Dans le thyrocyte normal, la TSH active une voie dépendante de l’adénylyl cyclase/AMPc, qui représente l’une des trois voies mitogéniques de la thyroïde. La cascade de signalisation de la TSH diffère des deux autres voies dans sa capacité à induire à la fois la prolifération et la différenciation, comprenant la synthèse et la sécrétion des hormones thyroïdiennes. Identifier les acteurs de cette cascade de signalisation, ainsi que les interactions entre effecteurs, est donc très important pour la compréhension de la fonction de la cellule thyroïdienne. C’est dans ce cadre que s’insère notre travail au cours duquel nous nous sommes intéressés au récepteur de la TSH ainsi qu’à une protéine récemment identifiée dans le laboratoire et dont l’expression est modulée en réponse à la TSH dans la thyroïde : C3VS. C3VS est une protéine qui présente six motifs ankyrine et une tirette à leucine et dont la fonction était inconnue à l'époque. Dans un premier temps, nous avons contribué à l’obtention de la séquence codante complète du C3VS de chien, puis, l'identification des partenaires d'une protéine pouvant aider à caractériser sa fonction, nous nous sommes proposé de rechercher les partenaires potentiels de la région N-terminale de C3VS par la méthode double-hybride. Nous avons étudié la distribution tissulaire et la régulation par la TSH de différents partenaires isolés. Parmi eux, SUG1, une ATPase du protéasome 26S, a été étudiée plus avant mais l’interaction n’a pas pu être confirmée par "GST-pulldown assay". Simultanément, une remise en question de la position de la méthionine initiale de C3VS, couplée à une impossibilité d’exprimer la protéine en cellules COS par transfection mettait en péril le travail. En l’absence de plus d’arguments fonctionnels permettant d’orienter l’étude des positifs, cette partie du travail a été suspendue au profit de notre étude sur le récepteur de la TSH. L'activation de cascades différentes dans le thyrocyte humain et canin pouvant être due à l'action de protéines intracellulaires, nous avons tenté de rechercher par double-hybride des partenaires protéiques autres que les protéines G pour le récepteur de la TSH. Nous avons ainsi identifié PRA1 mais nous n’avons pas pu confirmer l'interaction entre les deux protéines par "GST-pulldown assay". Pour tenter de comprendre le rôle de cette interaction, nous avons réalisé des essais fonctionnels en transfectant des cellules pour évaluer l'implication de PRA1 sur la synthèse d’AMPc. Ces expériences ne nous ont pas permis de montrer un rôle pour PRA1 au niveau de la cascade, mais en revanche, nous avons mis en évidence le fait que la co-transfection de deux ADNc codant pour des protéines membranaires sature la machinerie de traduction et diminue l'expression du RTSH. Dans une deuxième partie de notre travail, nous avons étudié la 5-phosphatase SHIP2, dont l’implication dans la cascade de réponse à l’insuline était suggérée, entre autres, par le travail d’Isabelle Vandenbroere qui avait montré l’interaction de cette protéine avec CAP et c-Cbl. Nous avons développé au laboratoire la culture de la lignée pré-adipocytaire 3T3-L1 et étudié la localisation de SHIP2 au niveau des rafts de ces cellules. Nous avons montré que SHIP2 n’y est pas recrutée. CAP et c-Cbl ne semblent pas non plus y être recrutées, tandis que nous y avons détecté le récepteur de l'insuline. La localisation de différentes protéines impliquées dans la cascade de l'insuline dans les rafts est une question controversée à l’heure actuelle et notre étude montre que l’implication fonctionnelle de SHIP2 dans la cascade de l'insuline n'est probablement pas dépendante des rafts.

Dechamps Christophe (2008). Etude fonctionnelle dun oncogène humain impliqué dans le Sarcome dEwing, oncTre210, homologue à deux gènes levuriens, MSB3 et MSB4 (thèse de doctorat). Gembloux, Faculté Universitaire des Sciences Agronomiques, 173 p., 12 tabl., 40 fig. Résumé : Le produit de l'oncogène humain oncTre210 est apparenté, par sa structure primaire, aux protéines Ypt/Rab GAP (GTPase Activating Proteins spécifiques des Ypt/Rab GTPases). En effet, sa région N-terminale, qui est fortement homologue aux deux GAP de Saccharomyces cerevisiae Msb3p et Msb4p, renferme le domaine catalytique TBC, hautement conservé, des Ypt/Rab GAP. Les protéines Msb3p et Msb4p de Saccharomyces cerevisiae font partie de la famille des GTPase activating protein (GAP) spécifique aux Ypt/Rab GTPase. Elles sont primordiales au trafic vésiculaire et sont impliquées dans la régulation de l'exocytose et dans l'organisation du cytosquelette d'actine. Mais, leurs rôles biologiques exacts nont jamais été déterminés. La délétion simultanée des 2 gènes MSB3 et MSB4 dans la levure S. cerevisiae induit une inhibition de croissance de la levure sur un milieu de culture contenant du DMSO et/ou de la caféine, perturbe lorganisation du cytosquelette dactine, produit une anomalie de bourgeonnement dans la levure diploïde et affecte la ségrégation des noyaux. Pour trouver des composants qui interagissent génétiquement avec les produits des gènes MSB3 et MSB4, nous avons criblé une banque génomique pour des suppresseurs homologues extragéniques multicopies restaurant la croissance du double mutant levurien msb3 msb4 en présence de DMSO et/ou de caféine. Sept gènes ont ainsi été identifiés après une série de vérifications. Ces 7 suppresseurs peuvent être classés pour la fonction biologique de leurs produits en plusieurs classes : transport vésiculaire, cycle cellulaire, chaperon moléculaire, protéasome et ARN ribosomial. Ces résultats nous permettent d'identifier les voies physiologiques où les deux protéines Msb3p et Msb4p seraient impliquées. Le produit de l'oncogène oncTre210 est impliqué dans différents cancers humains dont le sarcome d'Ewing. Pour létude des partenaires interagissant avec lune ou lautre des deux parties de la protéine de fusion oncTre210p, nous avons utilisé le système double-hybride en levure en utilisant différentes banques d'expression. Un grand nombre de partenaires protéiques a été isolé comme interagissant avec l'oncoprotéine. Deux protéines impliquées dans l'organisation et la structure du cytosquelette ont été choisies parmi les partenaires de l'oncoprotéine pour être étudiées. L'interaction de ces deux protéines avec la partie GAP de oncTre210p a été confirmée par les techniques de GST pulldown, de co-immunoprécipitation et de co-localisation. Ces protéines identifiées comme interagissant avec la partie GAP sont la chaîne légère régulatrice de la myosine II (Myl2) et LOC91256, protéine contenant des motifs ankyrine. A partir de ces observations un nouveau rôle de l'oncoprotéine oncTre210p a été suggéré. L'ensemble de nos résultats ainsi que des données expérimentales acquises par d'autres équipes internationales nous a permis de proposer un modèle d'action pour l'oncoprotéine oncTre210p. Dechamps Christophe (2008). Functional study of an oncogene implicated in Ewing's sarcoma, oncTre210, a human homologue of two yeast genes, MSB3 and MSB4 (Thesis in French). Gembloux, Belgium, Gembloux Agricultural University, 173 p., 12 tabl., 40 fig. Summary : The oncTre210 oncogene product is structurally related to the Ypt/Rab GTPase-Activating Proteins (Ypt/Rab GAPs). Particularly, the N-terminal region of the oncoprotein shares with the yeast proteins Msb3p and Msb4p the highly conserved TBC domain, forming the catalytically active domain of Ypt/Rab GAPs. The Msb3p and Msb4p proteins of Saccharomyces cerevisiae are members of the Ypt/Rab-specific GTPase activating protein (GAP) family. They are important to vesicular trafficking and involved in the regulation of exocytosis and in the organization of the actin cytoskeleton, but their exact biological roles have yet to be determined. The msb3 msb4 yeast double mutation causes growth inhibition in the presence of DMSO and/or caffeine, affects the organization of the actin cytoskeleton, produces a random budding pattern in diploid cells, and affects segregation of the nucleus. To find cell components that interact genetically with the products of the MSB3 and MSB4 genes, we screened a genomic library for multicopy suppressor genes restoring normal growth of the double mutant in the presence of DMSO and caffeine. Six genes were identified, and the extent to which each gene corrects specific growth defects of the msb3 msb4 mutant is described. The encoded suppressors were classified on the basis of functional features into five groups: vesicular transport, cell division, molecular chaperon, proteasome and ribosomal RNA. These results allow us to identify the physiologic ways where the Msb3p and Msb4p proteins are implicated. The product of the oncTre210 oncogene is involved in various human cancers, including Ewings sarcoma. In order to identify proteins interacting with the two parts of this protein, we performed yeast two-hybrid screening of various libraries. A large number of proteins was identified to be partners of the oncogene product. Two components of the cytoskeleton were chosen to be studied, whose interaction with the GAP region was confirmed by GST-pulldown, co-immunoprecipitation, and colocalisation experiments. The proteins found to interact with the GAP region are the light regulatory chain of myosin II (Myl2) and LOC91256, a protein containing ankyrin repeats. From these observations a new role for the oncTre210p oncoprotein in cytokinesis was suggested. Our results and data from other international teams allow us to propose a model for the action of the oncTre210 oncogene product.

Dans le thyrocyte normal, la TSH active une voie dépendante de l’adénylyl cyclase/AMPc, qui représente l’une des trois voies mitogéniques de la thyroïde. La cascade de signalisation de la TSH diffère des deux autres voies dans sa capacité à induire à la fois la prolifération et la différenciation, comprenant la synthèse et la sécrétion des hormones thyroïdiennes. Identifier les acteurs de cette cascade de signalisation, ainsi que les interactions entre effecteurs, est donc très important pour la compréhension de la fonction de la cellule thyroïdienne. C’est dans ce cadre que s’insère notre travail au cours duquel nous nous sommes intéressés au récepteur de la TSH ainsi qu’à une protéine récemment identifiée dans le laboratoire et dont l’expression est modulée en réponse à la TSH dans la thyroïde :C3VS. <p>C3VS est une protéine qui présente six motifs ankyrine et une tirette à leucine et dont la fonction était inconnue à l'époque. Dans un premier temps, nous avons contribué à l’obtention de la séquence codante complète du C3VS de chien, puis, l'identification des partenaires d'une protéine pouvant aider à caractériser sa fonction, nous nous sommes proposé de rechercher les partenaires potentiels de la région N-terminale de C3VS par la méthode double-hybride. Nous avons étudié la distribution tissulaire et la régulation par la TSH de différents partenaires isolés. Parmi eux, SUG1, une ATPase du protéasome 26S, a été étudiée plus avant mais l’interaction n’a pas pu être confirmée par "GST-pulldown assay". Simultanément, une remise en question de la position de la méthionine initiale de C3VS, couplée à une impossibilité d’exprimer la protéine en cellules COS par transfection mettait en péril le travail. En l’absence de plus d’arguments fonctionnels permettant d’orienter l’étude des positifs, cette partie du travail a été suspendue au profit de notre étude sur le récepteur de la TSH. L'activation de cascades différentes dans le thyrocyte humain et canin pouvant être due à l'action de protéines intracellulaires, nous avons tenté de rechercher par double-hybride des partenaires protéiques autres que les protéines G pour le récepteur de la TSH. Nous avons ainsi identifié PRA1 mais nous n’avons pas pu confirmer l'interaction entre les deux protéines par "GST-pulldown assay". Pour tenter de comprendre le rôle de cette interaction, nous avons réalisé des essais fonctionnels en transfectant des cellules pour évaluer l'implication de PRA1 sur la synthèse d’AMPc. Ces expériences ne nous ont pas permis de montrer un rôle pour PRA1 au niveau de la cascade, mais en revanche, nous avons mis en évidence le fait que la co-transfection de deux ADNc codant pour des protéines membranaires sature la machinerie de traduction et diminue l'expression du RTSH. <p>Dans une deuxième partie de notre travail, nous avons étudié la 5-phosphatase SHIP2, dont l’implication dans la cascade de réponse à l’insuline était suggérée, entre autres, par le travail d’Isabelle Vandenbroere qui avait montré l’interaction de cette protéine avec CAP et c-Cbl. Nous avons développé au laboratoire la culture de la lignée pré-adipocytaire 3T3-L1 et étudié la localisation de SHIP2 au niveau des rafts de ces cellules. Nous avons montré que SHIP2 n’y est pas recrutée. CAP et c-Cbl ne semblent pas non plus y être recrutées, tandis que nous y avons détecté le récepteur de l'insuline. La localisation de différentes protéines impliquées dans la cascade de l'insuline dans les rafts est une question controversée à l’heure actuelle et notre étude montre que l’implication fonctionnelle de SHIP2 dans la cascade de l'insuline n'est probablement pas dépendante des rafts.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished