L’objectif de la thérapie génique est de guérir des déficiences génétiques et de nombreuses maladies acquises par l'introduction d'acides nucléiques dans les cellules mammifères. Les vecteurs chimiques sont une alternative aux vecteurs viraux pour le transfert de gène, leur immunogénicité est réduite, en plus de leur faible coût et de la facilité de leur production. Jusqu'à présent, les liposomes et les polymères cationiques sont les vecteurs chimiques les plus étudiés et utilisés pour le transfert d'ADN plasmidique (ADNp) thérapeutique. Parmi les multiples barrières biologiques, la diffusion cytosolique limitée de l’ADNp est critique pour le niveau d'expression du transgène. Le but de ce travail de thèse était d'identifier un peptide de liaison à la dynéine, qui serait capable de recruter la protéine motrice dynéine et de faciliter le transport d’ADNp vers le noyau le long des microtubules. Nous avons donc étudié le réseau d'interaction de la protéine adénovirale E3-14.7K. E3-14.7K est indirectement en interaction avec la chaîne légère de la dynéine TCTEL1 par l’intermédiaire de FIP-1. Différentes techniques ont été utilisées pour analyser les interactions de ces différentes protéines telles que Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), Förster Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), immunoprécipitation et Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM). La technique de BRET nous a permis d'identifier un peptide de 20 acides aminés d'E3-14.7K (P79-98) responsable de son interaction avec FIP-1. Associé à des Quantum Dots P79-98 (P79-98-Qdot) colocalise avec les microtubules isolés et dans les cellules HeLa. Nous avons mis au point une méthode de greffage du peptide directement sur l’ADNp. Une fois greffé avec P79-98 l’ADNp est capable d'interagir avec les microtubules dans les cellules HeLa et de migrer activement jusqu’au noyau. P79-98 améliore l'efficacité de la transfection des HeLa jusqu’à 77%. / Gene therapy aims to cure genetic deficiencies and a large variety of acquired diseases by the introduction of nucleic acids into mammalian cells. As an alternative to viral gene delivery vectors, chemical vectors have been developed with reduced immunogenicity, in addition to low cost and ease of production. So far, cationic liposomes and cationic polymers are the most studied and used chemical vectors to transfer therapeutic plasmid DNA (pDNA). Among multiple biological barriers, the limited cytosolic diffusion of pDNA is critical for level of transgene expression. The goal of this work was to identify a dynein-binding peptide which would facilitate the transport of pDNA to the nucleus along microtubules. To this end, we have investigated interaction network of adenoviral protein E3 14.7K. E314.7K is indirectly interacting with Dynein Light Chain TCTEL1 through FIP-1. Different techniques have been used to analyze the protein interactions such as Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), Förster Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), immunoprecipitation and Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM). BRET technique allow us to identify a 20 amino acids peptide of E3 14.7K (P79-98) responsible for its interaction with FIP-1. Associated with Quantum Dots P79-98 (P79-98-Qdot) gave colocalizations with isolated microtubules and microtubules in HeLa cells. We have developed the grafting of the peptide directly on the pDNA. Once grafted with P79-98 pDNA is able to interact with microtubules in HeLa cells and traffick along them toward nucleus. Remarkably transfection efficiency of polyplexes is increased up to 77% in HeLa cells.

Le terme de CLIP-170 désigne la protéine de lien cytoplasmique de 170 KDa, isolée par Rickard et Kreis (1990). In vitro, elle constitue un lien statique entre les endosomes et les microtubules (MTs). En chacun des points où la CLIP-170 est localisée, elle se co-distribue avec le complexe moteur dynéine/dynactine (D/D). Les auteurs ont initialement établi un modèle de fonctionnement de concert de ces trois protagonistes : la CLIP-170 établirait le lien initial entre le cargo et le MT. Le complexe D/D serait recruté sur le cargo. Une fois le moteur associé au MT, le lien statique serait levé, rendant possible le mouvement. Ce modèle offrait une explication aux données d'immunolocalisation. Toutefois, le fonctionnement de concert de la CLIP-170 et du moteur moléculaire nécessitait que l'on puisse trouver une interaction entre les protagonistes. Les travaux présentés dans cette thèse apportent pour la première fois la preuve d'une interaction indirecte entre le complexe D/D et la CLIP-170. LIS1 est une protéine codée par le gène causal du syndrome de Miller-Dieker, une forme de lissencéphalie de type I. Elle sert d'adaptateur entre le domaine carboxy-terminal de la CLIP-170 et le complexe moteur dont elle régule l'activité. Nos résultats établissent que le domaine d'interaction de la CLIP-170 avec LIS1 est requis pour l'adressage de la première aux kinétochores prémétaphasiques. Il est nécessaire à l'adressage de LIS1 (et du complexe moteur) aux bouts (+) des MTs interphasiques. Nous présentons deux nouvelles approches permettant d'interférer avec le fonctionnement de la CLIP-170 tant en interphase qu'en mitose : la microinjection d'anticorps dirigés contre les domaines extrêmes de la protéine, ainsi que l'utilisation de siRNA dirigés contre l'ARNm la codant. Combinées aux techniques de suivi de protéines fluorescentes par vidéomicroscopie 3D développées au laboratoire, elles permettront d'interférer avec le fonctionnement de la CLIP-170 et de définir ainsi son rôle.

(I) J'ai étudié les mécanismes contrôlant la congression des noyaux pendant la conjugaison de la levure S. pombe. A l'aide d'imagerie à long terme basée sur la microfluidique, j'ai mesuré la durée précise de la congression nucléaire et démontré que deux moteurs moléculaires des MTs, la dynéine et la kinésine-14 Klp2 contribuent à ce processus, dans des voies parallèles. La dynéine s’associe aux SPBs. Son niveau au SPB dépend de la chaine légère intermédiaire Dli1 qui pourrait potentiellement stabiliser le complexe dynéine et est requise pour la congression. Klp2 se localise sur les MTs. La localisation différentielle des deux moteurs suggère des rôles distincts pour tirer les noyaux l'un vers l'autre. Klp2 pourrait induire le glissement de MTs antiparallèles émanant des SPBs, alors que la dynéine localisée au SPB pourrait tirer sur des MTs émanant du SPB opposé.(II) J'ai caractérisé un nouveau facteur morphogénétique, l’AAA+-ATPase Knk1, qui promeut la croissance linéaire chez S. pombe. L’absence de Knk1 provoque la formation d’un coude à proximité des extrémités cellulaires. Ce défaut ne résulte pas de défauts des MTs, qui participent à la linéarité de la croissance. Knk1 se localise aux extrémités de la cellule indépendamment des MTs et des câbles d’actine. Cette localisation requiert son N-terminus et est renforcée quand le domaine ATPase C-terminal lie l’ATP. La concentration de Knk1 aux extrémités est aussi contrôlée par Sla2 et Cdc42, de manière anti-correlée, et indépendamment de l’endocytose. Enfin, Knk1 oscille périodiquement entre les deux extrémités, indépendamment des oscillations de Cdc42, suggérant l'existence d'au moins deux systèmes oscillatoires séparés. / (I) I studied the molecular mechanisms underlying nuclear congression during fission yeast conjugation. Using microfluidic-based long-term imaging, I defined the precise timing of nuclear congression compared to cell mating and found that two MT molecular motors, dynein and the kinesin-14 Klp2 promote nuclear congression in parallel pathways. Dynein associates with SPBs. Dynein level at SPBs is controlled by the light intermediate chain Dli1 that may promote stabilization of the dynein complex and is essential for dynein-dependent nuclear congression, while dynactin is surprisingly not required for this process. Klp2 localizes along MTs. These differential localization patterns suggest distinct roles for the two motors in pulling the nuclei together: Klp2 may slide anti-parallel MTs emanating from the SPBs, while dynein at the SPB may pull on MTs emanating from the opposite SPB.(II) I characterized a novel morphogenetic factor, the AAA+-ATPase Knk1, supporting linear growth in fission yeast. knk1Δ cells display a kink close to cell tips, a unique shape phenotype that is neither caused by defects in behavior of MTs that promote linear extension. Knk1 localizes to cell tip independently of MTs and actin cables. This localization is mediated by Knk1 N-terminus and enhanced upon ATP binding to Knk1 C-terminal ATPase domain. Knk1 tip levels are enhanced in a sla2 or cdc42, independently of Sla2 role in endocytosis. Finally, Knk1 oscillates between the two cell tips in an anti-correlated periodic manner possibly uncoupled from Cdc42 oscillations suggesting the existence of at least two separated oscillatory systems contributing to fission yeast morphogenesis.

Le virus de l’hépatite B (VHB) utilise la machinerie transcriptionnelle nucléaire pour sa réplication. Le génome viral est transporté de la périphérie cellulaire à l’enveloppe nucléaire. Généralement, ce transport intracytoplasmique rétrograde est facilité par le réseau de Mt via l’utilisation du complexe moteur de la dynéine. Nous avons montré que le transport des capsides du VHB dépend des Mt, ce qui permet l’adressage des capsides aux complexes du pore nucléaire (NPC) ; lequel est requis pour l’étape de libération du génome de la capside dans le noyau.Dans cette étude, nous avons utilisé des capsides provenant de virus récupérés dans du surnageant de HepG2.2.15, qui contiennent le génome mature partiellement double brin (capsides matures), et des capsides exprimées chez E.coli. Ces dernières sont utilisées telles quelles, capsides E.coli contenant de l’ARN, ou bien sont utilisées pour préparer des capsides vides. Après microinjection dans des ovocytes de Xenopus laevis, nous avons observé que les capsides vides et les capsides matures sont transloquées aux NPC avec une cinétique similaire. Les capsides contenant de l’ARN ne sont pas identifiées aux NPCs ce qui implique que le transport des deux autres types de capsides est actif. Cela a été confirmé par la pré-injection d’anticorps anti tubuline qui neutralisent le transport assuré par les Mt.L’attachement spécifique des capsides matures et vides aux Mt a été confirmé en utilisant des Mt polymérisés in vitro, nous avons montré que cette interaction nécessitait des protéines cytosoliques. En utilisant des expériences de coïmmunoprécipitation et de cosédimentation nous avons identifié une chaîne légère de la dynéine (DynLL1 membre de la famille Lc8) comme partenaire des capsides. Dans les expériences de microinjection, la comicroinjection d’un excès de DynLL1 avec les capsides inhibe leur transport vers les NPCs, indiquant que DynLL1 est impliquée dans le transport actif des capsides.DynLL2 qui n’interagit pas avec les capsides diffère de DynLL1 de seulement six acides aminés. Par mutagénèse dirigée de DynLL1, nous avons montré l’implication de deux acides aminés dans l’interaction directe avec les capsides. Ces deux acides aminés sont présents à la surface du dimère de DynLL1 et absents dans le sillon résultant de la dimérisation de DynLL1, sillon impliqué dans l’interaction avec la DynIC. Nous avons partiellement reconstitué le complexe DynIC, DynLL1 et capsides vides qui doit en partie refléter la situation in vivo. / Hepatitis B virus (HBV) needs the nuclear transcription machinery for replication. The virus thus depends on the transport of its genome from the cell periphery to the nuclear envelope. In general this retrograde intracytoplasmic trafficking is facilitated along Mt (MT) using motor protein complexes of the dynein family. As we showed earlier HBV capsid transport also depends upon intact MT in order to allow their arrival at the nuclear pores, which in turn is required for genome liberation from the capsid.In the analysis we used virus-derived HBV capsids obtained from the supernatant of HepG2.2.15, which contain the mature partially double-stranded DNA genome (mature capsids) and capsids expressed in E. coli. The latter were applied in two forms: as unspecific E. coli RNA- containing capsids and as empty capsids. Upon microinjection into Xenopus laevis oocytes we observed that mature and empty capsids were translocated to the nuclear pores with a similar kinetic. RNA-containing capsids failed to arrive at the pores implying that transport of the two other capsid types was active. Active translocation was confirmed by pre-injecting anti tubulin antibodies which interfere with MT-mediated translocation.In vitro reconstitution assays confirmed the specific attachment of mature and empty capsids to MTs and showed the need of further cytosolic proteins. Using pull-down and co-sedimentation experiments we identified one dynein light chain (DYNLL1, member of the Lc8 family) as interaction partner of the capsids. Injecting an excess of recombinant DYNLL1 with empty capsids into Xenopus laevis oocytes inhibited capsid transport to the nuclear pores indicating that DYNLL1 was only functional interaction partner implied in active transport.DNYLL2 did not interact with the capsids although differing from DYNLL1 by just six amino acids. Site directed mutagenesis of DYNLL1 revealed that two amino acids were critical for a direct interaction with the capsids. Both localized at the exterior of the DYNLL1 dimer and not in the groove of DYNLL1, which interacts with the dynein intermediate chain. Accordingly we could reconstitute a complex consisting of empty capsids, DYNLL1 and dynein intermediate chain as it should be in the in vivo situation.

L'objectif de la thérapie génique est de guérir des déficiences génétiques et de nombreuses maladies acquises par l'introduction d'acides nucléiques dans les cellules mammifères. Les vecteurs chimiques sont une alternative aux vecteurs viraux pour le transfert de gène, leur immunogénicité est réduite, en plus de leur faible coût et de la facilité de leur production. Jusqu'à présent, les liposomes et les polymères cationiques sont les vecteurs chimiques les plus étudiés et utilisés pour le transfert d'ADN plasmidique (ADNp) thérapeutique. Parmi les multiples barrières biologiques, la diffusion cytosolique limitée de l'ADNp est critique pour le niveau d'expression du transgène. Le but de ce travail de thèse était d'identifier un peptide de liaison à la dynéine, qui serait capable de recruter la protéine motrice dynéine et de faciliter le transport d'ADNp vers le noyau le long des microtubules. Nous avons donc étudié le réseau d'interaction de la protéine adénovirale E3-14.7K. E3-14.7K est indirectement en interaction avec la chaîne légère de la dynéine TCTEL1 par l'intermédiaire de FIP-1. Différentes techniques ont été utilisées pour analyser les interactions de ces différentes protéines telles que Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), Förster Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), immunoprécipitation et Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM). La technique de BRET nous a permis d'identifier un peptide de 20 acides aminés d'E3-14.7K (P79-98) responsable de son interaction avec FIP-1. Associé à des Quantum Dots P79-98 (P79-98-Qdot) colocalise avec les microtubules isolés et dans les cellules HeLa. Nous avons mis au point une méthode de greffage du peptide directement sur l'ADNp. Une fois greffé avec P79-98 l'ADNp est capable d'interagir avec les microtubules dans les cellules HeLa et de migrer activement jusqu'au noyau. P79-98 améliore l'efficacité de la transfection des HeLa jusqu'à 77%.

Les microtubules (MT) sont des structures dynamiques contrôlant divers aspects essentiels de l'architecture<br />cellulaire. En particulier, les bouts plus des MT (bouts +) sont capables d'accumuler des protéines spécifiques jouant un rôle dans le contrôle de la dynamique microtubulaire et dans l'interaction des MT avec le cortex cellulaire. Ces interactions sont notamment décisives pour le positionnement correct du fuseau mitotique. La description des mécanismes permettant l'accumulation de protéines aux bouts + est donc importante pour la compréhension des fonctions microtubulaires.<br />La tyrosine C-terminale de la tubuline α est cruciale pour l'interaction de protéines à domaine CAP-Gly avec les bouts +. En effet, CLIP-170 et son homologue de S.cerevisiae Bik1p se lient moins bien aux bouts + des MT dépourvus de tyrosine C-terminale (MT Glu).<br />Dans ce travail de thèse, nous avons étudié les perturbations associées au déficit de liaison de Bik1p aux bouts + des MT Glu dans S. cerevisiae.<br />Les modèles actuels proposent que Bik1p est amenée aux bouts + par son association avec la kinésine Kip2p. La dynéine (Dyn1p) est alors recrutée par Bik1p aux bouts + pour être ciblée vers le cortex. Nous montrons<br />que, dans des levures n'exprimant que de la tubuline détyrosinée (souche tub1-Glu), Kip2p et Dyn1p sont<br />correctement associées aux bouts +, malgré le déficit de liaison de Bik1p. Nous proposons que, dans les cellules<br />sauvages, le complexe Kip2p/Bik1p transporte Dyn1p le long des MT vers les bouts +. Kip2, Bik1p et Dyn1p<br />s'associent alors aux bouts + de façon indépendante.<br />De plus, nous montrons que des formes constitutionnellement actives de la petite protéine G Rho1p favorisent l'association de Bik1p avec les bouts +. Ces données seront importantes pour comprendre le rôle des Rho GTPases dans la régulation des MT, notamment dans la migration cellulaire.<br />L'ensemble de ce travail suggère de nouveaux modèles pour la formation et la fonction des complexes protéiques associés aux bouts +.<br />Finalement, nous avons recherché de manière systématique les mutations qui, associées avec la mutation tub1-Glu, sont létales chez la levure (létalité synthétique). Ce crible a identifié des composants participant à la formation de la membrane et de la paroi cellulaire. Ces gènes pourraient être impliqués, au niveau cortical, dans la mise en place des interactions des microtubules avec le cortex, et montrent l'importance de la tyrosine C-terminale de la tubuline α dans cette fonction.

La CLIP-170 (Cytoplasmic Linker Protein of 170 kDa) est requise, in vitro, pour l'établissement d'un lien statique entre les endosomes et les microtubules (MTs). Elle se localise, in vivo, aux bouts « plus » des MTs en croissance et semble participer ainsi à la capture de ces derniers au cortex cellulaire et aux kinétochores. Elle contribue au contrôle de la dynamique des MTs et semble aussi recruter le complexe moteur dynéine cytoplasmique/dynactine sur les extrémités « plus » des MTs, via son domaine carboxy-terminal. La CLIP-170 s'associe également aux kinétochores d'une façon dépendante du complexe dynéine/dynactine et de son domaine C-terminal. Ce domaine C-terminal contient deux motifs de type « doigt de zinc » (proximal et distal) probablement impliqués dans des interactions avec d'autres protéines.<br />Nous rapportons ici la démonstration d'une interaction directe entre la CLIP-170 et LIS1, une protéine capable, par ailleurs, d'interagir directement avec le complexe dynéine/dynactine. LIS1 est mutée chez de nombreux patients atteints d'une lissencéphalie de type I et semble jouer le rôle de co-facteur activateur de la dynéine cytoplasmique. Nous avons montré que cette interaction dépendait du doigt de zinc distal de la CLIP-170 et nous avons apporté des éléments indiquant une possible régulation de cette interaction par phosphorylation.<br />L'étude des fonctions cellulaires potentielles de cette interaction nous a permis de mettre en évidence un enrichissement de LIS1 aux extrémités « plus » des MTs. Elle a fourni des éléments substantiels laissant supposer que cette localisation, comme celle de la dynactine au même endroit, était dépendante du domaine C-terminal de la CLIP-170. Par ailleurs, nous avons démontré que la localisation de la CLIP-170 sur le kinétochore dépendait de son domaine d'interaction avec LIS1, et que le recrutement de LIS1 au même site dépendait du complexe dynéine/dynactine. L'ensemble de ces données suggère que LIS1 constitue un adaptateur entre la CLIP-170 et le complexe moteur dynéine/dynactine.<br />Parallèlement, nous avons initié l'étude de protéines LIS1 qui présentent chacune une mutation ponctuelle dans diverses régions conservées. Ces mutations ponctuelles ont été découvertes chez des patients atteints d'une lissencéphalie de type I plus ou moins sévère. Par des approches biochimiques, moléculaires et cellulaires, nous avons montré que, selon la sévérité de la maladie, les différentes propriétés de LIS1 (repliement, stabilité, localisations sub-cellulaires, interaction avec ses partenaires et liaison aux MTs) étaient plus ou moins affectées. À l'occasion de cette étude, nous avons également identifié les domaines de LIS1 impliqués dans l'interaction avec les MTs et d'autres partenaires comme les sous-unités catalytiques du PAFAH(I) (Platelet-Activating Factor Acétylhydrolase).

L'élongation embryonnaire de C. elegans a lieu en deux étapes. La première phase est permise par les contractions d’actomyosine et régulée par les kinases let-502 et pak-1. La seconde dépend des contractions musculaires (après le stade 1,7-fold). La tension fournie par ces contractions permet le recrutement de GIT-1 aux hémidesmosomes, facilitant la poursuite de l’élongation via l’activation de PAK-1 (Nature, 2011). Étonnamment, en l'absence de git-1 ou pak-1, l'élongation se poursuit, nous conduisant à émettre l'hypothèse de voies de régulation parallèles. Un crible ARNi a été réalisé pour rechercher les candidats impliqués. La majorité des candidats interagissant fortement avec git-1 appartenait au complexe dynéine-dynactine. En utilisant des allèles sensibles à la température et des protéines affectant les microtubules, nous avons décrit un rôle de la dynactine indépendant des microtubules dans l'épiderme ainsi que son interaction avec la spectraplakine vab-10 et la spectrine spc-1. / C. elegans embryonic elongation is driven by 2 forces: Actomyosin contractility and Muscle contraction (after 1.7-fold). Actomyosin contraction is regulated by the Rho kinase and the serine/threonine p21 activated kinase pak-1. Tension provided by muscle contraction recruits GIT-1 to hemidesmosomes (HD), which in turn facilitates further elongation by activating proteins such as PAK-1 (Nature 2011). Surprisingly in absence of git-1/pak-1, elongation still continues, which led us to hypothesize parallel pathways. An RNAi screen was performed to get the candidates in the parallel pathway/s. Candidates interacting strongly with git-1 belonged to the Dynein Dynactin complex. By use of temperature sensitive alleles and microtubule severing proteins, we found a microtubule independent role of Dynactin in epidermis and that dynactin functionally interacts with spectraplakin vab-10 and spectrin spc-1, which allows us to portray the role of Dynein Dynactin complex during embryonic elongation.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une pathologie neurodégénerative progressive se déclarant vers 50-60 ans. Elle est majoritairement de nature sporadique son incidence est estimée à 1 :1000. La SLA mène à une paralysie progressive et entraine généralement à la mort des patients de 2 à 5 ans suivant le diagnostic aux suite d’une fonte musculaire importante liée à la perte des neurones moteurs. Au cours des années, plusieurs mutations ont été identifiées autant chez les patients atteints de SLA sporadique que de SLA familiale. Ces mutations interfèrent avec la fonction de gènes variés, tels que DCTN1, codant pour la protéine dynactine1, sous-unité du complexe multimoléculaire dynactine. Ce complexe sert d’adaptateur au moteur moléculaire dynéine, chargé du transport axonal rétrograde, où sa fonction permettrait de régir l’activité du complexe moteur et sa capacité à lier divers cargos. Nous avons donc entrepris la caractérisation d’une lignée de poissons zèbre mutants pour dynactin1a (nommés mikre okom632, mokm632), plus particulière en terme du développement d’un type de neurone moteur primaire (les CaPs), afin de déterminer l’effet de la perte de fonction de ce gène sur l’axonogenèse, la formation et la stabilisation de la jonction neuromusculaire, sur le comportement de l’embryon, ainsi que sur le transport axonal.Nous suggérons que dynactin1 favorise la stabilité synaptique, où une perte de fonction de ce gène entraine des défauts de croissance, des anomalies éléctrophysiologiques et un comportement anormal. Ce rôle semble être indépendant des fonctions connues de régulateur du moteur dynéine. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset neurodegenerative disease, which is mainly sporadic in nature. This progressive pathology has an estimated incidence of 1:1000 and generally leads to death within 2-5 years of diagnosis due to muscle wasting and severe motor neuron loss. Over the last years, mutations have been identified in both sporadic and familial ALS patients, interfering with the function of many genes, including DCTN1, which encodes for a subunit of the motor protein complex subunit dynactin. The dynactin complex serves as an adaptor for the dynein motor complex, responsible for retrograde axonal transport, and it is believed to regulate dynein activity and the binding capacity for cargos. We set out to characterize a mutant zebrafish line for dynactn1a (named mikre okom632, mokm632), looking specifically at caudal primary motor neurons (CaPs), with regard to axonal development, formation and stability of the neuromuscular junction (NMJ) and the behavioral phenotype produced in embryos, as well as axonal transport metrics. We suggest a role for dynactin1 in synapse stability, where the loss-of-function of this gene leads to growth defects, electrophysiological abnormalities and behavioral deficits. This role appears to be independent of its known function as a regulator of dynein, its implication in axonal transport, or its regulation of microtubule dynamics. With this study, we hope to elucidate key molecular mechanisms in ALS etiology by revealing the role of dynactin1 in NMJ development and maintenance.

L’objectif repose sur l’élaboration de vecteurs d’ADN fonctionnalisés par des séquences peptidiques, DLC8-AS, ciblant les chaînes légères LC8 de la dynéine cytoplasmique, pour obtenir un transport actif jusqu’au noyau le long des microtubules (MTs). Des travaux précédents, menés sur des fluosphères fonctionnalisées par des DLC8-AS, ont montré une efficacité remarquable à condition de travailler avec de hauts taux de ligands. De tels niveaux de ligands ne sont pas transposables à des nanoparticules (NPs) d’ADN car ils affectent grandement leur stabilité colloïdale. Pour compenser cela, nous avons développé dans cette thèse, des NPs d’ADN faiblement fonctionnalisées (2-10 mol %) portant des dimères de DLC8-AS afin de bénéficier d'un effet dimérique vis-à-vis de la dynéine qui augmente l'affinité. Parmi les systèmes testés, 2 ont montré un gain lié à l’effet dimérique des DLC8-AS. Le 1er est basé sur un amphiphile cationique dimérisable de la cystéine, utilisé avec son homologue pegylé portant un motif DLC8-AS, pour produire, via l’oligomérisation des thiols, une population monodisperse de petites NPs d’ADN décorées (~60 nm). Les expériences menées sur cellules HeLa ont montré que les NPs décorées par les dimères de DLC8-AS avaient des efficacités de transfection améliorées (~250 fois) grâce à un mécanisme dépendant du système dynéine/MTs. Dans l’autre système, la surface de polyplexes de PEI a été décorée avec des amphiphiles octaarginine mono- ou bis-DLC8-AS. De façon remarquable, l’efficacité de transfection des polyplexes portant les ligands dimériques a été améliorée d’un facteur 50 par rapport au JetPEI standard. Ici encore, le mécanisme dépend des MTs. / The aim consists in engineering DNA carriers functionalized by peptide sequences, DLC8-AS, targeting the LC8 light chains of cytoplasmic dynein, to promote active transport towards the nucleus along the microtubules (MTs).Dépôt de thèseDonnées complémentairesPrevious works based on polystyrene fluospheres functionalized with DLC8-AS, showed a noteworthy transfection enhancement but as a cost of high levels of ligands. Such levels of functionalization are unsuitable for maintaining sufficient colloidal stability of DNA nanoparticles (NPs). In order to compensate for this, we developed in this thesis weakly functionalized DNA NPs (2-10 mol %) bearing dimers of DLC8-AS to benefit from a dimeric effect toward the dynein which increase the affinity. Among our designed systems, two revealed the benefit from taking advantage from the dimeric effect of DLC8-AS. The 1st one relies on a cationic and dimerizable cysteine based amphiphile, which was used with its dimerizable pegylated homologue containing DLC8-AS, to produce, through a thiol-disulfide oligomerisation process, a monodisperse population of small sized functionalized DNA NPs (~60 nm). Experiments carried out onto HeLa cells, showed that DNA NPs functionalized with DLC8-AS dimers exhibited enhanced transfection properties (~250 times) through a dynein/MTs dependant mechanism. The second consists in functionalizing the surface of PEI polyplexes with octaarginine amphiphiles carrying a mono- or bis-DLC8-AS. Remarkably, the transfection efficiency of polyplexes bearing the dimeric ligands was increased by a 50 times factor compared to the JetPEI golden standard. Here too, the mechanism strongly depends on MTs.