Cette thèse s’intéresse aux phénomènes d’hydratation de composés organiques à l’échelle moléculaire. Des méthodes basées sur une fonction d’onde multi-déterminantale sont capables de rendre compte des phénomènes de hydratation avec une précision approchant la réalité expérimentale. Or, ces méthodes sont limitées par la taille du système. L’utilisation de la DFT semble indispensable à une étude de complexes, même pour un nombre limité de molécules d’eau. Il s’avère que ces méthodes ne prennent pas en compte les interactions de nature dispersive. Des corrections empiriques ont été proposées récemment pour palier à ce problème. Cependant, ces corrections ne s’appliquent qu’à l’énergie et sur la géométrie des complexes hydratées, la fonction d’onde n’étant pas affectée par la correction. D’autres alternatives pour la prise en compte des effets de dispersion reposent sur l’emploi de méthodes hybrides fonction d’onde/DFT. Ceci peut s’effectuer en introduisant une séparation de portée dans le traitement des interactions électroniques. L’un des objectifs de cette thèse consiste à proposer une nouvelle méthode double hybride à séparation de portée permettant une bonne description des phénomènes d’hydratation. L’autre objectif de cette thèse consiste à utiliser des outils topologiques permettant la prédiction de composés organiques hydraté par l’étude du potentiel électrostatique moléculaire et la caractérisation de ces interactions non covalentes par la théorie AIM. / This thesis deals with hydration phenomena of organic compounds at the molecular scale. The Schrodinger equation considered within the Born-Oppenheimer approximation and within a non-relativistic context contains all the physics necessary to describe in particular the micro-solvation of organic compounds. Methods that are based on a multi-determinant wave function are able to account for micro-hydration phenomena with a precision approaching the experimental reality. These methods are limited by the size of the system. The use of DFT seems necessary for a study of complexes, even for a limited number of water molecules. It turns out that these methods do not take into account dispersive interactions. Empirical corrections have recently been proposed to address this problem. However, these corrections apply only to the energy and to the geometry of the hydrated complexes, the wave function not being affected by the correction. Other alternatives for taking into account dispersion effects using double-hybrid methods should thus be considered. This can be done by introducing a range separation on the electronic interactions. There are two main objectives in this thesis. The first one is to propose a new double-hybrid method with range separation allowing a satisfactorily description of the hydration phenomena at the molecular scale. The second objective consists in using topological tools allowing the prediction of hydrated organic compounds using the electrostatic molecular potential and the characterization of these non-covalent interactions by the "Atoms in molecules" theory.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les interactions entre protéines sont un enjeu majeur en recherche. Hautement spécifiques, elles régulent l'organisation cellulaire, ainsi que les réponses aux stimuli extérieurs ; ce sont des cibles idéales des agents thérapeutiques. Diverses techniques d'étude sont disponibles, mais peu d'entre elles permettent d'analyser simultanément plusieurs interactions. L'objectif de ce travail est d'utiliser le double hybride bactérien pour découvrir de nouveaux partenaires de 2 régulateurs de la prolifération tumorale humaine, p21 et STAT3, et en parallèle pour déterminer la fonction de MtSAP1, impliquée dans la germination et la réponse aux stress abiotiques chez Medicago truncatula. L'analyse des partenaires potentiels de l'oncogène STAT3 et de l'inhibiteur p21 suggère l'existence de nouveaux mécanismes moléculaires de la tumorogenèse auxquels participerait STAT3, et permet d'envisager de nouvelles hypothèses quant au rôle de p21. Un nouveau complexe, p21/prohibitine2, est étudié mais sa fonction reste supposée : il pourrait agir comme corégulateur transcriptionnel et/ou réguler la protéolyse de p21. L'étude du gène MtSAP1 et des partenaires d'interactions suggèrent fortement que MtSAP1 serait induit par l'hypoxie : elle jouerait un rôle considérable dans la détoxification et la tolérance de la plante au stress. Ce travail, appuyé par la littérature, met en évidence un lien fonctionnel entre p21, STAT3 et MtSAP1 au cours de l'hypoxie dans les cellules cancéreuses humaines. La confirmation de cette hypothèse permettrait d'approfondir les mécanismes de protection cellulaire face à l'hypoxie, tant au sein des tumeurs humaines que lors de la tolérance de Medicago truncatula.

Chez les eucaryotes, la voie de protéolyse Ub/ protéasome 26S est responsable de la dégradation sélective de la plupart des protéines intracellulaires. Cette dégradation par le protéasome 26S est initiée par une polyubiquitination de la protéine réalisée grâce à l’action d’une cascade enzymatique impliquant 3 types d'enzymes nommées « ubiquitin-activating enzyme » (E1), « ubiquitin-conjugating enzyme » (E2) et « ubiquitin-protein ligase » (E3). Il existe différentes classes d’ubiquitines ligases (E3), parmi lesquelles la plus connue est le complexe SCF (Skp1-Cullin-F-box). La protéine SKP1 fixe à la fois la Culline et la F-box qui va reconnaitre spécifiquement la protéine cible. Contrairement aux protistes, les champignons et certains vertébrés qui possèdent un unique gène SKP1 fonctionnel, de nombreux animaux et espèces de plantes présentent plusieurs SKP1 homologues. Vingt et un et trente deux gènes SKP1 ont été décrits respectivement chez Arabidopsis thaliana et Oryza sativa. En dépit de l’importance du complexe SCF, chez le riz, peu de travaux décrivent les interactions entre les dizaines de protéines « SKP1-like » et les centaines de protéines F-box. Dans un premier temps, nous avons collecté et analysé les séquences de 288 gènes « SKP1-like » appartenant à 17 espèces, dont la mousse Physcomitrella patens, cinq monocotylédones et 11 eudicotylédones. Les analyses structurales et phylogénétiques de ces gènes indiquent qu’ils peuvent être divisés en différentes sous-familles. Nos analyses ont montré qu’OSK1 et OSK20 chez le riz constituent une classe de gènes SKP1 à intron unique conservé. Dans un deuxième temps, nous avons étudié le profil d’expression des gènes « SKP1-like » chez le riz. Notre investigation sur le nombre d’EST a montré que les gènes OSK1 et OSK20 sont les plus largement représentés dans les bases de données EST publiques. La méta-analyse de l’expression des gènes « SKP1-like » chez le riz, indique que les gènes OSK présentent des profils d'expression hétérogènes selon les tissus et les conditions physiologiques. Les résultats des intearctions protéine-protéine en double hybride ont révélé que les protéines OSK présentent différentes capacités d’interactions avec les protéines F-box. Cependant, OSK1 et OSK20 semblent interagir avec la plupart des protéines F-box testées. Les études de localisation subcellulaire ont indiqué que OSK1 et OSK20 sont des protéines nucléaires et cytosoliques. En se basant sur les divers résultats obtenus dans ce travail, nous pouvons suggérer que chez le riz, les gènes OSK1 et OSK20 sont fonctionnellement équivalents aux gènes ASK1 et ASK2 chez Arabidopsis thaliana. Nous pouvons également proposer les équivalents de ces gènes chez les autres espèces végétales dont le génome a été séquencé. / In eukaryotes, the ubiquitin Ub/26S proteasome pathway is responsible for the selective degradation of most intracellular proteins. This cellular process is initiated by protein polyubiquitination mediated by a three-step cascade involving: an ubiquitin-activating enzyme (E1), an ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and an ubiquitin-protein ligase (E3). The E3 ubiquitin ligases contain several classes, among which the best-known are Skp1-Cullin-F-box (SCF) complexes. The SKP1 protein binds both Cullin and F-box which recognizes specifically the target proteins. Whereas protists, fungi and some vertebrates have a single functional SKP1 gene, many animal and plant species possess multiple SKP1 homologues. Twenty one and thirty-two SKP1-related genes have been described respectively in the Arabidopsis and Oryza sativa genome. Despite the importance of the SCF complex, there have been a few reports of systematic surveys of interactions between the dozens of SKP1-like proteins and the hundreds of F-box proteins in rice. In a first step, we retrieved and analyzed 288 SKP1-like genes belonging to 17 species including the moss Physcomitrella patens, five monocots and 11 eudicots. Structural and phylogenetic analysis of rice OSK genes and other plant SKP1-like genes have indicated that the different members of the plant SKP1 can be split into different subfamily. Our analyses indicated that OSK1 and OSK20 belong to a class of SKP1 genes that contain one intron at a conserved position. In a second step, we studied expression profiles of the rice Skp1-like genes. Our EST survey indicated that OSK1 and OSK20 are the most widely represented genes in public EST databases. Meta-analysis of the expression of rice SKP1-like genes indicated that OSK genes exhibit an expression profile that was heterogeneous in terms of tissues, conditions and overall intensity. Yeast two-hybrid results revealed that OSK proteins display a differing ability to interact with F-box proteins. However, OSK1 and OSK20 seemed to interact with most F-box proteins tested. Subcellular localization studies indicated that OSK1 and OSK20 are nuclear and cytosolic proteins. Based on the results obtained in this study, we can suggest that rice OSK1 and OSK20 are likely to have similar functions as do the Arabidopsis ASK1 and ASK2 genes. Similarly, we suggest a list of functional equivalent in the other sequenced plant genomes.

La membrane bactérienne a fait l'objet de nombreuses études de localisation de protéines et de phospholipides. Par fusion d’une protéine fluorescente (GFP) aux gènes d’intérêt, il est alors possible d‘observer la localisation des protéines associées par microscopie. La plupart de ces observations ont été réalisées à l’aide de microscopes dits à épifluorescence. Afin d’obtenir une qualité d’image suffisante, il était nécessaire de surexprimer la protéine observée, insérée à un locus ectopique non naturel. Ce travail de thèse a permis d’utiliser une nouvelle technologie acquise dans notre laboratoire, le microscope à fluorescence par réflexion totale interne (TIRFM), plus puissant que le microscope à épifluorescence utilisé précédemment. Cette technologie a permis une caractérisation plus détaillée de la localisation de protéines d’intérêt, placées sous contrôle de leur promoteur naturel. Il a également été possible de caractériser la dynamique des foci observés. Nous avons concentré notre étude sur 3 protéines: (i) SecA pour l’étude de la translocation des protéines du cytoplasme vers la membrane, (ii) YidC pour l’insertion des protéines dans la membrane, (iii) PgsA pour la synthèse des phospholipids. Les foci se déplacent dynamiquement et s’associent de manière transitoire dans la membrane. L’observation sur la durée de ces foci, et l’analyse de leur intensité moyenne au cours des observations, montre que SecA se déplace sur l’ensemble de la membrane de manière uniforme. L’analyse du déplacement des foci montre une relation quadratique entre la distance moyenne parcourue par les foci en fonction du temps. Ce résultat est en accord avec l’hypothèse d’un mouvement brownien des foci. Les foci sont observés dans les différentes phases de croissance des cellules, et le nombre de foci présents dans une cellule de la longueur de celle-ci. SecA-GFP a été testés dans un certain nombre de contextes génétiques. La localisation a été perturbée lors de la déplétion de pgsA. Cependant, comme PgsA est une protéine essentielle, il ne peut être exclu que ce changement de localisation apparaît des cellules qui sont mortes ou mourantes. Dans une souche mutante ΔclsA, on n’observe aucune différence dans la localisation de SecA en phase exponentielle, mais on aperçoit une relocalisation aux poles en phase stationnaire de croissance. La voie Tat est responsable du transport des protéines devant être exportées dans un état structuré, par exemple dans le cas de l’incorporation d’un co-facteur. À ce jour, la régulation du système Tat est peu connues, de même que les interactions entre les différentes sous-unités du système Tat et d'autres protéines dans le cytoplasme, dans la membrane ou dans la paroi cellulaire. Des fusions de les gènes de la voie Tat ont été co-exprimées deux à deux dans des cellules de levure, et leur capacité à interagir in vivo a été testée par la méthode dite du double hybride chez la levure. Nous avons généré un réseau d’interaction autour des cinq composants de système Tat. Pour déterminer les implications fonctionnelles des composants du réseau, nous avons travaillé en collaboration avec le laboratoire de Jan-Maarten van Dijl. Nous avons utilisé une collection de souches mutantes pour lesquels certains composants individuels du réseau ont été retires. Trois a été observe d’etre nécessaires pour la sécrétion Tat-dépendante. Nous avons étudié la localisation des fusions GFP avec ces proteins. On a observé une localisation double de HemAT selon l’état physiologique de la cellule. En phase exponentielle, les cellules de B. subtilis sont généralement présentes sous forme de chaînes dans lesquelles le septum de division a déjà été formé, mais la séparation cellulaire n'a pas encore eu lieu. Une fusion de la GFP à CsbC apparaît de façon homogène dans la membrane. / In the years since the cloning of GFP, the field of bacterial cell biology has characterized a variety of specific protein localization patterns in the bacterial membrane. The vast majority of early subcellular localization studies made use of inducible GFP fusions, which generally required the presence of high concentrations of inducer, and can therefore be considered to be overexpressed. An outstanding question remains over the organization of natively expressed proteins in the membrane. Here, we have investigated the localization of functional GFP fusions to proteins catalyzing important membrane processes; the secretion motor protein SecA, the membrane insertase YidC1, and the essential phospholipid synthase PgsA using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). This allowed natively expressed proteins to be localized with temporal resolution that can capture their dynamics. We characterized dynamic complexes dispersed throughout the membrane displaying diffusive movement with no preferred trajectories. Further characterization focused upon identifying conditions in which the localization pattern was disturbed. A polar mislocalization was identified in a cardiolipin mutant strain. The yeast two-hybrid (Y2H) approach is a robust approach to detect binary interactions on a proteome-scale. We performed genome-wide Y2H screens as well as targeted Y2H analyses for specific interactions involving components of the Sec and Tat secretion machineries of B. subtilis, revealing an intricate protein-protein interaction network involving 71 proteins. Furthermore, three proteins identified in the Tat network, WprA, CsbC and HemAT, were shown to be important for effective protein secretion via the B. subtilis Tat system, indicating that our yeast two hybrid assays reveal biologically significant interactions involving membrane proteins. The studies provide a novel proteomic view on the interaction network of the secretion systems of B. subtilis.

Dechamps Christophe (2008). Etude fonctionnelle dun oncogène humain impliqué dans le Sarcome dEwing, oncTre210, homologue à deux gènes levuriens, MSB3 et MSB4 (thèse de doctorat). Gembloux, Faculté Universitaire des Sciences Agronomiques, 173 p., 12 tabl., 40 fig. Résumé : Le produit de l'oncogène humain oncTre210 est apparenté, par sa structure primaire, aux protéines Ypt/Rab GAP (GTPase Activating Proteins spécifiques des Ypt/Rab GTPases). En effet, sa région N-terminale, qui est fortement homologue aux deux GAP de Saccharomyces cerevisiae Msb3p et Msb4p, renferme le domaine catalytique TBC, hautement conservé, des Ypt/Rab GAP. Les protéines Msb3p et Msb4p de Saccharomyces cerevisiae font partie de la famille des GTPase activating protein (GAP) spécifique aux Ypt/Rab GTPase. Elles sont primordiales au trafic vésiculaire et sont impliquées dans la régulation de l'exocytose et dans l'organisation du cytosquelette d'actine. Mais, leurs rôles biologiques exacts nont jamais été déterminés. La délétion simultanée des 2 gènes MSB3 et MSB4 dans la levure S. cerevisiae induit une inhibition de croissance de la levure sur un milieu de culture contenant du DMSO et/ou de la caféine, perturbe lorganisation du cytosquelette dactine, produit une anomalie de bourgeonnement dans la levure diploïde et affecte la ségrégation des noyaux. Pour trouver des composants qui interagissent génétiquement avec les produits des gènes MSB3 et MSB4, nous avons criblé une banque génomique pour des suppresseurs homologues extragéniques multicopies restaurant la croissance du double mutant levurien msb3 msb4 en présence de DMSO et/ou de caféine. Sept gènes ont ainsi été identifiés après une série de vérifications. Ces 7 suppresseurs peuvent être classés pour la fonction biologique de leurs produits en plusieurs classes : transport vésiculaire, cycle cellulaire, chaperon moléculaire, protéasome et ARN ribosomial. Ces résultats nous permettent d'identifier les voies physiologiques où les deux protéines Msb3p et Msb4p seraient impliquées. Le produit de l'oncogène oncTre210 est impliqué dans différents cancers humains dont le sarcome d'Ewing. Pour létude des partenaires interagissant avec lune ou lautre des deux parties de la protéine de fusion oncTre210p, nous avons utilisé le système double-hybride en levure en utilisant différentes banques d'expression. Un grand nombre de partenaires protéiques a été isolé comme interagissant avec l'oncoprotéine. Deux protéines impliquées dans l'organisation et la structure du cytosquelette ont été choisies parmi les partenaires de l'oncoprotéine pour être étudiées. L'interaction de ces deux protéines avec la partie GAP de oncTre210p a été confirmée par les techniques de GST pulldown, de co-immunoprécipitation et de co-localisation. Ces protéines identifiées comme interagissant avec la partie GAP sont la chaîne légère régulatrice de la myosine II (Myl2) et LOC91256, protéine contenant des motifs ankyrine. A partir de ces observations un nouveau rôle de l'oncoprotéine oncTre210p a été suggéré. L'ensemble de nos résultats ainsi que des données expérimentales acquises par d'autres équipes internationales nous a permis de proposer un modèle d'action pour l'oncoprotéine oncTre210p. Dechamps Christophe (2008). Functional study of an oncogene implicated in Ewing's sarcoma, oncTre210, a human homologue of two yeast genes, MSB3 and MSB4 (Thesis in French). Gembloux, Belgium, Gembloux Agricultural University, 173 p., 12 tabl., 40 fig. Summary : The oncTre210 oncogene product is structurally related to the Ypt/Rab GTPase-Activating Proteins (Ypt/Rab GAPs). Particularly, the N-terminal region of the oncoprotein shares with the yeast proteins Msb3p and Msb4p the highly conserved TBC domain, forming the catalytically active domain of Ypt/Rab GAPs. The Msb3p and Msb4p proteins of Saccharomyces cerevisiae are members of the Ypt/Rab-specific GTPase activating protein (GAP) family. They are important to vesicular trafficking and involved in the regulation of exocytosis and in the organization of the actin cytoskeleton, but their exact biological roles have yet to be determined. The msb3 msb4 yeast double mutation causes growth inhibition in the presence of DMSO and/or caffeine, affects the organization of the actin cytoskeleton, produces a random budding pattern in diploid cells, and affects segregation of the nucleus. To find cell components that interact genetically with the products of the MSB3 and MSB4 genes, we screened a genomic library for multicopy suppressor genes restoring normal growth of the double mutant in the presence of DMSO and caffeine. Six genes were identified, and the extent to which each gene corrects specific growth defects of the msb3 msb4 mutant is described. The encoded suppressors were classified on the basis of functional features into five groups: vesicular transport, cell division, molecular chaperon, proteasome and ribosomal RNA. These results allow us to identify the physiologic ways where the Msb3p and Msb4p proteins are implicated. The product of the oncTre210 oncogene is involved in various human cancers, including Ewings sarcoma. In order to identify proteins interacting with the two parts of this protein, we performed yeast two-hybrid screening of various libraries. A large number of proteins was identified to be partners of the oncogene product. Two components of the cytoskeleton were chosen to be studied, whose interaction with the GAP region was confirmed by GST-pulldown, co-immunoprecipitation, and colocalisation experiments. The proteins found to interact with the GAP region are the light regulatory chain of myosin II (Myl2) and LOC91256, a protein containing ankyrin repeats. From these observations a new role for the oncTre210p oncoprotein in cytokinesis was suggested. Our results and data from other international teams allow us to propose a model for the action of the oncTre210 oncogene product.

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l'expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l'ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l'intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l'Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d'interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d'insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d'identifier un nouveau domaine indispensable à l'interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d'ASK1 chez Arabidopsis thaliana.

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l’expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l’ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l’intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l’Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d’interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d’insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d’identifier un nouveau domaine indispensable à l’interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d’ASK1 chez Arabidopsis thaliana. / The selective degradation of proteins is an important means of regulating gene expression and plays crucial roles in the control of various cellular processes. The Ubiquitin (Ub)–Proteasome System (UPS) is the principal non-lysosomal proteolytic pathway in eukaryotic cells and is required for the degradation of key regulatory proteins. Ubiquitin is a 76-residue protein that can be attached covalently to target proteins through an enzymatic conjugation cascade involving three enzymes denoted, E1, E2 and E3.The SCF complex is a type of ubiquitin-protein ligase (E3) that acts as the specific factor responsible for substrate recognition and ubiquitination. Some polyubiquitinated proteins are then targeted to the 26S proteasome for degradation. The SCF complex consists of four components including SKP1, Cullin1, Rbx1 and a large gene family of F-box proteins. Twenty one SKP1-related genes have been described in the Arabidopsis genome and some of these genes have been analyzed genetically. By contrast, little is known about the function and structure of SKP1 homologues in wheat. Some of the Triticum SKP1-related protein (TSKs) have been characterized in this study. Five complete sequences of SKP1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 and TSK16), five F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 and ABA-T), one Cullin1 and one Rbx, were successfully cloned and biochemically characterized. Yeast two-hybrid analysis showed that TSK1 and TSK3 are capable of interacting with different F-box proteins. Furthermore, TSK11 contains an additional domain that changed its interaction capabilities. In vitro analysis using a chimeric protein showed that this additional domain could modify the interaction between a SKP-like protein and two F-box proteins. Expression analyses revealed that TSK1 and TSK16 were expressed predominantly in roots. While, TSK3, TSK6 and TSK11 were expressed in several wheat organs. In addition, the TSK11 was up-regulated in the leaves at the flowering stage.

Dans le thyrocyte normal, la TSH active une voie dépendante de l’adénylyl cyclase/AMPc, qui représente l’une des trois voies mitogéniques de la thyroïde. La cascade de signalisation de la TSH diffère des deux autres voies dans sa capacité à induire à la fois la prolifération et la différenciation, comprenant la synthèse et la sécrétion des hormones thyroïdiennes. Identifier les acteurs de cette cascade de signalisation, ainsi que les interactions entre effecteurs, est donc très important pour la compréhension de la fonction de la cellule thyroïdienne. C’est dans ce cadre que s’insère notre travail au cours duquel nous nous sommes intéressés au récepteur de la TSH ainsi qu’à une protéine récemment identifiée dans le laboratoire et dont l’expression est modulée en réponse à la TSH dans la thyroïde :C3VS. <p>C3VS est une protéine qui présente six motifs ankyrine et une tirette à leucine et dont la fonction était inconnue à l'époque. Dans un premier temps, nous avons contribué à l’obtention de la séquence codante complète du C3VS de chien, puis, l'identification des partenaires d'une protéine pouvant aider à caractériser sa fonction, nous nous sommes proposé de rechercher les partenaires potentiels de la région N-terminale de C3VS par la méthode double-hybride. Nous avons étudié la distribution tissulaire et la régulation par la TSH de différents partenaires isolés. Parmi eux, SUG1, une ATPase du protéasome 26S, a été étudiée plus avant mais l’interaction n’a pas pu être confirmée par "GST-pulldown assay". Simultanément, une remise en question de la position de la méthionine initiale de C3VS, couplée à une impossibilité d’exprimer la protéine en cellules COS par transfection mettait en péril le travail. En l’absence de plus d’arguments fonctionnels permettant d’orienter l’étude des positifs, cette partie du travail a été suspendue au profit de notre étude sur le récepteur de la TSH. L'activation de cascades différentes dans le thyrocyte humain et canin pouvant être due à l'action de protéines intracellulaires, nous avons tenté de rechercher par double-hybride des partenaires protéiques autres que les protéines G pour le récepteur de la TSH. Nous avons ainsi identifié PRA1 mais nous n’avons pas pu confirmer l'interaction entre les deux protéines par "GST-pulldown assay". Pour tenter de comprendre le rôle de cette interaction, nous avons réalisé des essais fonctionnels en transfectant des cellules pour évaluer l'implication de PRA1 sur la synthèse d’AMPc. Ces expériences ne nous ont pas permis de montrer un rôle pour PRA1 au niveau de la cascade, mais en revanche, nous avons mis en évidence le fait que la co-transfection de deux ADNc codant pour des protéines membranaires sature la machinerie de traduction et diminue l'expression du RTSH. <p>Dans une deuxième partie de notre travail, nous avons étudié la 5-phosphatase SHIP2, dont l’implication dans la cascade de réponse à l’insuline était suggérée, entre autres, par le travail d’Isabelle Vandenbroere qui avait montré l’interaction de cette protéine avec CAP et c-Cbl. Nous avons développé au laboratoire la culture de la lignée pré-adipocytaire 3T3-L1 et étudié la localisation de SHIP2 au niveau des rafts de ces cellules. Nous avons montré que SHIP2 n’y est pas recrutée. CAP et c-Cbl ne semblent pas non plus y être recrutées, tandis que nous y avons détecté le récepteur de l'insuline. La localisation de différentes protéines impliquées dans la cascade de l'insuline dans les rafts est une question controversée à l’heure actuelle et notre étude montre que l’implication fonctionnelle de SHIP2 dans la cascade de l'insuline n'est probablement pas dépendante des rafts.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) est une reformulation du problème quantique à N corps où l'énergie de l'état fondamental est exprimée sous la forme d'une fonction de la densité électronique. Dans l'approche de Kohn-Sham de la DFT, seule l'énergie dite d'échange-corrélation décrivant la partie non classique de l'interaction électron-électron nécessite d'être approchée comme une fonctionnelle de la densité. Dans le cadre de la thèse nous nous intéressons à une approximation visant à améliorer la précision et qui consiste à combiner de façon rigoureuse une approximation de type " fonctionnelle de la densité " avec un calcul explicite de type " fonction d'onde " à l'aide d'une décomposition de l'interaction électron-électron coulombienne. L'objectif est de disposer de méthodes améliorant la précision de la DFT actuelle avec un effort de calcul restant compétitif. Ce travail de thèse se décompose en trois études distinctes. Une première étude a consisté a étendre l'analyse de la convergence en base à la séparation de portée qui a permit de mettre en évidence une convergence exponentielle pour l'énergie de corrélation MP2 de longue portée. Dans un second temps nous nous sommes intéressés à une approximation auto-cohérente des fonctionnelles double-hybride utilisant la méthode des potentiels-effectifs-optimisés. Finalement la troisième étude propose une analyse de l'approximation adiabatique semi-locale du noyau d'échange et de corrélation de courte portée dans le cadre de la TDDFT avec séparation de portée dans son formalisme de réponse linéaire. / The theory of the functional of the density ( DFT) is a reformulation of the quantum problem in N body where the energy of the fundamental state is expressed under the shape of a function(office) of the electronic density. In the approach of Kohn-Sham of the DFT, only the said energy of exchange-correlation describing the not classic part(party) of the interaction electron-electron requires to be approached as a functional of the density. Within the framework of the thesis(theory) we are interested in an approximation to improve the precision and which consists in combining(organizing) in a rigorous way an approximation of type(chap) " functional of the density " with an explicit calculation of type(chap) " function(office) of wave " by means of a decomposition of the interaction electron-electron coulombienne. The objective is to have methods.