Les spectrines, protéines liant l'actine, sont des constituants majeurs du squelette membranaire, réseau multiprotéique localisé sous la membrane plasmique. Érythroïdes ou non érythroïdes (dans ce cas, on les appelle fodrines), les spectrines ont un rôle structural important dans la membrane comme cela a déjà été démontré, pour la spectrine, dans le globule rouge. Elles sont constituées de deux longues chaînes a et ß associées côte à côte en tétramères (aß)2 qui forment les longs filaments du réseau. Chacune des chaînes est composée par la répétition de segments homologues, 22 pour a et 17 pour ß. Ces segments sont constitués de trois hélices a (hélices A, B et C) repliées sur elles-mêmes. Cette succession de structures trihélicoïdales est parfois interrompue par un domaine particulier comme le domaine SH3 (Src Homology 3) présent au milieu de la chaîne a. Les tétramères (aß)2 de spectrine constituent les filaments du squelette membranaire. L'interaction tête-à-tête de deux dimères aß implique les extrémités NH2 de la chaîne a et COOH de la chaîne ß. D'une part la sévérité du défaut d'auto-association et la localisation des mutations associées à celui-ci et d'autre part, les séquences en acides aminés des extrémités impliquées dans le site d'auto-association ont permis de proposer un modèle : la première hélice C isolée de la chaîne a pourrait s'associer aux deux dernières hélices A et B de la chaîne ß pour reconstituer une unité conformationnelle trihélicoïdale semblable à celles observées le long de la molécule. Un défaut dans la formation du tétramère est le support moléculaire le plus fréquemment observé dans les elliptocytoses héréditaires (HE). À l'aide de peptides recombinants, nous avons défini, sur les deux chaînes, les régions nécessaires et suffisantes possédant les caractéristiques pleinement fonctionnelles du site de tétramérisation. Nous avons ensuite, par mutagenèse dirigée, reproduit le lien entre la présence de mutations HE localisées dans les hélices A ou B et le défaut d'auto-association observé dans les globules rouges de patients HE. La présence d'un domaine SH3 localisé au milieu de la chaîne a confère probablement aux spectrine des fonctions autres que le maintien et la stabilité de la membrane. Les SH3, petits domaines protéiques, participent aux interactions protéine/protéine. Le seul partenaire connu du domaine SH3 de la fodrine était la sous-unité a du canal sodium sensible à l'amiloride (ENaC) mais la fonction de ce complexe n'était pas encore caractérisée. À l'aide de différentes méthodes, nous avons remis en cause l'interaction directe entre ENaC et le SH3 de la fodrine. La fonction de ce domaine SH3 étant liée à la nature de son ligand, nous avons donc recherché les partenaires putatifs du domaine SH3 de la fodrine par la technique du double-hybride. 29 partenaires ont été identifiés, regroupés en 19 familles et 10 clones isolés. La spécificité des interactions a été étudiée à la fois par double-hybride, à l'aide de mutants du domaine SH3 de la fodrine produits par mutagenèse dirigée. Les interactions vis-à-vis d'autres domaines SH3 (spectrine ou une protéine de levure non relatée Scd2) ont été également analysées. Enfin, la spécificité de certains partenaires a été confirmée par des études d'interactions in vitro. Deux des protéines les plus spécifiques du domaine SH3 de la fodrine sont des protéines tyrosine-phosphatase PTP. La première est l'isoforme A de PTP de faible poids moléculaire (LMPTPA) mais l'interaction n'a pas été confirmée in vitro. La deuxième, TD14, est une nouvelle PTP dont la seule fonction connue est d'inhiber la formation des foyers tumoraux des cellules surexprimant l'oncogène Ha-ras. Ces PTP pourraient soit déphosphoryler la fodrine, soit être recrutées sous la membrane pour déphosphoryler une autre cible. Nous avons également identifié trois partenaires (N-WASP, Evl et une protéine de la famille des formines) suggérant que les domaines SH3 des spectrines pourraient être impliqués dans les processus de polymérisation de l'actine liés à la mobilité ou la différenciation cellulaire. Mot clés : spectrine, fodrine, tétramérisation, SH3, double-hybride, polymérisation de l'actine

Mes premiers travaux de recherche, me permettant de soutenir une thèse de doctorat en décembre 1999, ont été effectués au sein du laboratoire du professeur Bernard GRANDCHAMP (unité 409 de l'INSERM) sous la direction du docteur Marie-Christine LECOMTE. Mon travail s'est intégré dans l'étude fonctionnelle et structurale de certains domaines des spectrines érythroïdes et non érythroïdes, principalement le site de tétramérisation et le domaine SH3. Concernant la tétramérisation de la spectrine érythroïde j'ai identifié les régions minimales nécessaires et suffisantes pour former le tétramère puis j'ai mis en évidence une relation entre certaines mutations de la spectrine associées à des anomalies membranaires du globule rouge et la sévérité du défaut de formation du tétramère. J'ai ensuite identifié plusieurs ligands du domaine SH3 de la spectrine non érythroïde. L'un d'entre eux m'a permis de définir une régulation de la protéolyse ciblée de cette spectrine faisant intervenir un mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation. Ma formation initiale fut donc celle d'un biochimiste que j'ai étendue peu à peu vers la biologie moléculaire et la biologie cellulaire.<br />Puis, souhaitant acquérir les connaissances nécessaires au développement de modèles murins, j'ai décidé d'effectuer mon stage post-doctoral à l'Institut COCHIN (unité 567 de l'INSERM) dans une équipe co-dirigée par le docteur Sophie VAULONT et le professeur Axel KAHN. Je me suis ainsi familiarisé avec la souris comme « outil » de recherche (gestion d'un élevage, établissement de nouvelles lignées, génotypage, phénotypage). Je travaillais initialement sur le métabolisme du glucose mais j'ai complètement réorienté ma thématique de recherche au bout d'un an pour finalement identifier et caractériser une hormone, l'hepcidine, contrôlant l'homéostasie du fer.<br />J'ai été nommé chargé de recherche de grade 2 dans l'unité 409 de l'INSERM en octobre 2002 pour y développer une souche de souris exprimant une spectrine non érythroïde résistante à des mécanismes de protéolyse ciblée. Il s'agit donc toujours d'appréhender certaines fonctions des spectrines mais dans un contexte in vivo. En janvier 2005 j'ai intégré l'unité 665 de l'INSERM dirigée par Yves COLIN afin de poursuivre ce projet. Aujourd'hui, je suis chargé de recherche de grade 1.<br />Le chapitre scientifique de ce mémoire est divisé en deux parties distinctes : la première traite de mon travail sur la spectrine tandis que la seconde porte sur l'hepcidine. Chaque partie est composée d'une introduction au sujet suivie d'un résumé des travaux que j'ai effectués et/ou dirigés.

Les canaux potassiques à deux domaines P (K2P) contrôlent l’excitabilité cellulaire et jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos membranaire dans la majorité des cellules animales. Depuis leur identification dans les années 90, ces canaux ont été impliqués dans de nombreuses fonctions comme la modulation de l’activité neuronale, l’activité du muscle cardiaque ou encore la physiologie rénale. Malgré l’importance de ces canaux, peu de données existent sur les processus cellulaires qui contrôlent leur fonction in vivo. Au cours de ma thèse, j’ai utilisé des approches génétiques, d’imagerie et d’électrophysiologie pour comprendre comment l’expression, la distribution et l’activité du canal K2P UNC-58 sont contrôlés chez le nématode modèle C. elegans.Pour cela, j’ai effectué un crible suppresseur du phénotype locomoteur du mutant gain de fonction unc-58(e665). J’ai ainsi obtenu 133 mutants présentant une large gamme de niveaux de suppression, suggérant l’implication de plusieurs gènes dans les processus de régulation du canal. En utilisant les technologies de reséquençage complet de génome, j’ai pu cloner six nouveaux gènes requis pour la fonction d’unc 58.J’ai ensuite caractérisé en détail le rôle d’unc-44/ankyrine dans le contrôle du trafic d’unc 58. Ce travail a conduit à 4 conclusions majeures : (1) UNC-58, malgré sa structure de canal potassique, possède en réalité une sélectivité ionique altérée favorisant le passage des ions sodium, (2) l’addition à UNC 58 de protéine fluorescente par approche CRISPR/Cas9 nous a permis pour la première fois d’observer directement la distribution du canal UNC-58 in vivo, (3) l’ankyrine est nécessaire à l’adressage du canal UNC-58 à la surface des muscles et dans les axones des neurones mécanosenseurs ALM. Cette fonction fait intervenir une poche d’interaction lipidique localisée au sein du module Zu5N-Zu5C-UPA d’UNC-44, (4) ce mécanisme est hautement sélectif puisqu’il n’est pas requis pour l’adressage de 6 autres canaux potassiques musculaires. Mon crible a également identifié une interaction génétique entre unc-70/ß-spectrine et unc-44/ankyrine. Toutefois, la nature moléculaire de cette interaction reste encore à préciser / Two-pore potassium channels (K2P) control cell excitability and play a central role in the establishment and the maintenance of the resting membrane potential of almost all animal cells. Since their identification in the late 90s, these channels have been implicated in a large number of functions ranging from neuronal and cardiac activity to kidney physiology. Despite the crucial functions of these channels, comparatively little is known about the cellular processes controlling their function in vivo. During my PhD, I used a wide range of strategies including genetics, microscopy and electrophysiology to understand how the expression, the distribution and the activity of the K2P channel UNC-58 are controlled in the model nematode C. elegans. I have first performed a genetic suppressor screen targeting the locomotion phenotype of the gain of function mutant unc-58(e665). The screen yielded 133 mutants, displaying a wide range of suppression level, suggesting that several genes may be implicated in the channel regulation process. By using whole genome sequencing technologies, I’ve been able to clone six new genes required for the function of UNC-58.Then, I’ve characterized in detail the role of unc-44/ankyrin in the trafficking of UNC 58. This project led to 4 main conclusions : (1) UNC-58, despite its potassium channel structure, has an altered ionic selectivity, allowing preferably sodium ions to pass through the channel (2) the addition of a fluorescent protein to UNC-58 by CRISPR/Cas9 approaches allowed us for the first time to directly observe the addressing of the UNC-58 channel to the muscle surface and axons of ALM mechanosensory neurons. This function involves a lipid binding pocket located within the Zu5N-Zu5C-UPA module of UNC-44, (4) this mechanism is highly selective since it is not required for the addressing of 6 other muscular channels.My screen also identified a genetic interaction between unc-70/ß-spectrin and unc-44/ankyrin. However, the exact molecular nature of this interaction remains to be elucidated

Le squelette dépendant de la spectrine, localisé sous la bicouche lipidique, est un échafaudage essentiel de toutes les cellules animales. La Spectrine (Sp), structure géante, robuste mais flexible d'hétéro tétramères (αβ)2, constitue les filaments de ce réseau, dont chaque nœud interagit avec des filaments d'actine. Les fonctions du squelette de Sp, qui sont bien définies dans le globule rouge (rôle dans sa forme, dans sa résistance aux forces de cisaillement et dans sa déformabilité) sont moins bien connues dans les cellules non-érythroïdes. La Sp non-érythroïde pourrait participer à l'établissement et/ou au maintien de sous-domaines membranaires spécialisés dans l'accumulation de protéines de membrane (telles que les canaux ioniques, les pompes ioniques, les récepteurs et les molécules d'adhérence) comme nous le font penser les invalidations de la Sp-β non-érythroïde. Cependant le rôle de la Sp-α non-érythroïde est moins bien établi. Chez les mammifères, la Sp-α est codée par deux gènes: un pour Sp-αI, principalement exprimée dans l'érythrocyte mature, le second pour Sp-αII qui est exprimée dans toutes les cellules nucléées. Pour étudier les fonctions de la Sp-αII, nous avons utilisé une approche de SiRNA sur des cellules de mélanome humain. Nos données montrent que la diminution de Sp-αII est associée à I) un arrêt en G1 du cycle cellulaire II) une perte d'adhérence des cellules malgré l'augmentation de quelques intégrines III) des modifications dans l'organisation du réseau d'actine.

Le syndrome d’Usher (USH) cause une surdité-cécité chez l’homme. Au moins neuf gènes responsables ont été identifiés. L’origine de l’atteinte auditive a été dévoilée par l’analyse de souris mutantes, mais les causes de la cécité sont encore obscures. Néanmoins, unes des protéines de Usher, la myosine VIIa, a été impliquée dans le transport intracellulaire dans les photorécepteurs. Pour mieux comprendre le rôle dans la rétine, j’ai étudié l’un de ses partenaires, la spectrine βV. Nous avons conclu que cette spectrine, en collaboration avec les protéines USH1, est impliquée dans le trafic cellulaire: elle couple les moteurs (myosine VIIA, kinesine II et le complexe dynéine/dynactine) à leurs cargos en route vers le segment externe des photorécepteurs. La combinaison d’études comparatives dans les cellules ciliées (CC) de l'oreille interne de grenouille et de souris, de tests biochimiques et d’analyses phylogénétiques indique que le transport vers et depuis la surface apicale des cellules est la fonction ancestrale de cette spectrine. Chez les mammifères, une pression évolutive a engendré le recrutement de la spectrine βV à la paroi latérale des CC externes auditives, probablement pour participer à une nouvelle fonction: l’électromotilité. Enfin, j’ai étudié l’origine de la surdité dans le syndrome d’Usher III. Le seul gène causal connu est CLRN1, qui code pour la clarine-1. Nous avons conclu que la clarine-1 est nécessaire à la maturation et le maintien des touffes ciliaires des CC. De plus, la clarine-1 est essentielle pour le regroupement des canaux calciques voltage-dépendants au voisinage immédiat de la machinerie exocytotique de la synapse à ruban des CC internes. / Usher syndrome (USH) causes a combined deafness-blindness in humans. At least nine causative genes are known. While the analysis of USH knockout mice has shed light on the origin of the auditory deficit, the causes of vision loss are still unclear. Nevertheless, USH1B protein, myosin VIIa, appears to contribute to intracellular traffic in photoreceptor cells. To better understand the role of this myosin in the retina, I studied the functions of its interacting partner, spectrin βV. We found that spectrin V, along with USH1 proteins, participates in intracellular transport by coupling motor proteins (myosin VIIa, kinesin II, dynein/dynactin complex) to the cargoes en route towards the outer segment of photoreceptor cells. Evidence from comparative studies in frog and mouse inner ear, biochemical assays and phylogenetic analyses point to cargo trafficking to and from the apical cell region, as the likely ancestral function of this spectrin. Our analyses also suggest that evolutionary pressures in the mammalian lineage drove the recruitment of spectrin βV to the lateral wall of auditory outer hair cells, probably to support a new function: electromotility. Finally, I explored the origin of hearing loss in Usher syndrome of type III (USH3). So far, the only causal gene known is CLRN1, which codes for clarin-1. The comparative characterization of two Clrn1 mouse mutants revealed that clarin-1 is required for the maturation and maintenance of the hair bundle in the hair cells. Moreover, our results indicate that clarin-1 is also essential to cluster the voltage-gated Ca2+ channels in close proximity to the exocytotic machinery of the ribbon synapse of inner hair cells.

L'élongation embryonnaire de C. elegans a lieu en deux étapes. La première phase est permise par les contractions d’actomyosine et régulée par les kinases let-502 et pak-1. La seconde dépend des contractions musculaires (après le stade 1,7-fold). La tension fournie par ces contractions permet le recrutement de GIT-1 aux hémidesmosomes, facilitant la poursuite de l’élongation via l’activation de PAK-1 (Nature, 2011). Étonnamment, en l'absence de git-1 ou pak-1, l'élongation se poursuit, nous conduisant à émettre l'hypothèse de voies de régulation parallèles. Un crible ARNi a été réalisé pour rechercher les candidats impliqués. La majorité des candidats interagissant fortement avec git-1 appartenait au complexe dynéine-dynactine. En utilisant des allèles sensibles à la température et des protéines affectant les microtubules, nous avons décrit un rôle de la dynactine indépendant des microtubules dans l'épiderme ainsi que son interaction avec la spectraplakine vab-10 et la spectrine spc-1. / C. elegans embryonic elongation is driven by 2 forces: Actomyosin contractility and Muscle contraction (after 1.7-fold). Actomyosin contraction is regulated by the Rho kinase and the serine/threonine p21 activated kinase pak-1. Tension provided by muscle contraction recruits GIT-1 to hemidesmosomes (HD), which in turn facilitates further elongation by activating proteins such as PAK-1 (Nature 2011). Surprisingly in absence of git-1/pak-1, elongation still continues, which led us to hypothesize parallel pathways. An RNAi screen was performed to get the candidates in the parallel pathway/s. Candidates interacting strongly with git-1 belonged to the Dynein Dynactin complex. By use of temperature sensitive alleles and microtubule severing proteins, we found a microtubule independent role of Dynactin in epidermis and that dynactin functionally interacts with spectraplakin vab-10 and spectrin spc-1, which allows us to portray the role of Dynein Dynactin complex during embryonic elongation.

Le globule rouge a une grande faculté à se déformer, notamment lorsqu?il traverse des capillaires dont le diamètre peut être inférieur au sien. Cette résistance au cisaillement est attribuée à sa membrane particulière. Celle-ci est constituée d?une bicouche lipidique sur laquelle est fixé un réseau bidimensionnelle de protéines : le squelette. Ce squelette est principalement constitué de longs filaments de spectrine (~200 nm) reliés entre eux et à la bicouche lipidique par des complexes de jonction. Dans la première partie de ce travail, nous avons mesuré le module de cisaillement µ de la membrane (bicouche lipidique + squelette) à l?aide de deux pinces optiques. Deux billes de silice attachées à la membrane sont utilisées pour lui appliquer des forces connues. Le module de cisaillement est déduit de la déformation mesurée en fonction de la contrainte appliquée. Nous avons trouvé µ = 2.5 +/- 0.4 µN/m, valeur du même ordre de grandeur, mais inférieure, à celles obtenues par d?autres techniques. Dans une seconde partie, nous mesurons les modules d?extension KC et de cisaillement µC du squelette seul. Un globule rouge avec trois billes un piégé, et une solution de détergent est injectée afin de dissoudre la bicouche lipidique. Le squelette reste attaché aux billes et il est ensuite déformé en déplaçant les billes les unes par rapport aux autres. Les modules élastiques sont déduits de la mesure des contraintes et des déformations. Nous trouvons KC = 4.8 +/- 2.7 µN/m et µC = 2.4 +/- 0.7 µN/m dans une solution d?osmolarité égale à 25 mOsm/kg. De ces mesures, nous pouvons déduire la longueur de persistance de la spectrine, ici 5 nm. Ces valeurs sont en bon accord avec des prédictions théoriques et numériques réalisées sur des réseaux bidimensionnels de ressorts. L?influence de la force ionique et du vieillissement du squelette après l?extraction sont étudiés dans la dernière partie.

La caractérisation de l'interaction de différentes biomolécules avec les lipides constitue une étape cruciale pour la compréhension du comportement et du mode d'action de ces molécules avec les membranes cellulaires. Nous présentons ici des études biomimétiques d'une protéine musculaire. Des modèles membranaires et des méthodes biophysiques ont été utilisées. La dystrophine est une protéine filamenteuse essentielle pour le fonctionnement musculaire. Son absence ou sa modification suite à des mutations ont responsables de myopathies. Dans cette étude, nous avons analysé les propriétés de certaines répétitions homologues à la spectrine du domaine central de la dystrophine. Nous caractérisons les interactions spécifiques de deux sous domaines constitués des répétitions 1 à 3 et 20 à 24 avec les lipides. Nous montrons d'autre part, que l'interaction et l'organisation des répétitions 11 à 15 avec des membranes anioniques et zwitterioniques sont modulées par la courbure membranaire et le packing lipidique. L'analyse de propriétés rhéologiques de surface montre que les répétitions 11 à 15 forment un lien fonctionnel entre la membrane et les filaments d'actine du cytosquelette. Cette liaison mécanique contribuerait in vivo au rôle d'amortisseur de chocs attribué à la dystrophine lors des cycles de contractions-relaxations musculaires. Dans une dernière partie de ce travail, nous avons étudié la relation structure-activité d'un "de novo" peptide antimicrobien, K4. Nous identifions un mécanisme d'action de type detergent-like, conférant l'activité antimicrobienne.

Mon travail se concentre sur la morphogenèse épithéliale pendant l’élongation embryonnaire de C. elegans. Ce processus s’appuie sur la transmission de signaux mécaniques, jouent un rôle essentiel également au cours de l’homéostasie tissulaire. Le gène pak-1 joue un rôle essentiel au cours des tels processus à la fois chez l’homme et dans l’élongation chez C. elegans. Nous avons montré que α-spectrine (SPC-1) est un nouveau partenaire de la kinase PAK-1. Pendant mon doctorat, j’ai confirmé que la perte simultanée de PAK-1 et de SPC-1 induit des défauts sévères d’élongation, impliquant une rétractation et un collapse général de l’embryon et suggèrent la présence de défauts biomécaniques. Mon travail était destiné à déterminer comment la perte de PAK-1 et SPC-1 influence le comportement mécanique des cellules épidermales. Cette étude permettra de mieux d’établir le rôle de SPC-1 et de PAK-1 dans la morphogenèse épithéliale et de mieux comprendre la régulation des propriétés mécaniques des cellules dans un contexte vivant. / I study epithelial morphogenesis during C. elegans embryonic elongation. This process depends on mechanical cues that also influence tissue homeostasis. The pak-1 gene plays an essential role equally during such processes in human and during C. elegans elongation. Our work identified α-spectrin (SPC-1) as a new interactor of the kinase PAK-1. During my PhD I confirmed that the simultaneous lack of PAK-1 and SPC-1 induces serious elongation defects, including a retraction and general collapse of the embryo and suggests that the mechanical properties of the epidermis are modified. My work aimed to determine how the simultaneous lack of PAK-1 and SPC-1 could influence these processes. Such studies would allow to better establish the role of SPC-1 and PAK-1 during epithelial morphogenesis and to better understand the regulation of cellular mechanical properties in the living organisms.