Les interactions entre protéines sont un enjeu majeur en recherche. Hautement spécifiques, elles régulent l'organisation cellulaire, ainsi que les réponses aux stimuli extérieurs ; ce sont des cibles idéales des agents thérapeutiques. Diverses techniques d'étude sont disponibles, mais peu d'entre elles permettent d'analyser simultanément plusieurs interactions. L'objectif de ce travail est d'utiliser le double hybride bactérien pour découvrir de nouveaux partenaires de 2 régulateurs de la prolifération tumorale humaine, p21 et STAT3, et en parallèle pour déterminer la fonction de MtSAP1, impliquée dans la germination et la réponse aux stress abiotiques chez Medicago truncatula. L'analyse des partenaires potentiels de l'oncogène STAT3 et de l'inhibiteur p21 suggère l'existence de nouveaux mécanismes moléculaires de la tumorogenèse auxquels participerait STAT3, et permet d'envisager de nouvelles hypothèses quant au rôle de p21. Un nouveau complexe, p21/prohibitine2, est étudié mais sa fonction reste supposée : il pourrait agir comme corégulateur transcriptionnel et/ou réguler la protéolyse de p21. L'étude du gène MtSAP1 et des partenaires d'interactions suggèrent fortement que MtSAP1 serait induit par l'hypoxie : elle jouerait un rôle considérable dans la détoxification et la tolérance de la plante au stress. Ce travail, appuyé par la littérature, met en évidence un lien fonctionnel entre p21, STAT3 et MtSAP1 au cours de l'hypoxie dans les cellules cancéreuses humaines. La confirmation de cette hypothèse permettrait d'approfondir les mécanismes de protection cellulaire face à l'hypoxie, tant au sein des tumeurs humaines que lors de la tolérance de Medicago truncatula.

La transformation naturelle bactérienne permet aux micro-organismes d'échanger des informations génétiques pour promouvoir leurs réponses adaptatives pour faire face aux changements environnementaux. De l'ADN extracellulaire est incorporé et recombiné au génome de l'hôte. Ce processus augmente la plasticité des bactéries. Chez S. pneumoniae, un pathogène majeur chez l'Homme engendrant des infections pouvant être mortelles, la transformation bactérienne accentue la transmission de gènes de résistance aux antibiotiques. Chez les bactéries à Gram positif, l'opéron comF encode l'expression de deux protéines. L'une est démontrée comme étant essentielle à la transformation, est décrite pour être membranaire. La seconde n'a pas été étudiée. Cependant ces protéines n'ont pas été étudiées d'un point de vue structural ou fonctionnel. Des mutagenèse et le double hybride bactérien ont permis de mettre en évidence que ses protéines sont indispensables pour l'expression de la compétence et interagissent avec de nombreuses protéines du transformasome. De plus, l'expression des deux protéines de manière hétérologue prouve qu'elles sont solubles et forment des oligomères. L'analyse structurale de ComFA, atteste de la conformation atypique de cette helicase trimerique et hexamerique. En outre, l'activité ATPasique simple brin DNA-dépendant de cette protéine est démontrée. Finalement un complexe protéique a été révélé entre ComFA et ComFC dont l'étude microscopique à hautes résolutions prouve l'apparition d'un anneau via l'assemblage de deux hexamères. Ces résultats suggèrent que ComFA est le moteur tirant l'ADN dans la cellule. Quant à ComFC, elle semble aider à la stabilisation de ComFA. / Bacterial natural transformation allows microorganisms to exchange genetic information to promote their adaptive responses to cope with environmental changes. The extracellular DNA is incorporated and recombined with the genome of the host. This phenomenon increases the plasticity of Gram positive and negative bacteria. S. pneumoniae is a major pathogen for humans, which is causing infections that can be deadly. In this specie, bacterial transformation increases the transmission of antibiotic resistance.In Gram-positive bacteria, comF operon encodes the expression of two proteins. One of them, shown to be essential for natural transformation, is expected to be a membrane protein. The second is not described. However, up to now neither protein has been studied from a structural or functional point of view. Mutagenesis technique and double hybrid bacterial assay allowed to show that both proteins are essential for the expression of the competence and interact with many proteins of the transformasome. In addition, heterologous expresion of both proteins have shown their solubility and the formation of oligomers. Structural analysis of ComFA demonstrates the unique conformation of this hexameric and trimeric helicase. Furthermore, the ATPase single stranded DNA-dependent activity of this protein could be detected. Finally, a protein complex is formed between ComFA and ComF, and high-resolution microscopic study proves the occurrence of a ring via a two-hexamers. These results suggest that ComFA is the engine pulling the DNA in the cell. As for ComFC, this protein seems to help stabilizing of ComFA.

Le système de sécrétion de type II (SST2) permet la sécrétion de protéines repliées à travers la membrane externe chez les bactéries à Gram-négatif. Le SST2 est une nano-machine enchâssée dans l’enveloppe bactérienne, proche par sa composition et structure aux systèmes d’assemblage des pili de type IV (PT4) impliqués, entre autres, dans d’adhésion et motilité. Chez Klebsiella oxytoca, la surexpression des gènes pul codant le SST2 permet l’assemblage de pili composées des sous-unités PulG. Ceci suggère qu’en conditions physiologiques l’assemblage d’un pseudopilus périplasmique permet la sécrétion du substrat spécifique du SST2, la pullulanase. Dans ce projet nous avons exploré le mécanisme moléculaire de l’assemblage du pseudopilus en se focalisant sur les interactions de PulG avec les composants du SST2 dans la membrane interne. En utilisant l’approche de double-hybride bactérien, nous avons établi le réseau d’interactions de PulG avec les pseudopilins mineures PulH, I, J et K et avec la plateforme d’assemblage (PA). Pour valider ces interactions, nous avons combiné des techniques de biochimie (co-purification par affinité, pontage cystéine et chimique) avec des analyses fonctionnelles de sécrétion et de formation du pseudopilus. Nous avons mis en évidence des interactions entre PulG et les protéines de la PA, PulF et PulM, et nous avons analysé en détail l’interface PulG-PulM. Les résultats suggèrent la formation d’un complexe PulK-I-J-H-G dans la membrane interne impliqué dans des étapes précoces de la formation du pseudopilus, à travers les interactions de PulG et PulH avec PulM et PulF. Nos données expérimentales suggèrent un rôle majeur de PulM dans la sécrétion, vraisemblablement durant l’assemblage du SST2 et l’élongation du pseudopilus. Nos travaux collaboratifs mettant en jeu l'analyse par spectroscopie de masse et en dynamique moléculaire in silico révèlent le rôle essentiel des résidus conservés Glu5 et Thr2 de PulG, requis pour l’interaction avec PulM. Ces données suggèrent que Glu5 participe à l'extraction de PulG de la membrane, en neutralisant la charge positive de son peptide N-terminal par des interactions intramoleculaires. Ces résultats permettent d'établir un modèle détaillant les étapes initiales de l’assemblage des pseudopili dans la membrane interne, relevant pour de futures études sur le SST2 et nanomachines homologues. sécrétion de protéinespili de type 4 assemblage de fibres complexes protéiques membranairesinteractions protéine-protéinemicroscopie à immuno-fluorescence simulations en dynamique moléculairedouble-hybride bactérien spectrométrie de masse nanomachines bacteriennes / The type II secretion system (T2SS) drives the translocation of folded, periplasmic proteins across the outer membrane in Gram-negative bacteria. Secretion is carried out by an envelope-spanning nanomachine that is similar to the apparatus that builds type IV pili (T4P), bacterial surface filaments involved in adhesion, motility and other functions. In the Pul T2SS of Klebsiella oxytoca, overexpression of pul genes in plate-grown bacteria allows the assembly of T4P-like surface fibres made of PulG subunits, suggesting that a periplasmic pseudopilus fibre plays a role in the secretion of the type II substrate pullulanase under physiological conditions. In this project, we explored the molecular mechanism of pseudopilus assembly by focusing on the interaction between PulG and the T2SS inner membrane and pseudopili components. The network of interactions of PulG with the minor pseudopilins PulH, I, J and K and the assembly platform (AP) components was established using bacterial two-hybrid analysis. To validate these interactions, we combined biochemical approaches (affinity co-purification, chemical or cysteine cross-linking) with functional assays of secretion and pseudopilus formation. We provide evidence of the interaction between PulG and the AP proteins PulF and PulM, and delve into the PulG-PulM interface. Our results point to the formation of a PulK-I-J-H-G complex in the plasma membrane involved in early steps of fibre assembly, with a determinant role for PulG and PulH interaction with PulM and PulF. We obtained experimental evidence supporting a major role for PulM in pseudopilus assembly and protein secretion, probably by intervening in the assembly of the T2SS apparatus and in pseudopilus elongation. The results of experimental and in silico studies in collaboration with experts in mass spectrometry and molecular dynamics support the essential role of the highly conserved PulG residues Glu5 and Thr2, which participate in PulM binding. In addition, Glu5 probably favours PulG membrane extraction by neutralising its N-terminal positive charge through intra-molecular interaction. These findings shed new light on early membrane events during fibre assembly, and open new and exciting avenues in research on T2SSs and related nanomachines.protein secretiontype 4 pilifibre assemblymembrane protein complexprotein-protein interactionsimmunofluorescence microscopymolecular dynamics simulationsbacterial two-hybrid assaymass spectrometrybacterial nanomachines

Les protéines membranaires représentent environ le tiers des gènes dans les différents génomes séquencés. La prépondérance de ce type de protéines en terme de cibles thérapeutiques (50 % des médicaments) ainsi que leur implication dans beaucoup de phénomènes cellulaires tel que la transduction d'énergie, le transport de nutriments et la signalisation reflètent leur importance. Les interactions entre protéines membranaires jouent un rôle primordial dans leur structure, leurs fonctions et leur assemblage en complexes. La fonction de la plupart des protéines membranaires est liée à l'assemblage de leurs segments transmembranaires TMs dans la bicouche lipidique. Les segments TMs sont des morceaux de séquences majoritairement hydrophobes d'environ 20 résidus adoptant une structure en hélice alpha. En fait, les interactions entre hélices TMs sont essentielles pour le repliement des protéines membranaires et leur organisation dans la membrane. Pour cette raison, des interactions qualitatives entre domaines TMs de différentes protéines bitopiques ont été caractérisé en utilisant le système du double hybride bactérien (BACTH) basé sur une complémentation protéique de type adénylate cyclase. Ce système a révélé des interactions homo- et hétérologues entre des domaines TMs appartenant à deux familles de récepteurs humains, la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique à activité tyrosine kinase (EGFRs) et les Neuropilines. / Many cellular and biochemical processes/activities are actually carried out by the complexome, which is defined as a set of protein complexes. Identification and characterization of the complexome are essential for a comprehensive understanding and global visioning of cell functions since protein-protein interactions are the core of an entire interactomics system of any living cell. Membrane proteins make up to 30% of proteomes in eukaryotes and prokaryotes. They form a major class of proteins that are essentially involved in vital processes including bioenergetics, signal transduction, cell adhesion, catalysis and so on. Thus, they also represent more than 50% of all currently available drug targets. The function of most membrane proteins is inextricably linked to the proper packing and assembly of their transmembrane (TM) segments in the lipid bilayer. So, deciphering the contribution of TM domains interaction in the assembly of protein complexes will help to understand the dynamic assembly of membrane proteins complexes which are most important in cell signaling. For this reason, qualitative interactions between the TM domains of different bitopic proteins have been characterized using the bacterial adenylate cyclase complementation assay (BACTH). This system has been successfully adapted in the lab to study the homo- and heteromeric associations of selected TM sequences, using well characterized interactions as controls. Moreover, BACTH has revealed TM interactions of two major classes of mammalian membrane receptors, the family of epidermal growth factor receptors (EGFRs) which belongs to receptor tyrosine kinases (RTKs) superfamily and the neuropilins.