent avec la fonction de gènes variés, tels que DCTN1, codant pour la protéine dynactine1, sous-unité du complexe multimoléculaire dynactine. Ce complexe sert d’adaptateur au moteur moléculaire dynéine, chargé du transport axonal rétrograde, où sa fonction permettrait de régir l’activité du complexe moteur et sa capacité à lier divers cargos. Nous avons donc entrepris la caractérisation d’une lignée de poissons zèbre mutants pour dynactin1a (nommés mikre okom632, mokm632), plus particulière en terme du développement d’un type de neurone moteur primaire (les CaPs), afin de déterminer l’effet de la perte de fonction de ce gène sur l’axonogenèse, la formation et la stabilisation de la jonction neuromusculaire, sur le comportement de l’embryon, ainsi que sur le transport axonal.Nous suggérons que dynactin1 favorise la stabilité synaptique, où une perte de fonction de ce gène entraine des défauts de croissance, des anomalies éléctrophysiologiques et un comportement anormal. Ce rôle semble être indépendant des fonctions connues de régulateur du moteur dynéine. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset neurodegenerative disease, which is mainly sporadic in nature. This progressive pathology has an estimated incidence of 1:1000 and generally leads to death within 2-5 years of diagnosis due to muscle wasting and severe motor neuron loss. Over the last years, mutations have been identified in both sporadic and familial ALS patients, interfering with the function of many genes, including DCTN1, which encodes for a subunit of the motor protein complex subunit dynactin. The dynactin complex serves as an adaptor for the dynein motor complex, responsible for retrograde axonal transport, and it is believed to regulate dynein activity and the binding capacity for cargos. We set out to characterize a mutant zebrafish line for dynactn1a (named mikre okom632, mokm632), looking specifically at caudal primary motor neurons (CaPs), with regard to axonal development, formation and stability of the neuromuscular junction (NMJ) and the behavioral phenotype produced in embryos, as well as axonal transport metrics. We suggest a role for dynactin1 in synapse stability, where the loss-of-function of this gene leads to growth defects, electrophysiological abnormalities and behavioral deficits. This role appears to be independent of its known function as a regulator of dynein, its implication in axonal transport, or its regulation of microtubule dynamics. With this study, we hope to elucidate key molecular mechanisms in ALS etiology by revealing the role of dynactin1 in NMJ development and maintenance.