Dans le thyrocyte normal, la TSH active une voie dépendante de l’adénylyl cyclase/AMPc, qui représente l’une des trois voies mitogéniques de la thyroïde. La cascade de signalisation de la TSH diffère des deux autres voies dans sa capacité à induire à la fois la prolifération et la différenciation, comprenant la synthèse et la sécrétion des hormones thyroïdiennes. Identifier les acteurs de cette cascade de signalisation, ainsi que les interactions entre effecteurs, est donc très important pour la compréhension de la fonction de la cellule thyroïdienne. C’est dans ce cadre que s’insère notre travail au cours duquel nous nous sommes intéressés au récepteur de la TSH ainsi qu’à une protéine récemment identifiée dans le laboratoire et dont l’expression est modulée en réponse à la TSH dans la thyroïde : C3VS. C3VS est une protéine qui présente six motifs ankyrine et une tirette à leucine et dont la fonction était inconnue à l'époque. Dans un premier temps, nous avons contribué à l’obtention de la séquence codante complète du C3VS de chien, puis, l'identification des partenaires d'une protéine pouvant aider à caractériser sa fonction, nous nous sommes proposé de rechercher les partenaires potentiels de la région N-terminale de C3VS par la méthode double-hybride. Nous avons étudié la distribution tissulaire et la régulation par la TSH de différents partenaires isolés. Parmi eux, SUG1, une ATPase du protéasome 26S, a été étudiée plus avant mais l’interaction n’a pas pu être confirmée par "GST-pulldown assay". Simultanément, une remise en question de la position de la méthionine initiale de C3VS, couplée à une impossibilité d’exprimer la protéine en cellules COS par transfection mettait en péril le travail. En l’absence de plus d’arguments fonctionnels permettant d’orienter l’étude des positifs, cette partie du travail a été suspendue au profit de notre étude sur le récepteur de la TSH. L'activation de cascades différentes dans le thyrocyte humain et canin pouvant être due à l'action de protéines intracellulaires, nous avons tenté de rechercher par double-hybride des partenaires protéiques autres que les protéines G pour le récepteur de la TSH. Nous avons ainsi identifié PRA1 mais nous n’avons pas pu confirmer l'interaction entre les deux protéines par "GST-pulldown assay". Pour tenter de comprendre le rôle de cette interaction, nous avons réalisé des essais fonctionnels en transfectant des cellules pour évaluer l'implication de PRA1 sur la synthèse d’AMPc. Ces expériences ne nous ont pas permis de montrer un rôle pour PRA1 au niveau de la cascade, mais en revanche, nous avons mis en évidence le fait que la co-transfection de deux ADNc codant pour des protéines membranaires sature la machinerie de traduction et diminue l'expression du RTSH. Dans une deuxième partie de notre travail, nous avons étudié la 5-phosphatase SHIP2, dont l’implication dans la cascade de réponse à l’insuline était suggérée, entre autres, par le travail d’Isabelle Vandenbroere qui avait montré l’interaction de cette protéine avec CAP et c-Cbl. Nous avons développé au laboratoire la culture de la lignée pré-adipocytaire 3T3-L1 et étudié la localisation de SHIP2 au niveau des rafts de ces cellules. Nous avons montré que SHIP2 n’y est pas recrutée. CAP et c-Cbl ne semblent pas non plus y être recrutées, tandis que nous y avons détecté le récepteur de l'insuline. La localisation de différentes protéines impliquées dans la cascade de l'insuline dans les rafts est une question controversée à l’heure actuelle et notre étude montre que l’implication fonctionnelle de SHIP2 dans la cascade de l'insuline n'est probablement pas dépendante des rafts.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le cancer de l’ovaire est le plus mortel des cancers gynécologiques. CA125 est le marqueur de progression utilisé pour effectuer le suivi des patientes atteintes de ce dernier. La protéine CA125 est surexprimée au niveau des tissus ovariens tumoraux, mais elle est non détectable avec les moyens d'aujourd'hui au niveau des tissus ovariens normaux. CA125 est une protéine dont les fonctions demeurent inconnues sinon hypothétiques. Dans notre laboratoire, la recherche est axée sur la détermination des fonctions de l’antigène tumoral CA125. Pour cela un projet de maîtrise précédent au miens a permis la mise au point d’un outil nommé anticorps monovalent modifié (ScFv) dans une lignée de cellules tumorales de l’ovaire. Cet outil permet la liaison de la protéine cible, dans notre cas CA125, et empêche sa localisation physiologique à la membrane, éliminant ainsi sa fonction dans la cellule ciblée. Grâce à cet outil, quelques rôles potentiels ont pu être proposés. CA125 aurait des implications dans la prolifération, l’adhésion cellule-cellule, la résistance à l’apoptose et la migration des cellules tumorales de l’ovaire. Pour étudier cette protéine d’un point de vue moléculaire, mon projet principal consistait à effectuer un criblage double-hybride nucléaire chez la levure pour découvrir des interactions protéiques à une échelle cellulaire. En parallèle, l’utilisation de la méthode d’immunoprécipitation avec des cellules tumorales de l’ovaire en tant que projet secondaire avait pour but de vérifier des voies de signalisation spécifiques. Grâce aux résultats précédents obtenus par des expériences antérieures dans le laboratoire ainsi qu'à ceux obtenus pour d’autres mucines, certaines voies de signalisation démontraient un potentiel intéressant pour l’implication de la protéine CA125. Par des expériences d'immunoprécipitation, nous avons découvert que des complexes protéiques contenant la protéine E-cadhérine et la protéine β-caténine contiennent aussi CA125. Ces protéines sont impliquées dans la prolifération et l’adhésion cellulaire. Certaines fonctions hypothétiques de CA125 sont reliées à ces processus cellulaires, c’est-à-dire l’adhésion cellule-cellule et la prolifération cellulaire. Ces interactions protéiques permettront de mieux comprendre l’implication de CA125 dans ces processus cellulaires. Mon projet principal était la mise au point d’un double-hybride nucléaire chez la levure. Pour y parvenir, nous avons dû modifier les protocoles proposés normalement pour ce type de double-hybride. Nous avions choisi d’effectuer notre criblage avec le domaine cytoplasmique de CA125. Par contre, étant donné que ce domaine est très court seulement 31 a.a., le domaine transmembranaire de CA125 a été ajouté au premier domaine mentionné pour favoriser une conformation protéique adéquate. Le domaine cytoplasmique de CA125 a été choisi pour tenter de mieux comprendre d’un point de vue moléculaire les voies de signalisation dans lesquelles cet antigène tumoral est impliqué. Lors du premier essai pilote de double-hybride effectué, nous avons repêché une protéine qui interagit probablement de manière non spécifique avec CA125 selon des statistiques recueillies lors de criblages pour d’autres protéines transmembranaires. Pour remédier à ce problème majeur, nous avons recherché la source de ce problème. Nous avons alors réalisé que les levures utilisées n’étaient pas les Saccharomyces cerevisiae PJ69-4A que nous avions choisies pour effectuer notre double-hybride. Par la suite, les levures ont été maintenues sur des milieux sélectifs pour les PJ69-4A, c’est-à-dire en absence de lysine (Lys -). Pour parvenir à obtenir des colonies positives lors de la transformation de l’ADN de la librairie avec notre construction, il nous a fallu amplifier les transformants en milieu liquide toute la nuit en sélectionnant pour les vecteurs et la levure. Une fois les transformants amplifiés, nous avons obtenu des candidats potentiels qui ont franchi les différentes étapes de sélection du double-hybride. D’autres techniques ont dû être adaptées à nos besoins pour parvenir à mettre au point notre double-hybride nucléaire chez la levure pour notre protéine transmembranaire. Grâce à ces efforts, certains candidats ont été séquencés et la première protéine découverte par ce criblage est RNF5 (ring finger protein 5). Cette dernière est impliquée dans la régulation de la motilité cellulaire. CA125 semble être aussi impliqué dans ce processus. Il est alors possible de relier CA125 à RNF5. Ce premier résultat nous suggère que nous avons réussi à mettre au point un double-hybride nucléaire chez la levure pour l’antigène tumoral CA125.

Les spectrines, protéines liant l'actine, sont des constituants majeurs du squelette membranaire, réseau multiprotéique localisé sous la membrane plasmique. Érythroïdes ou non érythroïdes (dans ce cas, on les appelle fodrines), les spectrines ont un rôle structural important dans la membrane comme cela a déjà été démontré, pour la spectrine, dans le globule rouge. Elles sont constituées de deux longues chaînes a et ß associées côte à côte en tétramères (aß)2 qui forment les longs filaments du réseau. Chacune des chaînes est composée par la répétition de segments homologues, 22 pour a et 17 pour ß. Ces segments sont constitués de trois hélices a (hélices A, B et C) repliées sur elles-mêmes. Cette succession de structures trihélicoïdales est parfois interrompue par un domaine particulier comme le domaine SH3 (Src Homology 3) présent au milieu de la chaîne a. Les tétramères (aß)2 de spectrine constituent les filaments du squelette membranaire. L'interaction tête-à-tête de deux dimères aß implique les extrémités NH2 de la chaîne a et COOH de la chaîne ß. D'une part la sévérité du défaut d'auto-association et la localisation des mutations associées à celui-ci et d'autre part, les séquences en acides aminés des extrémités impliquées dans le site d'auto-association ont permis de proposer un modèle : la première hélice C isolée de la chaîne a pourrait s'associer aux deux dernières hélices A et B de la chaîne ß pour reconstituer une unité conformationnelle trihélicoïdale semblable à celles observées le long de la molécule. Un défaut dans la formation du tétramère est le support moléculaire le plus fréquemment observé dans les elliptocytoses héréditaires (HE). À l'aide de peptides recombinants, nous avons défini, sur les deux chaînes, les régions nécessaires et suffisantes possédant les caractéristiques pleinement fonctionnelles du site de tétramérisation. Nous avons ensuite, par mutagenèse dirigée, reproduit le lien entre la présence de mutations HE localisées dans les hélices A ou B et le défaut d'auto-association observé dans les globules rouges de patients HE. La présence d'un domaine SH3 localisé au milieu de la chaîne a confère probablement aux spectrine des fonctions autres que le maintien et la stabilité de la membrane. Les SH3, petits domaines protéiques, participent aux interactions protéine/protéine. Le seul partenaire connu du domaine SH3 de la fodrine était la sous-unité a du canal sodium sensible à l'amiloride (ENaC) mais la fonction de ce complexe n'était pas encore caractérisée. À l'aide de différentes méthodes, nous avons remis en cause l'interaction directe entre ENaC et le SH3 de la fodrine. La fonction de ce domaine SH3 étant liée à la nature de son ligand, nous avons donc recherché les partenaires putatifs du domaine SH3 de la fodrine par la technique du double-hybride. 29 partenaires ont été identifiés, regroupés en 19 familles et 10 clones isolés. La spécificité des interactions a été étudiée à la fois par double-hybride, à l'aide de mutants du domaine SH3 de la fodrine produits par mutagenèse dirigée. Les interactions vis-à-vis d'autres domaines SH3 (spectrine ou une protéine de levure non relatée Scd2) ont été également analysées. Enfin, la spécificité de certains partenaires a été confirmée par des études d'interactions in vitro. Deux des protéines les plus spécifiques du domaine SH3 de la fodrine sont des protéines tyrosine-phosphatase PTP. La première est l'isoforme A de PTP de faible poids moléculaire (LMPTPA) mais l'interaction n'a pas été confirmée in vitro. La deuxième, TD14, est une nouvelle PTP dont la seule fonction connue est d'inhiber la formation des foyers tumoraux des cellules surexprimant l'oncogène Ha-ras. Ces PTP pourraient soit déphosphoryler la fodrine, soit être recrutées sous la membrane pour déphosphoryler une autre cible. Nous avons également identifié trois partenaires (N-WASP, Evl et une protéine de la famille des formines) suggérant que les domaines SH3 des spectrines pourraient être impliqués dans les processus de polymérisation de l'actine liés à la mobilité ou la différenciation cellulaire. Mot clés : spectrine, fodrine, tétramérisation, SH3, double-hybride, polymérisation de l'actine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La vigne est soumise à de nombreuses maladies impliquant l'utilisation de produits phytosanitaires en grande quantité dont l'utilisation est néfaste pour l'environnement et la santé des utilisateurs. Un enjeu est donc de développer des méthodes alternatives à la lutte chimique. La protéine codée par le gène NPR1 (Nonexpressor of pathogenesis-related gene 1) joue un rôle clef dans la résistance à large spectre chez les plantes. Des éliciteurs tels que l'acide salicylique ou des agents pathogènes influencent l'activation de NPR1 dans le cytoplasme. La translocation de NPRl dans le noyau et son interaction avec des facteurs de transcription TGA induit l'expression des gênes PR (Pathogenesis-related). Nous avons identifié sept homologues potentiels des gènes NPR1 et TGA chez Vitis vinifera (VvNPR1.1, VvNPR1.2, VvTGA1 à 5). L'étude de la diversité de séquences dans les exons de 15 accessions de Vitaceae indique qu'ils sont soumis à une forte pression de sélection purificatrice. De plus, l'analyse in silico des régions promotrices des VvNPR1 montre la présence, d'éléments cis-régulateurs potentiels, en réponse aux stress biotiques et abiotiques ainsi que des motifs de liaison à des facteurs de transcription. Une étude plus poussée des introns montre quelques éléments transposables et un faible polymorphisme dans six accessions de Vitis vinifera. Ces résultats argumentent en faveur d'une pression de sélection forte agissant sur ces gènes. Ceci nous a mené à formuler des hypothèses fonctionnelles et à réaliser une étude d'interaction avec les facteurs de transcription VvTGA1 et VvTGA4 par la technique du double hybride. Ces derniers n'interagissent pas avec VvNPR 1.1. / Numerous diseases affect grapevine, resulting in the use of phytochemicals in large quantities that are harmful for environment and user's health. In the long term, the aim is to develop alternative methods to chemicals. The protein encoded by NPR1 (Nonexpressor of pathogenesis-related gene 1) plays a pivotal role in conferring broad spectrum pathogen resistance in plants. Activation of NPR 1 in the cytoplasm is influenced by elicitors such as salicylic acid or pathogens associated with the accumulation of reactive oxygen species. Translocation of NPR1 into the nucleus and interaction with TGA transcription factors induce the expression of PR (Pathogenesis-related) genes. Using a candidate gene approach, we have identified seven putative homologs to NPR1 and TGA in the grapevine genome (VvNPR1.1, VvNPR1.2, VvTGA1 to 5). The study of sequence diversity in exons of 15 accessions of the Vitaceae family indicates that these exons are subjected to a strong purifying selection pressure. Moreover, in silico analysis in the promoters of VvNPR1 shows putative cis-regulator elements, in answer to biotic and abiotic stresses as well as link patterns to transcription factors. An intron study shows transposable elements and a low polymorphism in six accessions of Vitis vinifera. These results suggest a strong selection pressure on these genes. Functional hypotheses were formulated, and an interaction study with transcription factors VvTGA1 and VvTGA4 was conducted using a method based on yeast two hybrid, showing that they do not interact with VvNPR1.1.

La neurofibromatose de type 1 est une maladie génétique fréquente puisqu'elle touche 1 individu sur 3500. Le gène responsable de la maladie a été identifié et code pour une protéine, la neurofibromine (Nf1), exprimée de manière ubiquitaire mais plus abondamment dans les neurones, les astrocytes, les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. Il est un enjeu de taille de comprendre la régulation de cette protéine. Une étude modèle a été développée chez la levure afin de caractériser les bases moléculaires de l'interaction entre l'homologue de Nf1, Ira2p, et une protéine qui l'inhibe, Tfs1p. Cette étude a permis d'identifier les régions de Tfs1p importantes pour l'interaction à savoir l'extrémité N-terminale, la cavité de surface, ainsi qu'une région électropositive contenant ces deux déterminants. Nous nous sommes intéressés ensuite au rôle physiologique de Tfs1p dans les cellules. Des études systématiques ont suggéré un rôle prédominant de l'inhibition d'Ira2p dans des conditions de surproduction de Tfs1p. Ce rôle a été précisé et nous avons montré que Tfs1p participait, via cette inhibition, à la boucle de rétrocontrôle négatif de la réponse au stress. Sur la base de cette étude, nous avons cherché à savoir si l'interaction Ira2p/Tfs1p était conservée chez l'homme entre Nf1 et RKIP, homologue de Tfs1p. Nous avons en parallèle développé un crible double hybride sur Nf1 dans une banque d'ADNc de cerveau humain afin de mettre en évidence de nouveaux régulateurs de ses fonctions. 1464 candidats positifs ont été isolés. Actuellement, sur 8% de candidats identifiés 3 partenaires intéressants ont déjà pu être mis en évidence.