Les protéines membranaires représentent environ le tiers des gènes dans les différents génomes séquencés. La prépondérance de ce type de protéines en terme de cibles thérapeutiques (50 % des médicaments) ainsi que leur implication dans beaucoup de phénomènes cellulaires tel que la transduction d'énergie, le transport de nutriments et la signalisation reflètent leur importance. Les interactions entre protéines membranaires jouent un rôle primordial dans leur structure, leurs fonctions et leur assemblage en complexes. La fonction de la plupart des protéines membranaires est liée à l'assemblage de leurs segments transmembranaires TMs dans la bicouche lipidique. Les segments TMs sont des morceaux de séquences majoritairement hydrophobes d'environ 20 résidus adoptant une structure en hélice alpha. En fait, les interactions entre hélices TMs sont essentielles pour le repliement des protéines membranaires et leur organisation dans la membrane. Pour cette raison, des interactions qualitatives entre domaines TMs de différentes protéines bitopiques ont été caractérisé en utilisant le système du double hybride bactérien (BACTH) basé sur une complémentation protéique de type adénylate cyclase. Ce système a révélé des interactions homo- et hétérologues entre des domaines TMs appartenant à deux familles de récepteurs humains, la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique à activité tyrosine kinase (EGFRs) et les Neuropilines. / Many cellular and biochemical processes/activities are actually carried out by the complexome, which is defined as a set of protein complexes. Identification and characterization of the complexome are essential for a comprehensive understanding and global visioning of cell functions since protein-protein interactions are the core of an entire interactomics system of any living cell. Membrane proteins make up to 30% of proteomes in eukaryotes and prokaryotes. They form a major class of proteins that are essentially involved in vital processes including bioenergetics, signal transduction, cell adhesion, catalysis and so on. Thus, they also represent more than 50% of all currently available drug targets. The function of most membrane proteins is inextricably linked to the proper packing and assembly of their transmembrane (TM) segments in the lipid bilayer. So, deciphering the contribution of TM domains interaction in the assembly of protein complexes will help to understand the dynamic assembly of membrane proteins complexes which are most important in cell signaling. For this reason, qualitative interactions between the TM domains of different bitopic proteins have been characterized using the bacterial adenylate cyclase complementation assay (BACTH). This system has been successfully adapted in the lab to study the homo- and heteromeric associations of selected TM sequences, using well characterized interactions as controls. Moreover, BACTH has revealed TM interactions of two major classes of mammalian membrane receptors, the family of epidermal growth factor receptors (EGFRs) which belongs to receptor tyrosine kinases (RTKs) superfamily and the neuropilins.

Le facteur ULTRAPETALA1 (ULT1) est impliqué dans plusieurs processus développementaux chez Arabidopsis thaliana, dont le maintien de l'homéostasie des méristèmes aériens et la morphogénèse florale. ULT1 est en particulier essentiel à la restriction du territoire d'expression de WUSCHEL (WUS), acteur central du maintien de l'identité des cellules souches. ULT1 est également déterminant dans l'activation spatio-temporelle d'AGAMOUS (AG), gène clé du développement floral, nécessaire à la croissance déterminée de la fleur. Néanmoins les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement d'ULT1 n'ont pas tous été élucidés, notamment la nature de ses partenaires protéiques lui assurant sa spécificité de liaison à l'ADN. Les objectifs du travail de thèse ont été (i) d'identifier de nouveaux interacteurs d'ULT1 et (ii) de caractériser la fonction moléculaire et développementale de l'un d'entre-eux. Par des approches génétique, moléculaire et biochimique, nous avons identifié le répresseur transcriptionnel ULT1 INTERACTING FACTOR 1 (UIF1) et caractérisé sa fonction dans le contrôle de l'activité du méristème floral chez Arabidopsis thaliana. UIF1 est en particulier capable de lier spécifiquement une séquence promotrice du gène WUS. Par cette étude nous apportons un mécanisme pour la reconnaissance spécifique de ses cibles par ULT1. Par une approche gènes candidats, nous avons identifié de nouveaux interacteurs d'ULT1, pouvant expliquer (i) son effet sur le retrait de marques chromatiniennes maintenant un locus inactif (interaction avec la déméthylase RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6); (ii) sa fonction trithorax activatrice (interaction avec ARABIDOPSIS TRITHORAX LIKE I); et enfin (III) son rôle dans l'initiation de la transcription de gènes cibles (interaction avec le domaine C-terminal de l'ARN Polymérase II). Ces données positionnent ULT1 à l'interface entre dé-répression chromatinienne et initiation transcriptionnelle. / The ULTRAPETALA1 (ULT1) factor is involved in several developmental processes during Arabidopsis thaliana life cycle such as the homeostasis maintenance at aerial meristems and floral morphogenesis. In particular, ULT1 is critical to the restriction of the expression territory of WUSCHEL (WUS), a central player in stem cell maintenance. ULT1 is also essential for the spatio-temporal activation of AGAMOUS (AG), a key floral developmental gene necessary to flower determinate growth. Nevertheless, the molecular mechanisms through which ULT1 functions haven't all been solved yet, including the nature of its protein partners assuring its binding specificity to DNA targets. The objectives of this thesis were (i) to identify new ULT1 interactors and (ii) to characterize the molecular and developmental function of one of them. By genetic, molecular and biochemical approaches, we identified the ULT1 INTERACTING FACTOR 1 (UIF1) transcriptional repressor and characterized its function in the control of floral meristem activity in Arabidopsis thaliana. In particular, UIF1 is able to specifically bind a promoter sequence in the WUS gene. With this study we provide a mechanism for specific recognition of target genes by ULT1. By a candidate gene approach, we identified novel ULT1 partners, which may explain (i) ULT1 effect on removal of chromatin repressive marks that maintain a locus in an inactive state (interaction with the demethylase RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6); (ii) the ULT1 activating trithorax function (interaction with ARABIDOPSIS TRITHORAX LIKE I); and finally (iii) ULT1 role in the transcriptional initiation of target genes (interaction with the C-terminal domain of RNA Polymerase II). This dataset reveals a function for ULT1 at the interplay between chromatin de-repression and transcriptional initiation.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation. / G protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors involved in signal transduction. Traditionally, signal transduction by GPCRs involves the activation of a hetero-trimeric G protein which will then modulate the activity of several intracellular effectors. We can now appreciate the fact that in addition to their interaction with G proteins, GPCRs also associate with several other proteins, in order to allow proper signal transduction. In particular, the discovery of a family of proteins called receptor activity-modifying proteins (RAMPs) has challenged the traditional views of signal transduction by some GPCRs. In the case of the calcitonin-like receptor (CLR), the association with RAMPs allows the proper cell surface targeting of the receptor in addition to modulate it’s pharmacological properties. Co-expression of CLR with RAMP1 leads to a calcitonin gene-related peptide (CGRP) receptor, whereas CLR association with RAMP2 or RAMP3 promotes the formation of an adrenomedullin receptor. In addition to their interaction with transmembrane accessory proteins such as RAMPs, GPCRs can also interact with other receptors to form receptors oligomers. In this thesis, we were interested in the interactions between GPCRs and RAMPs, and particularly, in the link between these GPCR/RAMP interactions and the assembly of receptor oligomers, using CGRP1 receptor as a model. We first confirmed the interaction between CLR and RAMP1 in living cells. We showed that this CLR/RAMP1 complex activates G proteins and recruits the signalling protein -arrestin upon CGRP stimulation. Next, we demonstrated that even if the CLR requires hetero-oligomeric assembly with RAMPs in order to be active, this receptor can still interact with other GPCRs. In addition to CLR homo-oligomers, we observed that RAMPs can also self-associate to form oligomeric complexes which can involve different subtypes (RAMP1/RAMP2 and RAMP1/RAMP3). This observation of the presence of CLR and RAMP1 homo-oligomers raised the question of the stoiechiometry of interaction of the CLR/RAMP1 complex. In order to establish the molecular composition of the CGRP1 receptor in vivo, we developed a novel approach allowing the detection of the interaction between three proteins in living cells. This method called BRET/BiFC is based on the bioluminescence resonance energy transfer between a luminescent energy donor, Renilla luciferase, and a fluorescent energy acceptor, the yellow fluorescent protein (YFP), reconstituted after the re-association of its two fragments. Using this approach, we showed that the CGRP1 receptor consist of a homo-oligomer of CLR interacting with a monomer of RAMP1. By demonstrating the asymmetrical organization of the CGRP1 receptor complex using a novel biophysical approach, we believe that the results presented herein have contributed to increase our knowledge of the mechanisms of function of the large family of GPCRs and will be useful for the pursuit of research on protein complexes involved in signalling pathways.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation. / G protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors involved in signal transduction. Traditionally, signal transduction by GPCRs involves the activation of a hetero-trimeric G protein which will then modulate the activity of several intracellular effectors. We can now appreciate the fact that in addition to their interaction with G proteins, GPCRs also associate with several other proteins, in order to allow proper signal transduction. In particular, the discovery of a family of proteins called receptor activity-modifying proteins (RAMPs) has challenged the traditional views of signal transduction by some GPCRs. In the case of the calcitonin-like receptor (CLR), the association with RAMPs allows the proper cell surface targeting of the receptor in addition to modulate it’s pharmacological properties. Co-expression of CLR with RAMP1 leads to a calcitonin gene-related peptide (CGRP) receptor, whereas CLR association with RAMP2 or RAMP3 promotes the formation of an adrenomedullin receptor. In addition to their interaction with transmembrane accessory proteins such as RAMPs, GPCRs can also interact with other receptors to form receptors oligomers. In this thesis, we were interested in the interactions between GPCRs and RAMPs, and particularly, in the link between these GPCR/RAMP interactions and the assembly of receptor oligomers, using CGRP1 receptor as a model. We first confirmed the interaction between CLR and RAMP1 in living cells. We showed that this CLR/RAMP1 complex activates G proteins and recruits the signalling protein -arrestin upon CGRP stimulation. Next, we demonstrated that even if the CLR requires hetero-oligomeric assembly with RAMPs in order to be active, this receptor can still interact with other GPCRs. In addition to CLR homo-oligomers, we observed that RAMPs can also self-associate to form oligomeric complexes which can involve different subtypes (RAMP1/RAMP2 and RAMP1/RAMP3). This observation of the presence of CLR and RAMP1 homo-oligomers raised the question of the stoiechiometry of interaction of the CLR/RAMP1 complex. In order to establish the molecular composition of the CGRP1 receptor in vivo, we developed a novel approach allowing the detection of the interaction between three proteins in living cells. This method called BRET/BiFC is based on the bioluminescence resonance energy transfer between a luminescent energy donor, Renilla luciferase, and a fluorescent energy acceptor, the yellow fluorescent protein (YFP), reconstituted after the re-association of its two fragments. Using this approach, we showed that the CGRP1 receptor consist of a homo-oligomer of CLR interacting with a monomer of RAMP1. By demonstrating the asymmetrical organization of the CGRP1 receptor complex using a novel biophysical approach, we believe that the results presented herein have contributed to increase our knowledge of the mechanisms of function of the large family of GPCRs and will be useful for the pursuit of research on protein complexes involved in signalling pathways.